丁香苦苷固體脂質(zhì)納米粒的制備及表征

張喜武 李秋晗 李英鵬 李永吉 徐坐帝 竇金金

摘 要 目的：制備丁香苦苷固體脂質(zhì)納米粒（SYR-SLN），優(yōu)化處方，并對(duì)其進(jìn)行表征。方法：采用乳化蒸發(fā)法制備SYR-SLN，以包封率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)考察基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)處方中卵磷脂-單甘酯質(zhì)量比、有機(jī)相-水相體積比、泊洛沙姆188（F68）濃度、投藥量進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)處方工藝，考察所制納米粒的包封率、載藥量、形態(tài)、粒徑、Zeta電位、穩(wěn)定性等。結(jié)果：卵磷脂-單甘酯質(zhì)量比為3 ∶ 1，有機(jī)相-水相體積比為1 ∶ 2，F(xiàn)68的濃度為0.4%，投藥量為10 mg，最優(yōu)處方工藝為單甘酯80 mg、卵磷脂240 mg、F68濃度0.4%、SYR 10 mg、無(wú)水乙醇5 mL、蒸餾水10 mL，乳化溫度為65 ℃，攪拌速度為600 r/min。所得SYR-SLN的包封率為（42.35±0.60）%（n=3），載藥量為（5.33±0.03）%（n=3），其外觀圓整，分布均勻，平均粒徑為（180.30±5.31） nm，Zeta電位為 （-41.9±0.8） mV，4 ℃條件下貯存15 d穩(wěn)定性良好。結(jié)論：本方法成功制得SYR-SLN，且處方工藝簡(jiǎn)單，包封率高。

關(guān)鍵詞 丁香苦苷；固體脂質(zhì)納米粒；制備；處方工藝；表征

Preparation and Characterization of Syringopicroside Solid Lipid Nanoparticles

ZHANG Xiwu1，LI Qiuhan1，LI Yingpeng2，LI Yongji3，XU Zuodi1，DOU Jinjin4（1.Academy of TCM， Heilongjiang University of TCM， Harbin 150040， China；2.College of TCM， Tianjin University of TCM， Tianjin 301617， China；3.College of Pharmacy， Heilongjiang University of TCM， Harbin 150040， China；4.College of Clinical Medicine， Heilongjiang University of TCM， Harbin 150040， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare Syringopicroside solid lipid nanoparticles （SYR-SLN）， and optimize the formula and characterize SYR-SLN. METHODS： SYR-SLN were prepared by emulsion evaporation method. Using entrapment efficiency as index， based on single factor， orthogonal design was adopted to optimize the mass ratio of lecithin-monoglyceride， volume ratio of organ phase to water phase， poloxamer 188 （F68） concentration and drug dosage. The optimal formula technology was established to investigate entrapment efficiency， drug-loading amount， morphology， particle size， Zeta potential， stability， etc. RESULTS： The mass ratio of lecithin-monoglyceride was 3 ∶ 1； the volume ratio of organic phase to water phase was 1 ∶ 2； the concentration of F68 was 0.4%； drug dosage was 10 mg. The optimal formula included that monoglyceride 80 mg， lecithin 240 mg， 0.4% F68， syringopicroside 10 mg， absolute ethyl alcohol 5 mL， distilled water 10 mL， emulsification temperature at 65℃ and stirring at 600 r/min. Encapsulation efficiency of SYR-SLN was （42.35±0.60）% （n=3）； drug-loading amount was （5.33±0.03）% （n=3）； SYR-SLN had a spherical morphology and was evenly distributed. The average particle size was （180.30±5.31） nm with Zeta potential of （-41.9±0.8） mV， and the SYR-SLN could maintain stable for 15 days at 4℃. CONCLUSIONS： SYR-SLN is prepared successfully， and the technology is simple with high encapsulation efficiency.

KEYWORDS Syringopicroside； Solid lipid nanoparticle； Preparation； Formula technology； Characterization

丁香苦苷（Syringopicroside，SYR）是從木犀科丁香屬植物紫丁香的干燥葉中提取得到的單體化合物[1]，具有抗病毒、抗菌、抗炎作用[2-3]，有研究表明SYR對(duì)乙型肝炎病毒作用顯著[4-5]。由于SYR屬于環(huán)烯醚萜苷類化合物，在體內(nèi)代謝快導(dǎo)致其生物利用度低，限制了該藥物的開發(fā)。固體脂質(zhì)納米粒（Solid lipid nanoparticle，SLN）是一種較為新型的納米粒給藥系統(tǒng)，可控制藥物釋放，延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，同時(shí)也能夠起到定位靶向的作用[6-8]。本研究將SYR研制成SLN制劑，以包封率為考察指標(biāo)對(duì)處方進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)最優(yōu)處方制劑進(jìn)行了表征，為SYR新制劑的開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀系統(tǒng)，包括2996-2695Empower 色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；85-2A恒溫磁力攪拌器（金壇市榮華儀器制造有限公司）；Zatasizer-3000HSA Zeta電位分析儀和Mastersizer S激光粒度儀（英國(guó) Malvern公司）；Tem Tecnaig2透射電子顯微鏡（荷蘭 Philips公司）。

1.2 藥品與試劑

SYR對(duì)照品（批號(hào)：20170430，經(jīng)面積歸一化法測(cè)定純度：>98%）、SYR原料藥（批號(hào)：20170501，純度：>95%）均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)自制；單硬脂酸甘油酯（單甘脂，湖南爾康制藥有限公司，批號(hào)：20170324）；卵磷脂（上海愛(ài)康精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：20170821）；泊洛沙姆188（F68，巴斯夫中國(guó)有限公司，批號(hào)：20170102）；葡聚糖凝膠（Sephadex） G-50（瑞典Pharmacia公司）；甲醇（美國(guó)Dikma公司，色譜純）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 SYR-SLN與空白SLN的制備

稱取單甘酯100 mg、卵磷脂200 mg、SYR 10 mg，加入10 mL無(wú)水乙醇中，加熱使溶解，構(gòu)成有機(jī)相；另取0.4% F68（m/V）的水溶液10 mL，加熱至與有機(jī)相相同溫度，構(gòu)成水相，在1 000 r/min的攪拌速度下，將有機(jī)相注入水相中，攪拌1 h，揮發(fā)有機(jī)溶劑，體積濃縮至5 mL左右，可得半透明納米乳劑，將所得納米乳劑在攪拌下快速分散于0～2 ℃的稀釋相中，繼續(xù)攪拌2 h，即得SYR-SLN膠體溶液。同時(shí)按上述方法制備不含SYR的空白SLN膠體溶液。

2.2 SYR分析方法的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱：ODS-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（50 ∶ 50，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：221 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 溶液的制備 （1）對(duì)照品溶液的制備：稱取SYR對(duì)照品35 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋定容至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為1.456 mg/mL的SYR對(duì)照品溶液。（2）供試品溶液的制備：精密吸取SYR-SLN膠體溶液1 mL，加入甲醇破乳并定容至25 mL量瓶中，1 000 r/min離心10 min，取上清液，即得供試品溶液。（3）空白SLN溶液的制備：精密量取空白SLN膠體溶液1 mL，加入甲醇破乳并定容至25 mL量瓶中，1 000 r/min離心10 min，取上清液，即得空白SLN溶液。

2.2.3 專屬性試驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白SLN溶液各10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果顯示，在該色譜條件下，SYR色譜峰與其他色譜峰的分離度均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，表明空白SLN溶液對(duì)SYR的測(cè)定無(wú)干擾，方法的專屬性良好。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密量取SYR對(duì)照品溶液1.0、2.0、4.0、6.25、7.5 mL，置于50 mL量瓶中，制備成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，SYR質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析。得回歸方程為A=16 226c-58 247（R2=0.999 9），結(jié)果表明，SYR在29.1～218.4 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密量取SYR對(duì)照品溶液適量，制備成質(zhì)量濃度為58.18 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，同日連續(xù)進(jìn)樣6次，考察日內(nèi)精密度；每日進(jìn)樣1次，連續(xù)測(cè)定6 d，考察日間精密度。結(jié)果顯示，日內(nèi)RSD=0.81%（n=6），日間RSD=0.93%（n=6），表明本方法日內(nèi)、日間精密度良好。

2.2.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取已知SYR含量的供試品溶液9份，分別加入質(zhì)量濃度為50、55、60 μg/mL的SYR溶液，每個(gè)濃度各3份，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，以測(cè)得值與真實(shí)值的比值計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，平均回收率為100.49%、100.04%、99.05%（n=3），總平均回收率為99.86%（RSD<2%，n=3），符合含量測(cè)定要求。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 平行量取同一批供試品溶液6份，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積。結(jié)果顯示，峰面積的RSD=0.67%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取供試品溶液，室溫下放置0、2、4、8、12、18、24 h后，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果顯示，SYR含量分別為58.11、57.79、57.91、57.62、57.24、57.13、57.07 μg/mL，RSD=0.71%（n=7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3 包封率和載藥量檢測(cè)

精密量取SYR-SLN膠體溶液，加入至Sephadex G-50凝膠柱頂部，蒸餾水洗脫，分離出游離的SYR溶液。取游離的SYR溶液，用甲醇破乳并定容至25 mL量瓶中，1 000 r/min離心10 min，取上清液10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算游離SYR的含量。再計(jì)算SYR-SLN的包封率和載藥量，包封率（%）=（W總-W游離）/ W總×100%，載藥量（%）=（W總-W游離）/WP×100%，式中W總表示SYR-SLN膠膠體溶液中SYR的總含量；W游離表示游離SYR的含量；WP表示SYR-SLN的總量。

2.4 SYR-SLN處方篩選與優(yōu)化

2.4.1 單因素試驗(yàn) 在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以包封率為考察指標(biāo)，對(duì)乳化劑的選擇、乳化劑用量、有機(jī)相中乳化劑與載體材料比例、載體材料用量、投藥量、有機(jī)相-水相比例、攪拌速度、乳化條件進(jìn)行了單因素考察，確定選用卵磷脂和F68為乳化劑，F(xiàn)68濃度為0.4%，有機(jī)相中卵磷脂-單甘酯質(zhì)量比為3 ∶ 1，單甘酯用量為80 mg，投藥量為10 mg，有機(jī)相-水相體積比為1 ∶ 2，攪拌速度為600 r/min，乳化溫度為65 ℃時(shí)SYR-SLN的包封率最高。

2.4.2 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定以卵磷脂-單甘酯質(zhì)量比（A）、有機(jī)相-水相體積比（B）、F68濃度（C）、投藥量（D）為考察因素，包封率為考察指標(biāo)，采用L9（34）的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，每個(gè)因素取3個(gè)水平。因素與水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3結(jié)果可知，除因素A對(duì)試驗(yàn)結(jié)果具有顯著影響外，其他因素的影響均不顯著。綜合考慮，確定最優(yōu)處方為A2B2C2D2，即卵磷脂-單甘酯質(zhì)量比為3 ∶ 1，有機(jī)相-水相體積比為1 ∶ 2，F(xiàn)68濃度為0.4%，投藥量為10 mg。

2.5 最優(yōu)處方工藝驗(yàn)證

按“2.4”項(xiàng)下結(jié)果，確定最優(yōu)處方工藝：稱取10 mg SYR、240 mg卵磷脂、80 mg的單甘酯，加入5 mL無(wú)水乙醇中，加熱使之完全溶解，構(gòu)成有機(jī)相；另取0.4%的F68水溶液10 mL，水浴加熱至與有機(jī)相相同溫度，構(gòu)成水相，在65 ℃水浴中，600 r/min的攪拌速度下，將有機(jī)相注入水相中，乳化1 h，揮發(fā)有機(jī)溶劑，體積濃縮至5 mL左右，將所得納米乳劑在攪拌下快速分散于5 mL 0～2 ℃的稀釋相中，繼續(xù)攪拌1.5 h，即得SYR-SLN的膠體溶液。按上述處方工藝制備3批SYR-SLN的膠體溶液，再按“2.3”項(xiàng)下方法考察其包封率和載藥量，結(jié)果顯示，3批樣品的工藝穩(wěn)定、重現(xiàn)性好。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

2.6 SYR-SLN的表征

2.6.1 粒子形態(tài) （1）肉眼觀察。用肉眼對(duì)SYR-SLN進(jìn)行觀察，顯示SYR-SLN為透明略帶乳光的澄清液體，無(wú)沉淀及粒子存在。SYR-SLN的外觀見(jiàn)圖2。

（2）透射電鏡觀察。取SYR-SLN膠體溶液稀釋后，滴于封口膜上，用鑷子輕輕夾取涂好膜的銅網(wǎng)，放在SYR-SLN液滴上，漂浮沾取樣品后用鑷子將銅網(wǎng)置于2%磷鎢酸染液上漂浮染色，干燥完成后用透射電鏡進(jìn)行觀察并拍照。結(jié)果顯示，SYR-SLN呈類球形實(shí)體粒子，外觀圓整，分布均勻。SYR-SLN的透射電鏡圖見(jiàn)圖3。

2.6.2 粒徑分布與Zeta電位 用激光粒度儀及Zeta電位分析儀對(duì) SYR-SLN的粒徑與Zeta電位進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，SYR-SLN的平均粒徑為（180.30±5.31） nm（n=3），Zeta電位為（-41.9±0.8） mV。SYR-SLN的粒徑分布見(jiàn)圖4，Zeta電位分布見(jiàn)圖5。

2.6.3 穩(wěn)定性 將3批SYR-SLN樣品于室溫（25 ℃）及4 ℃冰箱冷藏保存，分別于0、1、3、7、15 d取樣，肉眼觀察外觀，并檢測(cè)其包封率，考察穩(wěn)定性。SYR-SLN在15 d內(nèi)的外觀變化結(jié)果見(jiàn)表5，穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

從表4和表5結(jié)果可知，SYR-SLN在4 ℃條件下存放15 d，外觀均勻，包封率幾乎無(wú)變化。25 ℃條件下，SYR-SLN包封率隨存放時(shí)間的延長(zhǎng)明顯下降，當(dāng)存放7 d時(shí)，肉眼可見(jiàn)少許絮凝，且包封率有所降低；當(dāng)存放15 d時(shí)，出現(xiàn)不可逆沉降，且包封率明顯下降。由此表明，SYR-SLN在4 ℃條件下存放15 d內(nèi)比較穩(wěn)定。

3 討論

SYR-SLN的制備方法有很多，如薄膜超聲法、微乳法、復(fù)乳法和乳化蒸發(fā)法、乳化聚合法、溶劑分散法等[9-11]。本研究考慮SYR親水性極強(qiáng)，其中乳化聚合法、復(fù)乳法及乳化蒸發(fā)法均適合于水溶性藥物。預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，復(fù)乳法所制SYR-SLN粒徑較大，穩(wěn)定性不好；乳化聚合法制備SYR-SLN，得到的包封率較好，但載藥量極低；乳化蒸發(fā)法制備得到SYR-SLN的包封率和載藥量都很高，并且粒徑圓整、不粘連。另外筆者還比較了薄膜超聲法、乳化蒸發(fā)法、溶劑分散法所制SYR-SLN的包封率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，還是乳化蒸發(fā)法制備的SYR-SLN包封率最高，所以確定用乳化蒸發(fā)法作為SYR-SLN的制備方法。

在單因素考察過(guò)程中，雖然單獨(dú)使用卵磷脂作為乳化劑的包封率較高，但所得納米粒粘連、大小不均勻、粒徑偏大；單獨(dú)使用F68所得納米粒大小均勻、粒徑小，但包封率較低。F68是一種親水性表面活性劑，與卵磷脂合用作為乳化劑能得到較小的粒徑和較高包封率，且穩(wěn)定性好。因此選擇卵磷脂和F68合用作為乳化劑。其中F68作為水相的主要成分，而卵磷脂是有機(jī)相的成分之一，故在考察乳化劑和載體材料的質(zhì)量比時(shí)，只選擇了卵磷脂與單甘脂進(jìn)行比較。

包封率是評(píng)價(jià)SYR-SLN的重要指標(biāo)，測(cè)定SLN包封率的方法有多種，如葡聚糖凝膠柱法、魚精蛋白沉淀法、冷凍超速離心法、微型柱法、透析法及超濾法等，其原理都是采用一定的方法使包封的藥物與游離藥物分離，測(cè)定包封或游離藥物的濃度，計(jì)算包封率[12-13]。透析法將納米粒溶液注入到適當(dāng)?shù)耐肝龃鼉?nèi)，利用游離藥物可透過(guò)半透膜而納米粒不能透過(guò)的原理，從而達(dá)到分離的目的[14]。但是透析法時(shí)間較長(zhǎng)，并且過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致包封在納米粒中的藥物泄露，因此所測(cè)得包封率偏低。超速離心法是利用納米粒與其分散介質(zhì)密度的不同而達(dá)到分離的目的，對(duì)設(shè)備的要求較高，操作費(fèi)時(shí)且能源消耗較大。葡聚糖凝膠柱層析法是利用分子篩的原理，使混合組分依據(jù)分子的大小不同而得到分離[15]，納米粒由于其分子比游離藥物大，不易進(jìn)入凝膠內(nèi)部而先被洗脫，游離藥物后被洗脫。該法操作簡(jiǎn)便，避免了超速離心法在離心過(guò)程中可能發(fā)生的納米粒變形與破裂現(xiàn)象。因此，最終選用葡聚糖凝膠柱層析法作為SYR-SLN測(cè)定包封率的方法。

綜上所述，本研究成功制得SYR-SLN，且處方工藝簡(jiǎn)單、包封率高。

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（收稿日期：2019-01-03 修回日期：2019-03-15）

（編輯：鄒麗娟）