白藜蘆醇對缺氧缺血性腦損傷模型新生大鼠認(rèn)知功能及SIRT1/NF—κB信號通路的影響

陳靈 張相林 柳芳 周漢明

摘 要 目的：研究白藜蘆醇對缺氧缺血性腦損傷模型新生大鼠認(rèn)知功能及沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）/核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF- κB）信號通路的影響。方法：將SD新生大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）和白藜蘆醇低、高劑量組（30、60 mg/kg），每組12只，假手術(shù)組大鼠行假手術(shù)，其余各組大鼠采用Rice法建立缺氧缺血性腦損傷模型，建模成功后，各組大鼠每天腹腔注射相應(yīng)藥物，連續(xù)給藥6周。采用水迷宮實驗分析各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能，記錄給藥1、3、6周后的逃避潛伏期和給藥6周后的穿臺次數(shù)。采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法觀察各組大鼠給藥6周后的腦組織梗死面積，Western blot方法檢測海馬組織CA1區(qū)內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）及其相關(guān)X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）表達(dá)和SIRT1/NF-κB通路相關(guān)蛋白SIRT1、磷酸化NF-κB（p-NF-κB）表達(dá)。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠給藥1、3、6周后的逃避潛伏期明顯延長（P<0.05），給藥6周后的穿臺次數(shù)明顯減少（P<0.05），腦組織梗死面積明顯增加（P<0.05），海馬組織CA1區(qū)內(nèi)Bax、Caspase-3、p-NF-κB蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，Bcl-2、SIRT1蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）。與模型組比較，白藜蘆醇低、高劑量組大鼠給藥1、3、6周后的逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05），給藥6周后的穿臺次數(shù)明顯增加（P<0.05），腦組織梗死面積明顯減?。≒<0.05），海馬組織CA1區(qū)內(nèi)Bax、Caspase-3、p-NF-κB蛋白表達(dá)明顯降低，Bcl-2、SIRT1蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P<0.05），且高劑量組大鼠上述指標(biāo)的改善效果明顯優(yōu)于低劑量組（P<0.05）。結(jié)論：白藜蘆醇可改善缺氧缺血性腦損傷模型新生大鼠認(rèn)知功能障礙，其可能與SIRT1/NF-κB信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 缺氧缺血性腦損傷；白藜蘆醇；沉默信息調(diào)節(jié)因子1；核轉(zhuǎn)錄因子κB；認(rèn)知功能；新生大鼠

Effects of Resveratrol on Cognitive Function and SIRT1/NF-κB Signaling Pathway in Neonatal Rats with Hypoxic-ischemic Brain Injury

CHEN Ling1，2，ZHANG Xianglin2，LIU Fang2，ZHOU Hanming1（1.Dept. of Pharmacy， Tongren Hospital of Wuhan University/Wuhan Third Hospital， Wuhan 430060， China；2.Dept. of Pharmacy， China-Japan Friendship Hospital， Beijing 100029， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of resveratrol （Res） on cognitive function and SIRT1/NF-κB signaling pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury. METHODS： SD neonatal rats were randomly divided into sham operation group （normal saline）， model group （normal saline）， Res low-dose and high-dose groups （30， 60 mg/kg）， with 12 rats in each group. Except that sham operation group received sham operation， hypoxic-ischemic brain injury model was established by Rice method in other groups. After modeling， the rats were given relevant medicine intraperitoneally each day， for consecutive 6 weeks. Water maze test was used to analyze spatial learning and memory function of rats in each group. The escape latency after 1， 3 and 6 weeks of administration and the times of crossing platform after 6 weeks of administration were recorded. TTC staining was used to detect cerebral infraction area of rats after 6 weeks of medication. Western blot was used to detect the expression of Bcl-2， Bax， Caspase-3， SIRT1， SIRT1/NF-κB pathway related protein SIRT1 and p-NF-κB in hippocampal CA1 region. RESULTS： Compared with sham operation group， escape latency of rats was prolonged significantly in model group after 1， 3， 6 weeks of medication （P<0.05）， the times of crossing platform was decreased significantly after 6 weeks of medication （P<0.05）； the area of cerebral infarction was increased significantly （P<0.05）； the protein expression of Bax， Caspase-3 and p-NF-κB in hippocampus CA1 region were increased significantly， while the protein expression of Bcl-2 and SIRT1 were decreased significantly （P<0.05）. Compared with model group， the escape latency of Res low-dose and high-dose groups were shortened significantly after 1， 3， 6 weeks of medication （P<0.05）， while the times of crossing platform was increased significantly after 6 weeks of medication （P<0.05）； the area of cerebral infarction was decreased significantly （P<0.05）， and the protein expression of Bax， Caspase-3 and p-NF-κB protein in hippocampal CA1 area were decreased significantly， while the protein expression of Bcl-2 and SIRT1 were increased significantly （P<0.05）. The improvement of above indexes in high-dose group were significantly better than low-dose group （P<0.05）. CONCLUSIONS： Res can improve cognitive dysfunction in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury， which is related with SIRT1/NF-κB signaling pathway.

KEYWORDS Hypoxic-ischemic brain injury； Resveratrol； SIRT1； NF-κB； Cognitive function； Neonatal rat

缺氧缺血性腦損傷（Hypoxic-ischemic brain injury，HIBI）為新生兒死亡和出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙的主要因素[1]，目前無很好的治療方法。早期流行病學(xué)報道，發(fā)達(dá)國家HIBI發(fā)病率為0.1%～0.8%，而發(fā)展中國家為2.6%[2]。中國地區(qū)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)每年約4.5萬名新生兒出現(xiàn)HIBI[3]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)HIBI患兒中有1.5%～2.5%出現(xiàn)死亡，另外超過2.5%的患兒出現(xiàn)永久性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，比如腦癱、癲癇、認(rèn)知功能障礙或視覺障礙等[4]。當(dāng)下，亞低溫是有效治療HIBI的手段，但是該方法僅僅對足月中重度患兒有效，治療時間窗非常短，而且還會有一半的患兒出現(xiàn)后遺癥[5]。已有研究證實，細(xì)胞凋亡、氧化損傷、神經(jīng)毒性等都可以引起神經(jīng)元死亡進(jìn)而促使認(rèn)知功能障礙[6]。其中，細(xì)胞凋亡為HIBI中神經(jīng)元壞死的主要方式，該過程由相關(guān)信號傳導(dǎo)及凋亡蛋白共同參與介導(dǎo)[7]。于是，尋找抗神經(jīng)元凋亡藥物成為治療恢復(fù)HIBI后認(rèn)知功能的研究熱點。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）廣泛表達(dá)于海馬神經(jīng)元細(xì)胞，SIRT1活化能夠降低核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）炎性信號傳導(dǎo)，起著抗神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的作用[8]。白藜蘆醇（Resveratrol）表現(xiàn)出廣泛的藥理活性，其中在抗氧化、抗細(xì)胞凋亡、抗炎癥等方面效果顯著，并且對認(rèn)知功能也有著較好的改善作用[9]。白藜蘆醇可抑制缺血缺氧導(dǎo)致的新生大鼠神經(jīng)元凋亡，可改善糖尿病大鼠空間認(rèn)知功能的損害，其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制可能與抑制凋亡途徑和抗炎作用密切相關(guān)[10]。因此，本實驗研究了白藜蘆醇對HIBI模型新生大鼠認(rèn)知功能的影響，并研究了其對SIRT1/NF-κB信號通路的影響，以期為白藜蘆醇的臨床應(yīng)用提供實驗參考。

1 材料

1.1 儀器

XR-XM101型Morris水迷宮（江蘇賽昂斯生物公司）；i Mark型酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）；GX-2020M-E型凝膠成像系統(tǒng)（美國Syngene公司）。

1.2 藥品與試劑

白藜蘆醇原料藥（批號：13-627，純度：≥98%）和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑（ECL，批號：SY-126-30）均購自美國Sigma公司；兔抗鼠B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）及其相關(guān)X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）、NF-κB、磷酸化NF- κB（p-NF-κB）、SIRT1、β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（英國Abcam公司，批號：ab9023124、ab1023652、ab6302147、ab3320145、ab1325047、ab1852102、ab2201234）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（上海谷歌生物有限公司，批號：SY-109840）。

1.3 動物

新生1周SD大鼠48只，SPF級，♂，體質(zhì)量為（12.8±1.6） g，購自北京維通利華動物實驗中心，實驗動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（京）2018-0001。本動物實驗經(jīng)過武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院（武漢市第三醫(yī)院）倫理委員會批準(zhǔn)。

2 方法

2.1 分組與給藥

將48只大鼠隨機(jī)分為4組，每組12只，包括假手術(shù)組、模型組和白藜蘆醇低、高劑量組。除假手術(shù)組大鼠行假手術(shù)（即頸部切口后，立即縫合）外，其余各組大鼠采用Rice法[11]復(fù)制HIBI模型，大鼠吸入乙醚麻醉后，在中位頸部切口，分離左頸總動脈，結(jié)扎血管，并立即縫合傷口；2 h恢復(fù)期后，把大鼠安置于37 ℃水浴密閉缺氧環(huán)境中，給予混合氣體（8%氧氣+92%氮?dú)猓┻M(jìn)行缺氧處理25 h。造模完成后，白藜蘆醇低、高劑量組大鼠每天腹腔注射白藜蘆醇1次，給藥劑量分別為30、60 mg/kg[12]，給藥體積均為50 μL，假手術(shù)組和模型組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水，連續(xù)給藥6周。

2.2 認(rèn)知功能檢測

給藥1、3、6周時，使用Morris水迷宮，每組隨機(jī)抽取6只大鼠行定位航行實驗，分別從4個象限的池壁中點將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠在2 min內(nèi)從入水到登上平臺的時間即為逃避潛伏期，倘若大鼠在2 min內(nèi)沒有登上平臺，則由實驗員將其引導(dǎo)至平臺休息30 s，記錄逃避潛伏期為2 min。末次定位航行實驗結(jié)束后把平臺撤離進(jìn)行空間探索實驗，將大鼠由4 個象限的原入水點面向池壁放入水中，記錄各個象限2 min內(nèi)大鼠穿越原來平臺所在位置的次數(shù)。

2.3 腦組織梗死面積檢測

空間探索實驗結(jié)束后，每組處死6只大鼠，取出腦組織，置于4 ℃的磷酸鹽緩沖液（PBS）中冷卻5 min，沿冠狀面切片。采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法，將切片浸入以PBS制備的2%TTC溶液中，室溫孵育30 min，PBS清洗2遍，再用4 ℃福爾馬林溶液避光固定后拍攝圖像。采用Image J 1.8.0軟件測量切片圖像的梗死面積。

2.4 海馬組織CA1區(qū)凋亡相關(guān)蛋白及SIRT1/NF-κB信號通路蛋白檢測

空間探索實驗結(jié)束后，麻醉各組剩余的6只大鼠，分離出海馬CA1區(qū)組織，碾碎后加入RIPA裂解液在冰上充分裂解組織30 min，在4 ℃、12 000 r/min離心15 min，然后吸取上清測蛋白濃度。組織勻漿采用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）4 h（電壓為45 V），隨后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，置于兔抗鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3、NF-κB、p-NF-κB、SIRT1、β-actin單克隆抗體溶液中（稀釋比例1 ∶ 1 000），4 ℃反應(yīng)過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，然后室溫條件下孵育HRP羊抗兔IgG二抗（稀釋比例1 ∶ 3 000）1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL顯色后，成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光顯影，Image J 1.8.0軟件分析蛋白灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參（β-actin）灰度值的比值進(jìn)行評價。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗結(jié)果采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析。多組間比較采用方差分析，組間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 認(rèn)知功能

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠給藥1、3、6周時的逃避潛伏期明顯延長（P<0.05），穿臺次數(shù)明顯減少（P<0.05）。與模型組比較，白藜蘆醇低、高劑量組大鼠給藥1、3、6周時的逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05），穿臺次數(shù)明顯增加（P<0.05）。與白藜蘆醇低劑量組比較，白藜蘆醇高劑量組大鼠給藥1、3、6周時的逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05），穿臺次數(shù)明顯增加（P<0.05）。各組大鼠的逃避潛伏期和穿臺次數(shù)比較見表1。

3.2 腦組織梗死面積

TTC染色發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠腦組織沒有發(fā)生梗死現(xiàn)象；模型組大鼠腦組織出現(xiàn)了大片呈白色的梗死區(qū)域；白藜蘆醇低劑量組大鼠腦組織仍有較大區(qū)域呈白色的梗死現(xiàn)象；白藜蘆醇高劑量組大鼠腦組織有極少區(qū)域呈白色的梗死現(xiàn)象。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織梗死面積明顯增加（P<0.05）。與模型組比較，白藜蘆醇低、高劑量組大鼠腦組織梗死面積明顯減?。≒<0.05）。與白藜蘆醇低劑量組比較，白藜蘆醇高劑量組大鼠腦組織梗死面積明顯減?。≒<0.05）。各組大鼠腦組織的TTC染色切片圖見圖1，梗死面積比較見圖2。

3.3 海馬組織CA1區(qū)凋亡蛋白表達(dá)比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織CA1區(qū)中促凋亡蛋白Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P<0.05），而抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）。與模型組比較，白藜蘆醇低、高劑量組大鼠海馬組織CA1區(qū)中Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P<0.05）。與白藜蘆醇低劑量組比較，白藜蘆醇高劑量組大鼠海馬組織CA1區(qū)中Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P<0.05）。各組大鼠海馬組織CA1區(qū)內(nèi)Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)的電泳圖見圖3，蛋白表達(dá)比較見圖4。

3.4 白藜蘆醇對大鼠海馬組織CA1區(qū)SIRT1/NF-κB信號通路的影響

4組大鼠海馬組織CA1區(qū)中NF-κB蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織CA1區(qū)中SIRT1蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05），p-NF-κB蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P<0.05）。與模型組比較，白藜蘆醇低、高劑量組大鼠海馬組織CA1區(qū)中SIRT1蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P<0.05），p-NF-κB蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）。與白藜蘆醇低劑量組比較，白藜蘆醇高劑量組大鼠海馬組織CA1區(qū)中SIRT1蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P<0.05），p-NF-κB蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）。各組大鼠海馬組織CA1區(qū)內(nèi)SIRT1、p-NF-κB蛋白表達(dá)的電泳圖見圖5，蛋白表達(dá)比較見圖6。

4 討論

早期實驗發(fā)現(xiàn)，缺氧缺血能導(dǎo)致新生大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡，而且這一過程出現(xiàn)的時間較長[13]。本文利用經(jīng)典的Rice法構(gòu)建新生大鼠HIBI模型，大腦TTC染色發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腦組織出現(xiàn)明顯的梗死面積，提示實驗造模成功。Western blot結(jié)果提示，模型組大鼠海馬組織CA1區(qū)中促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，而抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯低于假手術(shù)組，說明HIBI能引起海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。早期有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，HIBI對大腦海馬區(qū)影響最明顯，而CA1區(qū)神經(jīng)元功能與機(jī)體認(rèn)知能力有關(guān)，當(dāng)該CA1區(qū)神經(jīng)組織損傷時能導(dǎo)致機(jī)體的學(xué)習(xí)記憶功能明顯減弱[14]。本研究對模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力考察發(fā)現(xiàn)，HIBI能顯著誘導(dǎo)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力減弱，與文獻(xiàn)結(jié)果相同[15]。綜上，HIBI可以誘導(dǎo)大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而促使大鼠空間學(xué)習(xí)記憶力降低。

白藜蘆醇屬于一種天然植物多酚，表現(xiàn)出廣泛的藥理活性。近十年研究報道，白藜蘆醇對大鼠由多種原因引起的認(rèn)知功能障礙具有改善作用。林茂等[16]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以改善阿爾茨海默病小鼠認(rèn)知功能障礙；唐明等[17]研究提示，白藜蘆醇可通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)來緩解大鼠的認(rèn)知障礙；譚宇亭等[18]也發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能通過抑制氧化損傷改善七氟烷暴露所致新生大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力障礙；黃效東等[19]也闡述了白藜蘆醇能有效抑制癲癇發(fā)作及提高大鼠認(rèn)知能力。然而，關(guān)于白藜蘆醇對HIBI模型大鼠認(rèn)知功能障礙的影響尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇低、高劑量組大鼠腦梗死面積明顯小于模型組，說明白藜蘆醇對大鼠腦損傷表現(xiàn)出較好的藥理作用；白藜蘆醇低、高劑量組大鼠的逃避潛伏期比模型組明顯縮短，穿臺次數(shù)明顯增加，說明白藜蘆醇可以在一定程度上提高大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；白藜蘆醇低、高劑量組大鼠海馬組織CA1區(qū)Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)明顯低于模型組，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯強(qiáng)于模型組，說明白藜蘆醇可以減輕神經(jīng)元凋亡。

SIRT1屬于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性去乙?；?，主要分布于大腦海馬區(qū)，SIRT1發(fā)生去乙?；磻?yīng)后會作用于下游NF-κB信號傳導(dǎo)，介導(dǎo)細(xì)胞代謝、增殖、凋亡等多種生物學(xué)效應(yīng)[20-21]。SIRT1/NF-κB信號傳導(dǎo)可參與慢性腦缺血的炎性因子產(chǎn)生，當(dāng)對SIRT1進(jìn)行活性誘導(dǎo)時，可通過抑制NF-κB信號活化，降低細(xì)胞凋亡的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可通過激活SIRT1降低卵巢顆粒細(xì)胞凋亡[22]；還有研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可激活SIRT1信號傳導(dǎo)能抑制腎小球足細(xì)胞表型改變[23]。本研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能誘導(dǎo)SIRT1表達(dá)，抑制NF-κB信號通路活化，提示白藜蘆醇能通過激活SIRT1/NF-κB信號通路改善HIBI引起的大鼠認(rèn)知功能障礙。

本研究初步探討了白藜蘆醇對HIBI模型新生大鼠認(rèn)知功能障礙的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。結(jié)果表明，白藜蘆醇可能通過影響SIRT1信號通路活化，降低海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而發(fā)揮改善缺氧缺血性腦損傷模型新生大鼠認(rèn)知功能障礙的作用。

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（收稿日期：2019-01-30 修回日期：2019-03-13）

（編輯：鄒麗娟）