超高壓液相色譜/線性離子阱-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法鑒定鎖陽有效部位的化學成分

程丹 暢洪昇 王旭 馬素亞 李玲玲 李鑫潔 魯藝

摘要? 目的：評價利用超高壓液相色譜/線性離子阱-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法（UPLC/LTQ-Orbitrapa MS）測定鎖陽改善認知功能障礙有效部位的化學成分。方法：選取Acquity UPLC BEH C18（1.7 μm 2.1 mm×100 mm）色譜柱，柱溫：30 ℃，流速：0.3 mL/min，進樣量：5 μL，流動相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）梯度洗脫。質(zhì)譜采用電噴霧（ESI）離子源，在正負離子模式下采集數(shù)據(jù)。結果：共鑒別了21個化合物，包含6個潛在新化合物。鑒定的化合物包含核苷類、多酚類、黃酮苷類、氨基酸類、香豆素類化合物。結論：UPLC/LTQ-Orbitrapa MS方法能快捷、準確、較全面地鑒定鎖陽有效部位的化學成分，為明確鎖陽藥效學物質(zhì)基礎及進一步提取分離提供科學依據(jù)。

關鍵詞? 超高壓液相色譜;線性離子阱-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜;鎖陽有效部位;化學成分

Rapid Identification and Characterization of Chemical Components in the Active Part of Herba Cynomorii by UPLC/LTQ-Orbitrapa MS

Cheng Dan1，Chang Hongsheng2，Wang Xu1，Ma Suya1，Li Lingling1，Li Xinjie1，Lu Yi1

（1 School of Preclinical Medicine，Beijing University of Chinese Medicines，Beijing 100029，China; 2 School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicines，Beijing 102488，China）

Abstract Objective： To analyze and identify the chemical constituents from the active part of Herba Cynomorii using UPLC/LTQ-Orbitrapa MS （Ultra Performance Liquid Chromatography/Liner Ion Trap-Orbitrapa Mass Spectrometry）. Methods： The analysis was performed on an Acquity UPLC BEH C18 reverse phase column （100 mm × 2.1 mm，1.7 μm）.The injection volume was 5 μL.The flow rate was 0.3 mL/min gradient elution and column temperature was 30 ℃.The mobile phase consisted of acetonitrile （B） and 0.1% formic acid （A） was used as gradient elute.MS conditions were ESI （Electronic Spray Ion），positive and negative ion mode scanning. Results： After the data of mass spectra，pyrolysis rule and characteristic fragment ion information were analyzed，a total of 20 compounds were identified，including nucleosides，phenolic acids，flavonoid glycosides，Coumarins and amino acid. Conclusion： By using UPLC/LTQ-Orbitrapa MS method，the main chemical constituents from Herba Cynomorii can be accurately identified.

Key Words? Ultra-high-pressure liquid chromatography; Linear ion trap-Orbitrap mass spectrometry; Active part of Herba Cynomorii; Chemical components

中圖分類號：R284 文獻標識碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.011

鎖陽（Cynomorium songaricum Rupr）俗稱“不老藥”，又名地毛球、鎖嚴子等，是鎖陽科多年生、全寄生種子植物，寄生于蒺藜科白刺屬植物根部。鎖陽在中藥中用作補腎、助陽、益精、潤腸藥物[1]?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，鎖陽具有抗氧化、保護神經(jīng)系統(tǒng)、抗疲勞、調(diào)節(jié)激素水平，調(diào)節(jié)糖代謝等作用[2-5]，本課題組前期對鎖陽的不同部位進行篩選，發(fā)現(xiàn)鎖陽乙酸乙酯部位具有雌激素樣作用[6]，對于癡呆及慢性應激所致動物認知功能障礙具有明顯的改善作用[7-9]，為鎖陽治療認知功能障礙及抗衰老的有效部位，但對于此部位的化學成分并不清楚。

由線性離子阱（Linear Trap Quadrupol，LTQ）與軌道離子阱串聯(lián)的質(zhì)譜儀（Linear Trap Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometry，LTQ-Orbitrap MS）是近年發(fā)展起來的一項新技術，具有高達100 000的質(zhì)量分辨率、進行快速模式切換、高于2 ppm的質(zhì)量準確度等特點，可用于未知物的快速篩選和結構確認、藥物開發(fā)前期藥代動力學的研究[10]。本研究將其與超高壓液相結合，利用精確質(zhì)量數(shù)、裂解規(guī)律及特征碎片離子信息，對于研究鎖陽有效部位化學成分，及相關化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律具有重要的意義。

1 材料

1.1 儀器

UltiMate 3000 UHPLC（ThermoFisher，包括二元梯度泵，真空脫氣機，自動進樣器，自動控溫箱），通過電噴霧離子源與LTQ Orbitrapa XL質(zhì)譜儀連接，數(shù)據(jù)采集及處理軟件為Xcalibur2.2.0，質(zhì)譜裂解規(guī)律模擬軟件為Mass Frontier 7.0，均為ThermoFisher。

1.2 試劑

兒茶素，表兒茶素購自中國食品藥品鑒定研究院（批號分別為10877-201604，11987-201501），乙腈（Sigma，批號：171448）、甲醇（Sigma，批號：175159）均為色譜級，甲酸為分析純級別（福晨化學）。流動相用水由Milli-Q純水系統(tǒng)（18.2 MΩ·cm，Millipore，美國）制得。

1.3 分析樣品

鎖陽藥材產(chǎn)自北京同仁堂飲片有限公司（生產(chǎn)批號：601003042），購于北京中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂。

2 方法

2.1 色譜條件

超高效液相色譜條件：色譜柱為Acquity UPLC BEH C18（1.7 μm 2.1 mm×100 mm）;柱溫：30 ℃;流速：0.3 mL/min;進樣量：5 μL;流動相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～7 min，10% ～40% B;7～21 min，40% B;21～21 min，40% ～80% B;21～28 min，80% B。

質(zhì)譜條件：電噴霧（ESI）電離源，采用正離子與負離子2種掃描方式。正離子模式噴霧電壓4KV，負離子模式噴霧電壓-3KV。儀器操作參數(shù)為：鞘氣（Sheath Gas）40單位;毛細管溫度（Calillary Temp）320 ℃;毛細管電壓（Capillary Voltage）25 V，管透鏡（Tube Lens）電壓110 V。質(zhì)量掃描范圍為：100～1 200。

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱量兒茶素3.4 mg、表兒茶素4.2 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至10 mL，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，冷藏待用。

2.3 供試品溶液的制備 取適量鎖陽粉末，用乙醇浸泡24 h，超聲1 h，重復3次，過濾，濾液旋轉蒸發(fā)，得甲醇提取物，將甲醇提取物溶解于水中，依次用二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，重復3次，回收乙酸乙酯至干，得乙酸乙酯提取物萃取物。精密稱量乙酸乙酯萃取物10 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，冷藏待用。

3 結果

采用上述優(yōu)化后分析條件，鎖陽提取物中的化學成分可以得到較好分離，對其正負離子模式分析，得到鎖陽提取物的總離子流（TIC）色譜圖如圖1所示。根據(jù)實測碎片信息并結合參考文獻，以及相關化合物的一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜、同位素的分布和化合物裂解規(guī)律，進行未知化合物的分析與鑒別。已鑒定的化合物保留時間、質(zhì)譜信息見表1。

2.4.1 核苷類鑒定 化合物2保留時間為1.19 min，一級質(zhì)譜圖中 m/z? 268.104 03[M+H]+，準分子離子給出C10H13O4N5分子式。其二級質(zhì)譜主要 m/z? 135離子碎片，是由母離子失去一份子核糖（Rib）形成。其二級質(zhì)譜與銀線蓮中腺苷的數(shù)據(jù)一致[11]，故鑒定化合物2為腺苷。腺苷是核苷類的主要成分，是構成核酸DNA、RNA的重要前體，也是能量代謝的重要中間體[12]。腺苷可能的裂解方式如圖2。

2.4.2 多酚類化合物鑒定

化合物1，3，4，7，9，10，11，12，保留時間分別是0.97 min，2.39 min，2.78 min，3.32 min，3.98 min，4.34 min，4.63 min，4.85 min，這8個化合物的一級質(zhì)譜圖的[M-H]-準分子離子峰分別如下：化合物1? m/z? 577.137 39，化合物3和9? m/z? 577.137 82，化合物4和7? m/z? 577.137 57，化合物10? m/z? 577.137 88，化合物11? m/z? 577.137 51，化合物12? m/z? 577.137 63，這8個化合物均給出分子式C30H26O12。8個色譜峰在相同的二級質(zhì)譜條件下，均能產(chǎn)生 m/z? 245，287，407，425，451的離子碎片，只是相對豐度有些差異，提示這8個化合物應為同分異構體，初步判定這些化合物為原花青素B，原花青素有多種二聚體形式的同分異構體，以2個結構單元C4-C8、C4-C6位連接的兒茶素或表兒茶素的結構單元間聚合成二聚體形式較為常見，即原花青素B1-B8[13-14]。根據(jù)原花青素B類同分異構體的反相液相色譜洗脫順序[15]，推測化合物1，3，4，7，9，10，11，12分別為原花青素B1，B3，B4，B2，B6，B8，B7，B5?；衔?保留時間及二級質(zhì)譜離子碎片與文獻報道基本一致[16]，因此推測化合物7為花青素B2。

化合物5，8，保留時間分別為3.08 min，3.87 min，一級質(zhì)譜圖均顯示 m/z? 289.070 66[M-H]-的準分子離子峰，且均給出分子式C15H14O6。二者的二級質(zhì)譜均有 m/z? 245[M-H-CO2]-，及 m/z? 205[M-H-2C2H2O]-的碎片峰，但豐度不同。由于二者峰成對出現(xiàn)，裂解規(guī)律相似，因此推測這2個化合物為同分異構體。根據(jù)兒茶素、表兒茶素標準品質(zhì)譜離子碎片及文獻中[16-18]二級質(zhì)譜碎片峰和裂解規(guī)律，鑒定化合物5，8分別為兒茶素和表兒茶素。

化合物6，保留時間為3.11 min，一級質(zhì)譜顯示 m/z? 139.03897[M+H]+，準分子離子峰給出分子式C7H6O3。[M+H]+作為母離子進入二級質(zhì)譜后發(fā)生斷裂產(chǎn)生特征碎片 m/z? 94，由前者丟失COOH所得。參考水楊酸的裂解方式[19]，鑒定化合物6為水楊酸。

化合物14，保留時間為5.27 min，一級質(zhì)譜圖顯示 m/z? 441.081 62[M-H]-的準分子離子峰，且給出分子式C22H18O10。二級質(zhì)譜有 m/z? 289[M-H-C7H4O4]-， m/z? 245[M-H-C8H4O6]-， m/z? 205[M-H-C11H8O6]-， m/z? 179[M-H-C13H10O6]-的碎片峰，后3個碎片峰應為 m/z? 289碎片峰進一步發(fā)生環(huán)裂解，分別丟失CO2，2C2H2O，C6H6O2所得。對比表兒茶素沒食子酸酯標準品和文獻中該化合物二級質(zhì)譜離子碎片峰和裂解規(guī)律[18]，鑒定化合物14為表兒茶素沒食子酸酯。

2.4.3 黃酮苷元類化合物鑒定

化合物13，保留時間為5.19 min，一級質(zhì)譜圖顯示 m/z? 465.102 75[M+H]+的準分子離子峰，給出分子式為C21H20O12。二級質(zhì)譜有 m/z? 303[M-glucosyl+H]+， m/z? 274[M-glucosyl-CHO+H]+，即母離子進入二級質(zhì)譜后糖苷鍵斷裂形成 m/z? 303的碎片峰，后者再次丟失CHO形成 m/z? 274的碎片峰。參照文獻中二級質(zhì)譜離子碎片峰及保留時間[20]，鑒定化合物13為異槲皮苷。

化合物15，保留時間為5.74 min，一級質(zhì)譜顯示 m/z? 341.123 09[M-H]-的準分子離子峰，確定化合物15的相對分子質(zhì)量為342，其二級質(zhì)譜含有 m/z? 161.1040[M-glucosyl-H2O]-的碎片離子，結合文獻對松苷的MS分析結果[21]，鑒定化合物15為松苷。

化合物17，保留時間為5.99 min，一級質(zhì)譜圖顯示 m/z? 449.107 84[M+H]+的準分子離子峰，給出分子式C21H20O11。準分子離子峰失去 m/z 162，產(chǎn)生碎片離子明顯的苷元母核離子 m/z? 287[M-162+H]+，根據(jù)相對分子質(zhì)量，初步判定失去的中性片段為葡萄糖。結合文獻對木犀草苷的MS分析結果[22-23]，鑒定化合物17為木犀草苷。

化合物19，保留時間為6.17 min，一級質(zhì)譜圖顯示? m/z? 433.112 92[M-H]-的準分子離子峰，給出分子式C21H22O10。二級質(zhì)譜圖有 m/z? 271[M-162-H]-，推測為母離子進入二級質(zhì)譜丟失一份子葡萄糖所得，文獻中南酸棗苷一級質(zhì)譜及結構鑒定時顯示其母核為二氫芹菜素，并含有1個β-D-葡萄糖基，推測化合物19為柑桔素-4-O-吡喃葡萄糖苷（南酸棗苷）[24-25]。

化合物20，保留時間為6.51 min，一級質(zhì)譜圖顯示 m/z? 435.128 57[M-H]-的準分子離子峰，給出分子式C21H24O10。二級質(zhì)譜有 m/z? 273[M-glucosyl-H]-的碎片峰，為母離子進入二級質(zhì)譜丟失一份子葡萄糖所得，鑒定化合物20為根皮苷[26]。

2.4.4 香豆素類化合物鑒定 化合物16，18，保留時間分別為5.76，6.14 min，一級質(zhì)譜圖均顯示 m/z? 341.0655[M-H]-的準分子離子峰，且給出分子式C18H14O7。2個化合物的二級質(zhì)譜均有 m/z? 190，但豐度有差異，因此認為這2個化合物為同分異構體，推測這2個化合物為Epiphyllocoumarin，Isoepiphyllocoumarin[27]。Epiphyllocoumarin已在鎖陽中被鑒定出[28]，因此推測Isoepiphyllocoumarin為鎖陽的潛在新化合物。2個化合物可能的裂解規(guī)律如圖3所示。

2.4.5 氨基酸類的鑒定 化合物21，保留時間為24.45 min，一級質(zhì)譜圖顯示 m/z? 150.058 32[M+H]+的準分子離子峰，給出分子式C5H11O2NS。二級質(zhì)譜有 m/z? 104[M-COOH+H]+碎片峰，為母離子斷裂COOH鍵所得，推測化合物27為蛋氨酸[29]。蛋氨酸可能的裂解方式如圖4所示。

4 討論

本實驗采用UPLC/LTQ-Orbitrapa MS快速分析的方法，采用正、負2種離子模式進行檢測，在分析過程中發(fā)現(xiàn)負離子模式更適用于鎖陽乙酸乙酯部位的成分鑒定?；诨衔锏木_相對分子量、標準品質(zhì)譜圖和參考文獻，鑒定了鎖陽改善認知功能障礙有效部位的21個化合物，并推測出鎖陽中潛在的6個新化合物。在此次研究中，我們推測出花青素B的各種異構體，除原花青素B3已在鎖陽中被報道[30]，其余原花青素B類同分異構體可能是鎖陽中的潛在新化合物。但目前不能區(qū)分花青素B異構體的結構，事實上，在分離和表征高純度低聚物方面存在許多實際困難。因此，目前采用高分辨質(zhì)譜法很難對花青素B單個分子進行鑒定或結構表征。

前期的實驗研究表明，鎖陽乙酸乙酯部位具有改善癡呆所致認知功能障礙的作用[7-9]，此次通過采用有效，簡便快速的分析方法對該部位化學成分進行分析鑒定，為進一步從該部位總分離出藥效活性成分提供科學依據(jù)。

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