絲瓜離體再生體系的建立

黃麗芳 劉建汀 王彬

摘 要：以絲瓜種子、子葉為試驗(yàn)材料，研究不同消毒處理、不同苗齡期、不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及濃度對(duì)絲瓜子葉再生體系的影響。結(jié)果表明：酒精消毒40 s、0.1%升汞消毒10 min組合為最佳的種子消毒組合，種子污染率5.56%，種子出芽率94.44%;選擇7 d左右微展、顏色綠色的子葉為最佳外植體，最適宜的誘芽培養(yǎng)基為MS+2.0 mg·L-16BA+30 mg·L-1蔗糖+6 g·L-1瓊脂粉，誘導(dǎo)率可達(dá)64%以上，最適宜的不定芽增殖培養(yǎng)基為MS+2.0 mg·L-16BA+4 mg·L-1 AgNO3，增殖系數(shù)3.27，增殖的植株健壯，長(zhǎng)勢(shì)良好。在絲瓜外植體生根誘導(dǎo)過程中，生根培養(yǎng)基采用1/2MS，生根率可達(dá)100%，生根培養(yǎng)3～4周直至主根長(zhǎng)到5 cm以上，瓜苗長(zhǎng)勢(shì)好;后期移植，栽培基質(zhì)以泥炭土∶珍珠巖=5∶1為宜，栽培成功率可達(dá)95%以上。

關(guān)鍵詞：絲瓜;子葉;組織培養(yǎng);再生體系

Abstract：By using the seed and cotyledon of loofah as experimental materials， the effects of different disinfection treatments， different seedling ages， different types and concentrations of plant growth regulator on the regeneration system of loofah cotyledon were studied. The results showed that the combination of disinfection with alcohol for 40 s and disinfection with 0.1% mercuric chloride for 10 min was the best combination for seed disinfection， with the seed contamination rate of 5.56% and seed bud ratio of 94.44%. The green cotyledons slightly spread at about 7 days were selected as the best explants， and the most appropriate bud inducing medium was MS+2.0 mg·L-1 6BA+30 mg·L-1 sucrose and 6 g·L-1 agar powder， with an induction rate of over 64%. The optimal culture medium for adventitious bud proliferation was MS+2.0 mg·L-1 6BA+4 mg·L-1 AgNO3， and the proliferation coefficient was 3.27. The proliferating plants were healthy and growing well. During the root induction of loofah explants， 1/2 MS was used as the rooting medium， and the rooting rate was up to 100%. The root was cultured for 3- 4 weeks until the main root grew to more than 5 cm， and the melon seedlings grew well. In the later transplanting， the suitable culture medium was the ratio between peat soil and perlite of 5∶1， and the success rate of cultivation could reach above 95%.

Key words：Loofah; Cotyledon; Tissue culture; Regeneration system

絲瓜Luffa cylindrica原產(chǎn)東印度，主要分布于熱帶、亞熱帶的亞洲各地，中國(guó)南、北各地栽培較為普遍，是我國(guó)主要的瓜類蔬菜。絲瓜風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富，具有很好的醫(yī)療保健功能，有清涼、利尿、活血、通經(jīng)、解毒之功效。隨著人們對(duì)飲食營(yíng)養(yǎng)保健的日益重視，絲瓜作為一種藥食兼用的高溫季節(jié)市場(chǎng)供應(yīng)的蔬菜，深受人們的喜愛，其需求量不斷地增加，栽培面積正呈現(xiàn)日益擴(kuò)大，并且蘊(yùn)含著巨大的市場(chǎng)前景。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)目前已經(jīng)成功應(yīng)用于甜瓜[1-2 ]、南瓜[3-5]、黃瓜[6 -7]等瓜類作物，一般都是利用子葉[8-9]與幼胚[10-11]作為外植體。國(guó)內(nèi)對(duì)于絲瓜組培上的報(bào)道還比較少，本研究以絲瓜子葉為試驗(yàn)外植體，研究了不同消毒方法、不同苗齡、不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及濃度對(duì)絲瓜子葉再生體系的影響，篩選出適宜的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合，旨在為今后絲瓜育種深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試材由福建農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究中心蔬菜育種科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同消毒處理對(duì)絲瓜種子發(fā)芽的影響 選籽粒飽滿、無病蟲害、大小一致的種子，用水連續(xù)沖洗0.5 h。然后轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)上處理，將洗凈的種子按照表1的組合方式進(jìn)行消毒滅菌，每次使用1種滅菌劑處理后均用無菌水沖洗3～4次，再接入到MS培養(yǎng)基上進(jìn)行播種，光周期16 h·d-1。每個(gè)處理的種子數(shù)為30粒，每天觀察污染以及發(fā)芽情況并統(tǒng)計(jì)。計(jì)算公式如下：

1.2.2 不同植物生長(zhǎng)素濃度配比對(duì)絲瓜不定芽誘導(dǎo)的影響 催芽播種后長(zhǎng)出的無菌苗取3種苗齡期的子葉：子葉閉合期、子葉變綠微展期以及子葉完全展開期。分別取不同時(shí)期子葉，切除葉子邊緣，橫切一分為二，去除遠(yuǎn)胚軸端，近胚軸端分別取靠近子葉節(jié)和胚根的部位，每段約0.5 cm，將制備好的子葉節(jié)及子葉按生物學(xué)體位平放到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（表2），置于室溫（25±2）℃、光周期為16 h·d-1 的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。芽誘導(dǎo)率計(jì)算公式為：

芽誘導(dǎo)率（%）=子葉萌發(fā)的不定芽/接種數(shù)×100

1.2.3 不同植物生長(zhǎng)素濃度組合對(duì)絲瓜不定芽誘導(dǎo)的影響 將子葉節(jié)上的不定芽分離切取下來，去除芽基部的愈傷組織，切除不定根，接入含有不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和濃度的增殖培養(yǎng)基中（表3），每個(gè)處理接種量為30株，重復(fù)3次。通過后期觀察記錄，計(jì)算增殖系數(shù)。增殖系數(shù)的計(jì)算方法為：增殖系數(shù)=新芽數(shù)/接種數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用IBM SPSS Stastistic 21軟件的SNK多重比較進(jìn)行雙因素方差分析和差異顯著性分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理對(duì)絲瓜種子發(fā)芽的影響

從表4可以看出，T1、T3、T4處理的種子污染率存在顯著差異，T6、T7、T8、T9處理的種子污染率沒有顯著差異，且種子污染率為0。在種子發(fā)芽率方面，T3、T5、T6、T7處理存在顯著差異，T1、T8、T9處理的種子發(fā)芽率為0。種子發(fā)芽率最高的是T4和T5處理，二者的發(fā)芽率都在90%以上，顯著高于其他的幾個(gè)消毒處理。種子污染率T1和T2處理最高，T1處理直接達(dá)到100%，由此表明，絲瓜種子的污染率和成活率與酒精和0.1%升汞的處理時(shí)間存在一定相關(guān)性。采用酒精消毒30 s的種子污染率最高，雖然隨著0.1%升汞消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，種子污染率微微下降，但數(shù)值還是偏高，沒有起到消毒的目的。酒精消毒時(shí)間40 s時(shí)，種子污染率顯著下降，直至種子污染率為0，而種子發(fā)芽率隨著升汞消毒時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。酒精消毒50 s，雖然種子污染率為0，但是種子發(fā)芽率也幾乎為0。

綜上所述，酒精和0.1%升汞的處理時(shí)間對(duì)芽的誘導(dǎo)成活率影響很大，酒精消毒時(shí)間過低，污染率太高，而消毒時(shí)間太長(zhǎng)，又降低種子的活性，芽成活率太低。酒精消毒40 s、升汞消毒10 min組合為最佳的種子消毒組合。

2.2 不同植物生長(zhǎng)素濃度組合對(duì)絲瓜不定芽誘導(dǎo)的影響

選取不同苗齡期的子葉接種于誘芽培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)選擇微展期且已經(jīng)轉(zhuǎn)綠時(shí)期的子葉作為外植體，在接種后的第6 d就明顯增大變厚，之后開始產(chǎn)生愈傷，1周后在卷起的葉邊緣可見綠色或黃色的小突起，即是芽點(diǎn)，誘芽率最高。所以選取這個(gè)時(shí)期的時(shí)期，后續(xù)的試驗(yàn)都是選這個(gè)時(shí)期的子葉作為外植體。

誘芽培養(yǎng)基選擇不同濃度的6BA和NAA配比來篩選出最佳誘芽培養(yǎng)基組合。將切除邊緣的子葉平放在培養(yǎng)基上，3 d明顯膨大，葉片增厚，部分邊緣黃化，子葉變形、變脆，易于折斷。從表5可以看出不同濃度配比的6BA+NAA組合對(duì)外植體的出愈率和出芽率存在顯著性差異，M4組合的出愈率和出芽率分別為94.29%和64.51%，出愈率最高，出芽率最高，生長(zhǎng)速度快，植株健壯;M9組合的出愈率和出芽率最低，分別為1.54%和0;M1組合的愈傷率達(dá)到100%，但出芽率沒有M4組合好，且出芽速度太慢。綜上所述，M4組合為最佳的芽誘導(dǎo)組合。

2.3 不同植物生長(zhǎng)素濃度組合對(duì)不定芽增殖的影響

誘導(dǎo)出的不定芽長(zhǎng)到4 cm以上就可以進(jìn)行增殖試驗(yàn)，把芽從愈傷組織上分離，去除根部帶出的愈傷組織，轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。從表6可以看出，C6組合的增殖系數(shù)與其他8個(gè)組合處理存在顯著性差異，C6組合的增殖系數(shù)為3.27，增殖的植株長(zhǎng)勢(shì)良好，植株健壯。由此表明，不同的植物生長(zhǎng)素濃度組合對(duì)增殖培養(yǎng)有影響。因此，2.0 mg·L-16BA+4 mg·L-1 AgNO3 為增殖系數(shù)最高，培養(yǎng)的小苗長(zhǎng)勢(shì)健壯。

3 討論

本試驗(yàn)研究了不同消毒組合對(duì)外植體發(fā)芽的影響，結(jié)果表明75%酒精消毒40 s、0.1%升汞消毒10 min組合為最佳的絲瓜種子消毒處理，污染率5.56%，出芽率94.44%，既保證了外植體的活性，又保證了出芽率。消毒方法在前人的方法上稍微改進(jìn)[12-14]，通過研究得出：外植體的活性受酒精消毒的影響較大，相同酒精消毒時(shí)間下，外植體活性隨著升汞消毒的時(shí)間延長(zhǎng)變化不大;但相同的升汞消毒時(shí)間下，隨著酒精消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，活性斷崖下降。75%酒精通過滲透壓來殺菌消毒，其滲透壓可滲入細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)部，同樣也對(duì)外植體的植物細(xì)胞影響巨大，導(dǎo)致植物細(xì)胞脫水而死。由此可見，酒精消毒時(shí)間的選擇更為關(guān)鍵。選擇未轉(zhuǎn)綠的子葉做外植體，雖然會(huì)膨大，但基本不轉(zhuǎn)綠且不長(zhǎng)愈傷，很難分化出苗。原因可能是還未分化出葉綠素，自身修復(fù)能力較差，試驗(yàn)處理對(duì)其自身的新陳代謝會(huì)產(chǎn)生影響。而微展期、剛轉(zhuǎn)綠的苗細(xì)胞新陳代謝快，更容易分化出苗[15-17]。

MS培養(yǎng)基被廣泛應(yīng)用于瓜類植物的再生體系中，不同的瓜類品種遺傳轉(zhuǎn)化再生體系中生長(zhǎng)素濃度的不同決定其愈傷誘導(dǎo)、不定芽誘導(dǎo)、增殖誘導(dǎo)以及生根等各誘導(dǎo)培養(yǎng)基的不同配比組合。張娜[18]研究西瓜子葉高效再生體系，發(fā)現(xiàn)MS+1.0 mg·L-1 6BA+0.1 mg·L-1 NAA作為不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)率可達(dá)88.33%。張若瑋等[19]研究不同基因型黃瓜再生體系，發(fā)現(xiàn)不同基因型再生頻率差異較大，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的選擇基本上都在6BA、NAA、AgNO3及ABA，在MS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上增加1.5 mg·L-16BA+2 mg·L-1ABA+2 mg·L-1AgNO3誘導(dǎo)率高達(dá)97%，增殖系數(shù)平均為5.2，6BA為不定芽誘導(dǎo)及促進(jìn)伸長(zhǎng)所需的必備植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。在本試驗(yàn)中，絲瓜的不定芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+2.0 mg·L-1 6BA+30 mg·L-1蔗糖+6 g·L-1瓊脂粉，出愈率可達(dá)94.29%，誘導(dǎo)率可達(dá)80%以上。

適宜的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及濃度是增殖試驗(yàn)的關(guān)鍵。6BA不僅有利于芽的伸長(zhǎng)，也有利于增殖。在增殖試驗(yàn)中，低濃度的6BA有利于增殖，而高濃度對(duì)芽增殖有抑制作用，并且在離體培養(yǎng)過程中，外植體會(huì)釋放出不利于增殖的乙烯，使外植體褐化、玻璃化，這時(shí)候添加的低濃度AgNO3可緩解這一現(xiàn)象[20-21]。試驗(yàn)結(jié)果表明，最有利于不定芽增殖的培養(yǎng)基為MS+2.0 mg·L-16BA+4 mg·L-1AgNO3，增殖系數(shù)3.27，增殖的植株健壯，長(zhǎng)勢(shì)良好。在生根誘導(dǎo)過程中，最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS，生根率可達(dá)100%，生根培養(yǎng)3～4周直至主根長(zhǎng)到5 cm以上，瓜苗長(zhǎng)勢(shì)好;后期移植，栽培基質(zhì)以泥炭土∶珍珠巖=5∶1為宜，栽培成功率可達(dá)95%以上。針對(duì)不同基因型的絲瓜，所選取的外植體類型、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、接種方式可能會(huì)稍有不同，因此尋找合適的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比、探索建立高效的遺傳轉(zhuǎn)化再生體系，是今后工作的重點(diǎn)。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）