基于高通量測(cè)序的紫花丹參與白花丹參根際真菌群落結(jié)構(gòu)研究

蔣靖怡 杜用璽 王鐵霖 池秀蓮 呂朝耕 王升 康傳志 張燕 孫楷 郭蘭萍

摘要 目的：通過(guò)分析紫花丹參與白花丹參根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)與差異性物種組成，為研究丹參根際微生態(tài)提供科學(xué)依據(jù)。方法：該研究以同一地塊種植的紫花丹參與白花丹參的根際真菌為研究對(duì)象，采用ITS高通量測(cè)序技術(shù)研究其菌落特征及差異性物種。結(jié)果：紫花丹參與白花丹參在根際真菌上群落結(jié)構(gòu)上存在顯著差異。盤(pán)菌綱、盤(pán)菌目與肉座菌科為其二者的差異性物鐘。結(jié)論：紫花丹參與白花丹參對(duì)根際真菌的定殖具有選擇性。

關(guān)鍵詞 紫花丹參;白花丹參;根際;土壤真菌;群落結(jié)構(gòu)

Community Structure and Diversity of Soil Fungi in Rhizosphere of Salvia miltiorrhiza and S.miltiorrhiza f.alba.Based on Pyrosequencing

Jiang Jingyi1，2，Du Yongxi1，Wang Tielin1，Chi Xiulian1，Lyu Chaogeng1，Wang Sheng1，Kang Chuanzhi1，Zhang Yan1，Sun Kai1，Guo Lanping1

（1 State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs，National Resource Center for Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China; 2 National Agricultural Technology Extension and Service Center，Beijing 100125，China）

Abstract Objective：To analyze rhizosphere soil fungal community structure and differential species composition of Salvia miltiorrhiza and S.miltiorrhiza f.alba.，and to provide scientific basis for studying the rhizosphere microecology of Salvia miltiorrhiza.Methods：In this study，the rhizosphere fungi of Salvia miltiorrhiza and S.miltiorrhiza f.alba.grown in the same plot were taken as the research object.The ITS high-throughput sequencing technology was used to study its colony characteristics and differential species.Results：There were significant differences in the community structure of rhizospheric fungi between Salvia miltiorrhiza and S.miltiorrhiza f.alba.Discophyte，Discophyta，and Sarcophagaceae were the differences between them.Conclusion：The participation of Salvia miltiorrhiza and S.miltiorrhiza f.alba.is selective for colonization of rhizosphere fungi.

Key Words Salvia miltiorrhiza; Salvia miltiorrhiza f.alba; Rhizosphere; Soil fungi; Community structure and function

中圖分類號(hào)：R282.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.003

丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）是唇形科鼠尾草屬的多年生草本植物，主要以其根和根莖入藥，具有祛瘀止痛，活血通經(jīng)、涼血消癰等療效，是我國(guó)大宗常用的中藥材[1]。一般以紫花丹參作為藥用，而白花丹參是紫花丹參的白花變型[2]。前人主要針對(duì)二者的生物量積累速率[3-4]、活性成分含量[5]以及根際化感效應(yīng)[6-7]等方面進(jìn)行比較研究。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)丹參的需求逐漸增加，野生資源逐漸稀缺。目前，市場(chǎng)上的丹參主要依靠人工栽培供給。但是隨著丹參的重茬連作，土壤生態(tài)環(huán)境日益惡化，地上植株與地下根系生長(zhǎng)逐漸偏小，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)單一，病蟲(chóng)害加重，嚴(yán)重者出現(xiàn)大面積生理性死苗。因此，連作障礙已成為丹參生產(chǎn)上的重大技術(shù)難題[8]。

已有研究表明，丹參重茬連作后，其根際土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化[9]。真菌是土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分[10]，對(duì)土壤中有機(jī)物的分解[11]、物質(zhì)循環(huán)以及能量傳遞發(fā)揮著重要作用，是土壤中一類極其重要的微生物[12]。土壤中的真菌還可通過(guò)分泌抑菌物質(zhì)來(lái)抑制病原菌的生長(zhǎng)，從而降低植物病害的發(fā)生率[13]。根際真菌在土壤生態(tài)系統(tǒng)的發(fā)展、功能、穩(wěn)定等諸多方面發(fā)揮著重要作用[14]。因此，了解植物根際土壤真菌的多樣性及其復(fù)雜的群落結(jié)構(gòu)組成是土壤微生物生態(tài)學(xué)研究的核心問(wèn)題之一，對(duì)保障丹參優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)及其連作障礙防治具有重要意義。

傳統(tǒng)的土壤微生物研究方法會(huì)受到各種因素的制約，例如純培養(yǎng)技術(shù)中分離技術(shù)的限制以及Biolog法中發(fā)酵條件的限制[15]，這些通常都會(huì)導(dǎo)致過(guò)低估計(jì)微生物的群落結(jié)構(gòu)組成[16]。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)生了高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性和低運(yùn)行成本的高通量技術(shù)（High-throughput Sequencing）[17]。將該技術(shù)應(yīng)用于土壤根際微生物的研究，可有效避免了傳統(tǒng)的土壤微生物研究方法的弊端。目前，該測(cè)序技術(shù)已成功應(yīng)用于微生物多樣性方面的研究中[18-20]。

因此，本研究以同一地塊栽培的白花丹參與紫花丹參為研究對(duì)象，采用ITS高通量測(cè)序技術(shù)研究二者的根際真菌群落特征，旨在闡明紫花丹參與白花丹參根際真菌群落的相似性與差異性，為進(jìn)一步研究丹參根際微生態(tài)特征、根際功能菌株的篩選和應(yīng)用提供依據(jù)，為人工調(diào)節(jié)丹參根際微環(huán)境、提升栽培丹參的產(chǎn)量品質(zhì)、改善栽培地生態(tài)環(huán)境、解決丹參連作障礙等問(wèn)題提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集 2018年6月于北京市百鳴堂農(nóng)場(chǎng)采集根際土壤樣品，選擇種植過(guò)程中未使用任何肥料、農(nóng)藥與除草劑的丹參混合栽培地進(jìn)行取樣。采集時(shí)隨機(jī)選取二年生紫花丹參與白花丹參各5株，將丹參植株與其下土體完整取出，抖落根系外圍土壤，取仍附著于根系表面的土壤作為根際土壤。土樣過(guò)80目篩去除植物根系等雜質(zhì)，立即存放于-80 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.2 土壤微生物DNA提取 采用CTAB法提取土壤樣本總DNA，將提取到的DNA樣品溶于100 μL的去離子水中，取5 μL DNA用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分析DNA的完整性和相對(duì)濃度。

1.3 ITS基因擴(kuò)增與測(cè)序 采用引物ITS1-1F-F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）/ITS1-1F-R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）擴(kuò)增真菌ITS1區(qū)域。PCR擴(kuò)增體系如下：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。獲得PCR產(chǎn)物后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，使用Thermo Scientific公司GeneJET膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，使用Thermofisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit定量和文庫(kù)檢測(cè)合格后，使用Thermofisher的Life Ion S5TM或Ion S5TMXL進(jìn)行上機(jī)測(cè)序

1.4 數(shù)據(jù)分析 采用Cutadapt[21]先對(duì)reads進(jìn)行低質(zhì)量部分剪切，再根據(jù)Barcode從得到的reads中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列，初步質(zhì)控得到原始數(shù)據(jù)。經(jīng)過(guò)以上處理后，得到的Reads需要進(jìn)行去除嵌合體序列的處理，Reads序列通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)嵌合體序列[22]，并最終去除其中的嵌合體序列[23]，得到最終的有效數(shù)據(jù)。利用Uparse軟件（Uparse v7.0.1001），對(duì)所有樣品的全部Clean Reads以97%相似水平將序列聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units）。用Mothur方法與SILVA[24]的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)[25]進(jìn)行物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.8～1）。使用Excel 2013和SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)相對(duì)豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并通過(guò)制作箱形圖描述不同分類水平下紫花丹參與白花丹參根際真菌的優(yōu)勢(shì)類群。通過(guò)線性判別分析（Linear Discriminant Analysis，LDA）對(duì)根際真菌群落進(jìn)行LEfSe分析（LDA Score 3.5），尋找紫花丹參與白花丹參根際土壤真菌中有顯著差異的物種。使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計(jì)算Chao1、Shannon-Wiener、Simpson、ACE（abundance-based coverage estimator）等α多樣性指數(shù)，并進(jìn)行組間差異檢驗(yàn)。利用Qiime軟件（Version 1.9.1）計(jì)算Unifrac距離，使用R軟件繪制NMDS圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花丹參與白花丹參根際真菌群落OTU分析 真菌ITS高通量測(cè)序共獲得優(yōu)化序列817 008條，平均長(zhǎng)度229.9 bp。見(jiàn)表1。10個(gè)樣本獲得的序列均超過(guò)50 000條reads，所有樣品的測(cè)序深度均超過(guò)96%，稀釋曲線趨于平臺(tái)期，測(cè)序效果理想。

2.2 紫花丹參與白花丹參根際真菌多樣性指數(shù)分析Alpha多樣性指數(shù)用于體現(xiàn)真菌群落的豐富度和多樣性。通過(guò)計(jì)算Shannon-Wiener、Simpson、Chao1、ACE等α多樣性指數(shù)。見(jiàn)表2。對(duì)紫花丹參與白花丹參根際土壤真菌群落進(jìn)行α多樣性分析。Shannon-Wiener指數(shù)與Simpson指數(shù)常被用于估算群落物種多樣性，Simpson指數(shù)常用來(lái)估算物種均勻度，Shannon-Wiener指數(shù)則常被用于估算物種的豐富度，指數(shù)越大，表明樣品中菌群的豐富度與均勻度越高。估算樣品中微生物的豐富度則常用Chao1指數(shù)與ACE指數(shù)，指數(shù)越大，表明菌群的豐富度越高。ACE指數(shù)可排除測(cè)序誤差等干擾，用來(lái)衡量樣本的真實(shí)物種種類，ACE值越大，樣本的真實(shí)物種種類越多。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，紫花與白花丹參的各個(gè)多樣性指數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明紫花與白花丹參根際土壤中真菌群落中菌群的豐富度與均勻度均較為一致。

2.3 紫花丹參與白花丹參根際真菌群落結(jié)構(gòu)分析 如圖1所示，在門(mén)類水平上看，紫花丹參與白花丹參根際真菌中僅被檢測(cè)5個(gè)真菌門(mén)類，分別是：子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)、接合菌門(mén)、球囊菌門(mén)和壺菌門(mén)。其中，紫花丹參與白花丹參根際優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均為子囊菌門(mén)，其相對(duì)豐度分別在紫花丹參與白花丹參根際中為55.04%和53.68%。其次為擔(dān)子菌門(mén)和接合菌門(mén)，其相對(duì)豐度在紫花丹參與白花丹參根際中均達(dá)到10%以上。球囊菌門(mén)在紫花丹參與白花丹參根際中僅在5%左右，壺菌門(mén)在紫花丹參與白花丹參根際真菌中相對(duì)豐度最?。?.39%，0.82%）。

在綱水平上看，糞殼菌綱的相對(duì)豐度在紫花丹參與白花丹參根際真菌中排在首位，相對(duì)豐度分別為：38.40%和38.43%。紫花丹參與白花丹參根際中排名前6的真菌綱類均一致，其相對(duì)豐度之和分別在紫花丹參和白花丹參中達(dá)到85.81%和89.58%。除去排名前6的真菌綱類，紫花丹參與白花丹參根際開(kāi)始表現(xiàn)出差異。盤(pán)菌綱在紫花丹參中的相對(duì)豐度達(dá)到3.59%，排在第七，而在白花丹參中其相對(duì)豐度為1.11%，比紫花丹參低2.48%，名列第9。錘舌菌綱與散囊菌綱在紫花丹參根際中排在第八，第九，而在白花丹參根際中排在第7，第8的位置上。壺菌綱在紫花丹參根際中排在了第10的位置，但未進(jìn)入白花丹參根際前10的位置，而Incertae sedis Ascomycota在白花丹參根際中排名第10，卻未進(jìn)入紫花丹參根際前10。

在目類水平上看，紫花丹參與白花丹參根際真菌群落表現(xiàn)出更多的差異。紫花丹參根際排名前10的類群中包含了盤(pán)菌目、傘菌目以及雞油菌目，而在白花丹參根際排名前10的菌群均不包含上述的3個(gè)目類菌群，而包含了紫花丹參根際排名前10中未出現(xiàn)的柔膜菌目、煤炱目和Coniochaetales。其中，盤(pán)菌目在紫花丹參根際中相對(duì)豐度為2.40%，而在白花丹參中僅為0.58%，比在紫花丹參中低1.82%。肉座菌目在紫花丹參根際中排在首位，而Cystofilobasidiales在白花丹參根際中位于首位。肉座菌目、Cystofilobasidiales、Mortierellales、糞殼菌目、球囊霉目、格孢腔菌目在紫花丹參與白花丹參根際中相對(duì)豐度均較高，均排在前6，其相對(duì)豐度之和在紫花丹參與白花丹參中分別達(dá)到62.53%和67.29%，但是其目類菌群在排名順序上均存在差異。

從科類水平上看，紫花丹參與白花丹參的根際真菌排名前10的菌群種類也存在差異。生赤殼科、肉座菌科以及毛球殼科在紫花丹參根際中均屬于優(yōu)勢(shì)菌群，分別排在第6、第8及第10，而在白花丹參根際中的優(yōu)勢(shì)菌群不包含上述科類菌群。錐毛殼科、格孢腔菌科和麥角（菌）科在白花丹參根際中排在第6、第8及第9的位置，但不屬于紫花丹參根際的優(yōu)勢(shì)科類菌群。其中，肉座菌科在紫花丹參根際中其相對(duì)豐度為1.44%，而在白花丹參中僅只有0.57%，比紫花丹參少0.87%。

在科水平上，囊擔(dān)菌科和叢赤殼科的菌群相對(duì)豐度均排在紫花丹參與白花丹參根際中的首位（14.25%，22.59%）和第2（8.79%，8.76%）。其次是被孢霉科、Incertae sedis Hypocreales和Glomeraceae。前述3個(gè)科類菌群在紫花丹參與白花丹參根際中排名存在差異，但是其相對(duì)豐度均較高，其相對(duì)豐度之和分別達(dá)到16.49%和15.15%，分別占分類學(xué)地位明確的科類菌群的26.21%和21.92%。

2.4 紫花丹參與白花丹參根際真菌群落結(jié)構(gòu)組成 為能更直觀地反映出樣品間的差異程度，對(duì)紫花丹參與白花丹參根際真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行非度量多維尺度（NMDS）分析，基于Bray-Cruits相異指數(shù)，將其擬合到10個(gè)丹參樣本的NMDS排序圖上，樣品點(diǎn)的排布代表了樣品與樣品之間的相似程度。見(jiàn)圖2。紫花丹參主要分布在MDS1軸的正端及MDS2軸的正端，白花丹參主要分布在MDS1軸的負(fù)端及MDS2軸的負(fù)端，兩者可明顯地區(qū)分開(kāi)，說(shuō)明紫花丹參與白花丹參在根際真菌上群落結(jié)構(gòu)上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 紫花丹參與白花丹參根際真菌群落差異性物種分析 采用LEfSe方法對(duì)紫花丹參與白花丹參所有根際土壤真菌類群分析主要差異性物種。圖中LDA Score的值代表了差異物種的影響大小，LDA值越大，代表菌群差異性越大。LDA Score預(yù)設(shè)值3.5，高于3.5視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖3。盤(pán)菌綱、盤(pán)菌目與肉座菌科這3類菌群在紫花丹參根際中的相對(duì)豐度均顯著高于白花丹參根際，且盤(pán)菌綱的LDA值最大，說(shuō)明盤(pán)菌綱在紫花丹參與白花丹參根際中差異最大。

3 討論

本研究采用高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)紫花丹參與白花丹參根際真菌群落多樣性進(jìn)行初步研究，初步獲得其根際在門(mén)、綱、目、科等不同分類水平的優(yōu)勢(shì)類群和相對(duì)豐度。研究結(jié)果表明：α多樣性指數(shù)顯示紫花丹參與白花丹參的根際真菌多樣性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;β多樣性組間分析表明紫花丹參與白花丹參在根際真菌群落結(jié)構(gòu)上差異顯著。通過(guò)LefSe差異分析，發(fā)現(xiàn)肉座菌科、盤(pán)菌目與盤(pán)菌綱這3類菌群在紫花丹參根際中均顯著高于白花丹參。已有研究證明，根際真菌會(huì)受到植物種類的調(diào)控，在植物根際會(huì)選擇性富集，從而導(dǎo)致植物根際微生物的群落組成和結(jié)構(gòu)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[26]。這一結(jié)果與Liu等人研究結(jié)果一致[14]。

土壤真菌可以通過(guò)釋放土壤酶來(lái)催化土壤中的各種生物化學(xué)反應(yīng)，例如：氧化還原反應(yīng)、有機(jī)質(zhì)礦化、腐殖質(zhì)合成、污染物降解及生長(zhǎng)活性物質(zhì)釋放等，可促進(jìn)土壤結(jié)構(gòu)和質(zhì)地的形成，加快土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化、提高土壤肥力和生物的有效性，保證土壤微生物區(qū)系的平衡[27]。本研究結(jié)果表明紫花丹參與白花丹參根際中子囊菌門(mén)的相對(duì)豐度最大，位于首位。本研究發(fā)現(xiàn)肉座菌目與糞殼菌目為紫花丹參與白花丹參根際的優(yōu)勢(shì)菌目，尤其是肉座菌目，其相對(duì)豐度達(dá)到20%以上，前人研究表明子囊菌門(mén)的肉座菌目、糞殼菌目具有降解腐爛有機(jī)質(zhì)、降解纖維素等作用[28]，這可能與丹參根際土壤中的養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和碳代謝相關(guān)[29]。

綜上所述，本研究首次采用高通量測(cè)序技術(shù)深入研究紫花丹參與白花丹參的土壤真菌群落組成及多樣性，旨在揭示紫花丹參與白花丹參根際真菌群落結(jié)構(gòu)的差異，進(jìn)一步揭示丹參根際微生態(tài)特征，為闡釋丹參-土壤-真菌之間的相互作用奠定基礎(chǔ)，為解決丹參連作障礙提供技術(shù)支持。

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（2019-10-15收稿 責(zé)任編輯：王明）

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81891014，81703648）;國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFC1700701，2017YFC1701405）;中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院重點(diǎn)領(lǐng)域（ZZ10-027）;財(cái)政部中央本級(jí)專項(xiàng)（2060302），中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（ZZ13-YQ-084）;中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心自主選題（ZZXT201705）作者簡(jiǎn)介：蔣靖怡（1994.12—），女，碩士，研究方向：中藥資源，E-mail：1184615738@qq.com通信作者：孫楷（1987.04—），女，博士，助理研究員，研究方向：中藥資源，E-mail：sun-kai@pku.edu.cn;郭蘭萍（1969.08—），女，博士，研究員，研究方向：中藥資源，E-mail：glp01@126.com