刺糖多糖對小鼠腹腔巨噬細胞核轉(zhuǎn)錄因子、絲裂原活化蛋白激酶及氨基末端激酶信號通路相關基因和蛋白表達的影響

向 陽，楊晨晨,韓曾嬌，常軍民

(1.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，新疆 烏魯木齊 830054；3.新疆醫(yī)科大學藥學院，新疆 烏魯木齊 830011)

刺糖為駱駝刺的分泌物[1]。多糖是一種毒性極小的藥物，其作為廣譜免疫促進劑，具有抗感染、抗凝血、降血糖、降血脂、促進生物合成等特點[2-5]，被認為是天然化合物保健品。刺糖中的多糖即刺糖多糖在降血糖、抗氧化、免疫活性、抗腫瘤方面具有重要的研究價值[6-10]。信號通路是多糖參與免疫調(diào)節(jié)機制的一個重要途徑，本研究主要探討不同濃度刺糖多糖對小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7中絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路中的細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1(extracellular regulated protein kinases，ERK1)、ERK2及c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信號通路中的JNK1、JNK2、JNK3和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor，NF-κB)信號通路中的NF-κB、p65、p38 mRNA與蛋白表達的影響，為研究刺糖多糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)機制的信號通路提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；刺糖藥材購自新疆維吾爾民族醫(yī)院(批號：20140801)，由新疆醫(yī)科大學天然藥物化學教研室帕麗達教授鑒定為刺糖(Alhagi-honey)；Fast Quant RT Kit(With gDNase)、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid disodium，BCA)蛋白定量試劑盒(PA115-02)購自天根生化科技(北京)有限公司，SYBR Select Master Mix(4472920)購自美國ABI公司，放射免疫沉淀試驗(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液(AR0105)、蛋白酶抑制劑(AR1178)購自武漢博士德生物工程有限公司，Anti-NF-κB p65、Anti-JNK1+JNK2+JNK3、Anti-p-(ERK1/2)、Anti-(ERK1/2)、Anti-p38MAPK購自英國Abcam公司，磷酸化p38 MAPK (phospho-p38 MAPK，p-p38 MAPK)(Thr180/Tyr182)購自德國CST公司;漩渦混合器(JK-41B)、核酸蛋白定量儀(K3507)購自美國Millipore公司，化學發(fā)光成像儀系統(tǒng)(MUA2-7E)購自德瑞儀器有限公司，蛋白轉(zhuǎn)膜儀(Mini-PROTEAN Tetra system)購自美國Bio-Rad公司，纖維素柱色譜(DEAE sepharose CL-6B)、葡聚糖凝膠柱色譜(Sephadex G-100)購自北京冬歌生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 刺糖多糖的制備原藥材刺糖經(jīng)過水提醇沉、石油醚脫脂、水浴回流提取、減壓濃縮得到刺糖粗多糖，體積分數(shù)50%醇沉提刺糖粗多糖,依次通過AB-8大孔吸附樹脂、纖維素柱色譜、葡聚糖凝膠柱色譜，0.1 mol·L-1的NaCl溶液進行洗脫，濃縮干燥得到刺糖多糖粉末。將刺糖多糖粉末使用達爾伯克必需基本培養(yǎng)基細胞完全培養(yǎng)液稀釋為0.0、12.5、50.0、100.0 mg·L-1刺糖多糖溶液備用。

1.2.2 細胞培養(yǎng)將細胞置于37 ℃、含體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取處于對數(shù)生長期的巨噬細胞RAW264.7，使用達爾伯克改良伊格爾完全培養(yǎng)液稀釋至1×108L-1，接種至24孔細胞培養(yǎng)板，每孔加500 μL細胞混懸液，24 h后棄去培養(yǎng)液。將細胞分為0.0、12.5、50.0、100.0 mg·L-1刺糖多糖組，加入500 μL相應濃度的刺糖多糖溶液，置于37 ℃、含體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后終止，每組設4個復孔。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time fluorescence polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測巨噬細胞RAW264.7中ERK1、ERK2、JNK1、JNK2、JNK3、NF-κB p65、p38 mRNA表達采用TRIzol法提取各組細胞中RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用qRT-PCR法檢測各組細胞中ERK1、ERK2、JNK1、JNK2、JNK3、NF-κB p65、p38 mRNA表達。ERK1上游引物序列為5′-TCCTTTTGGATCTGGTCCTG-3′，下游引物序列為5′-CCCCAGCAAAGTGAGAGAAG-3′；ERK2上游引物序列為5′-GGTTGTTCCCAAATGCTGAC-3′，下游引物序列為5′GAGCCTGTTCAACTTCAATCC-3′；JNK1上游引物序列為5′-TCTGTTAGTCAGCGGAGCG-3′，下游引物序列為5′-GGCCGCTACTCAATCCTGTT-3′；JNK2上游引物序列為5′-TGGGGTAAAAGACCA-GCCTTC-3′，下游引物序列為5′-TGGGGTAAAAGA-CCAGCCTTC-3′；JNK3上游引物序列為5′-GTCTCCC-TCCATCCTCGTCTG-3′，下游引物序列為5′-CGGCTAGTCACCTGCAACAAC-3′；NF-κB p65上游引物序列為5′-GGACCCTGACCATGGACGAT-3′，下游引物序列為5′-AGCGCCCCTCGCATTTATAG-3′；p38上游引物序列為5′-CACGACCCTGATGAT-GAGCC-3′，下游引物序列為5′-GGTGGCACAAAGC-TGATGAC-3′。20 μL反應體系：SYBR Select Master Mix 10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8.2 μL。循環(huán)條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，退火溫度60 ℃，退火與延伸1 min。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)源參照，分析各目的基因的相對表達量。

1.2.4 Western blot法檢測巨噬細胞RAW264.7中p-p38、p38、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-ERK1/ERK2、ERK1/ERK2、p-JNK1/2/3、JNK1/2/3蛋白表達收集各組細胞，加入800 μL含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，充分混勻。4 ℃放置60 min后冰上勻漿，以 12 000 r·min-1，4 ℃離心15 min，收集上清液；采用BCA法測定蛋白濃度并標準化。將樣品加入上樣緩沖液，煮沸 5 min，蛋白變性后上樣，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜。于50 g·L-1奶粉中室溫封閉2 h；將膜轉(zhuǎn)入含50 g·L-1牛奶的一抗溶液中，一抗?jié)舛确謩e為p-p38(11 000)、p38(1500)、p-NF-κB p65(1300)、NF-κB p65(1500)、p-ERK1/ERK2(1500)、ERK1/ERK2(1500)、p-JNK1/2/3(1500)、JNK1/2/3(1500)，4 ℃孵育過夜；去一抗，洗膜并加入二抗于室溫孵育1 h。轉(zhuǎn)膜后用ChemiScope mini化學發(fā)光儀檢測、拍照。通過Western blot實驗結(jié)果得到經(jīng)過刺糖多糖干預后各基因表達量的條帶圖，蛋白相對表達量=各基因表達條帶吸光度值/內(nèi)參條帶吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7中ERK1、ERK2、JNK1、JNK2、JNK3、NF-κB p65、p38 mRNA相對表達量比較結(jié)果見表1。刺糖多糖干預巨噬細胞24 h后，與0.0 mg·L-1刺糖多糖組比較，50.0、100.0 mg·L-1刺糖多糖組細胞中ERK1、NF-κB p65 mRNA表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；12.5、50.0、100.0 mg·L-1刺糖多糖組細胞中p38 mRNA表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與12.5 mg·L-1刺糖多糖組比較，50.0、100.0 mg·L-1刺糖多糖組細胞中ERK1、p38、NF-κB p65 mRNA表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。100.0 mg·L-1與50 mg·L-1刺糖多糖組細胞中ERK1、p38、NF-κB p65 mRNA表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。0.0、12.5、50.0、100.0 mg·L-1刺糖多糖組細胞中ERK2、JNK1、JNK2、JNK3 mRNA表達量組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 不同濃度刺糖多糖干預后小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7中ERK1、ERK2、JNK1、JNK2、JNK3、NF-κB p65、p38 mRNA相對表達量比較

組別ERK1ERK2JNK1JNK2JNK3p38NF-κB p650.0 mg·L-1刺糖多糖組1.007±0.162 1.017±0.230 1.030±0.289 1.017±0.203 1.007±0.124 1.003±0.150 1.017±0.237 12.5 mg·L-1刺糖多糖組1.650±0.4601.093±0.0151.080±0.1021.183±0.6540.987±0.1721.373±0.059a1.257±0.07450.0 mg·L-1刺糖多糖組2.110±0.622ab1.190±0.2590.993±0.1801.200±0.0891.097±0.0911.700±0.115ab1.887±0.165ab100.0 mg·L-1刺糖多糖組2.267±0.283ab1.323±0.1441.060±0.1801.107±0.1361.083±0.2102.000±0.254ab2.087±0.336ab

注：與0.0 mg·L-1刺糖多糖組比較aP<0.05；與12.5mg·L-1刺糖多糖組比較bP<0.05。

2.2 4組小鼠腹腔巨噬細胞RAN264.7中p-p38、p38、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-ERK1/ERK2、ERK1/ERK2、p-JNK1/2/3、JNK1/2/3蛋白相對表達量比較結(jié)果見表2和圖1。與0.0、12.5 mg·L-1刺糖多糖組比較，50.0、100.0 mg·L-1刺糖多糖組細胞中p-p38、p-NF-κB p65、p-ERK1/ERK2、ERK1/ERK2蛋白表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。100.0 mg·L-1刺糖多糖組與50.0 mg·L-1刺糖多糖組細胞中p-p38、p-NF-κB p65、p-ERK1/ERK2、ERK1/ERK2表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。0.0、12.5、50.0、100.0 mg·L-1刺糖多糖組細胞中p38、NF-κB p65、p-JNK1/2/3、JNK1/2/3蛋白表達量組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 不同濃度刺糖多糖干預后小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7中p-p38、p38、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-ERK1/ERK2、ERK1/ERK2、p-JNK1/2/3、JNK1/2/3蛋白相對表達量比較

組別p-p38p38p-NF-κB p65NF-κB p65p-ERK1/ERK2ERK1/ERK2p-JNK1/2/3JNK1/2/30.0 mg·L-1刺糖多糖組0.319±0.0450.697±0.0060.439±0.0880.887±0.0050.410±0.0621.060±0.0020.478±0.0101.037±0.05912.5 mg·L-1刺糖多糖組0.499±0.0400.689±0.0530.477±0.0500.854±0.0520.464±0.0331.009±0.0550.490±0.0090.963±0.00350.0 mg·L-1刺糖多糖組0.680±0.127ab0.772±0.1150.753±0.141ab0.897±0.0420.680±0.065ab1.022±0.010ab0.461±0.0390.946±0.021100.0 mg·L-1刺糖多糖組0.673±0.071ab0.720±0.0470.849±0.026ab0.871±0.0520.714±0.019ab1.076±0.035ab0.476±0.0220.982±0.066

注：與0.0 mg·L-1刺糖多糖組比較aP<0.05；與12.5 mg·L-1刺糖多糖組比較bP<0.05。

A1、A2:0.0 mg·L-1刺糖多糖組；B1、B2：12.5 mg·L-1刺糖多糖組；C1、C2：50.0 mg·L-1刺糖多糖組；D1、D2：100.0 mg·L-1刺糖多糖組。

圖1 不同濃度刺糖多糖組小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7中p-p38、p38、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-ERK1/ERK2、ERK1/ERK2、p-JNK1/2/3、JNK1/2/3蛋白的表達

Fig.1 Expression of p-p38,p38,p-NF-κB p65,NF-κB p65,p-ERK1/ERK2,ERK1/ERK2,p-JNK1/2/3,JNK1/2/3 proteins in peritoneal macrophages of mice in the groups of different concentrations of polysaccharides

3 討論

真核細胞內(nèi)普遍存在的2種介導炎癥反應的信號級聯(lián)途徑是MAPK信號轉(zhuǎn)導通路和NF-κB信號通路[11-12]。哺乳動物體內(nèi)存在3條與炎癥密切相關的經(jīng)典MAPK信號轉(zhuǎn)導通路，即p38通路、ERK通路和JNK通路。相關研究發(fā)現(xiàn)，激活p38/MAPK通路中特定細胞將導致細胞增殖被抑制，p38α還可以誘導細胞周期進入靜止期，并促進DNA修復，從而抵抗化學治療誘導的DNA損傷，p38β在各種細胞系中有抗凋亡效果，且可能直接影響腫瘤浸潤和遷移[13-14]。MAPK家族主要成員ERK1/2、JNK1/2和p38MAPK均可參與對炎癥的調(diào)控[15]。NF-κB是調(diào)控免疫應答的一組多效型轉(zhuǎn)錄因子，其主要發(fā)揮調(diào)控細胞增殖與凋亡、免疫炎癥反應的作用，在巨噬細胞激活中具有重要作用。

本研究探討刺糖多糖對巨噬細胞RAW264.7的影響及可能的調(diào)控機制，應用Western blot及qRT-PCR檢測p38/MAPK和NF-κB等信號通路活化情況。通過Western blot實驗結(jié)果得到經(jīng)過刺糖多糖干預后各基因表達量的條帶圖，從p-p38和p38表達量條帶圖中可以看出，各濃度刺糖多糖干預巨噬細胞RAW264.7后，可誘導p38磷酸化水平明顯上升。在0.0～100.0 mg·L-1的濃度范圍內(nèi)，條帶逐漸加深，隨著刺糖多糖濃度的升高，p-p38蛋白表達量明顯升高，呈劑量相關性。本研究結(jié)果顯示，50.0、100.0 mg·L-1刺糖多糖組細胞中ERK1、NF-κB p65 mRNA表達量高于0.0 mg·L-1刺糖多糖組；12.5、50.0、100.0 mg·L-1刺糖多糖組細胞中p38 mRNA表達量高于0.0 mg·L-1刺糖多糖組；50.0、100.0 mg·L-1刺糖多糖組細胞中ERK1、p38、NF-κB p65 mRNA表達量高于12.5 mg·L-1刺糖多糖組；50.0、100.0 mg·L-1刺糖多糖組細胞中p-p38、p-NF-κB p65、p-ERK1/ERK2、ERK1/ERK2蛋白表達量高于0.0、12.5 mg·L-1刺糖多糖組，說明刺糖多糖干預巨噬細胞RAW264.7 24 h后激活了MAPK信號通路和NF-κB信號通路，誘導p38、NF-κB p65、ERK1 mRNA表達水平呈濃度梯度升高，上調(diào)p38、NF-κB p65、ERK1/2蛋白的磷酸化水平，而JNK mRNA和蛋白水平無顯著變化，提示刺糖多糖可能參與了MAPK和NF-κB信號通路，但不參與JNK信號通路。

綜上所述，刺糖多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用，調(diào)控著基因和增殖相關蛋白的表達，且能上調(diào)巨噬細胞RAW264.7中NF-κB和MAPK信號通路中相關因子表達水平。進一步深入研究刺糖多糖參與激活巨噬細胞的其他信號通路，對于多糖類免疫調(diào)節(jié)劑的開發(fā)具有指導意義。