腦脈醒神膠囊提取工藝研究

張 瑜，曾聰彥，卓 斌，胡玉良，肖凌婷，辛?xí)苑?，董杰?/p>

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山中醫(yī)院，廣東中山528400）

腦脈醒神膠囊是在我院臨床使用多年的有效經(jīng)驗(yàn)方基礎(chǔ)上制成的醫(yī)院制劑（粵藥制字Z20130020），由大黃、桃仁、紅花、丹參、黃芩、梔子、厚樸、法夏、茯苓、膽南星、竹茹等中藥組成，其中大黃有瀉下通腑兼活血化瘀之功，為方中君藥，與桃仁、紅花、丹參等臣藥相伍，使諸藥活血化瘀開竅之功大顯其威，使“血瘀”遁去；痰、瘀、熱內(nèi)結(jié)，壅于腸腑，致腑氣不通、燥屎內(nèi)結(jié)，因此大黃與厚樸、芒硝成大承氣湯，直清陽明腑實(shí)，推陳出新；石菖蒲芳香辟穢，通竅醒神助麝香通諸竅；法半夏、膽南星、茯苓、竹茹健脾化痰開竅醒神；黃芩、山梔性辛涼苦寒，清熱涼血化瘀，除三焦之熱；諸藥合用共奏活血化瘀、化痰開竅、通腑瀉熱、開竅醒腦之功［1]。根據(jù)腦脈醒神膠囊方中各藥有效成分及性質(zhì)進(jìn)行分析，同時(shí)考慮醫(yī)院中藥制劑生產(chǎn)的特點(diǎn)，配制工藝采用君藥大黃醇提，有利于提取大黃蒽醌類成分［2-3]，其余藥味桃仁、紅花、丹參、黃芩、梔子、厚樸等采用水提的方法。以上主要藥味醇提、水提工藝的合理與否將直接影響成品質(zhì)量，進(jìn)而影響臨床療效，故本文對大黃醇提及其余藥味水提工藝進(jìn)行了研究，篩選出合理可行的提取工藝。

1 材 料

Agilent 1236型高效液相色譜儀（美國安捷倫）；UV2550紫外可見分光光度計(jì)（日本島津）；BS-224S型電子天平（德國賽多利斯）；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）；東方-A型直熱式電熱恒溫干燥箱（廣州東方電熱干燥設(shè)備廠）；大黃素對照品（中國藥品生物制品檢定所提供，批號110756-200110），苦杏仁苷對照品（中國藥品生物制品檢定所提供，批號 110820－201607）；大黃、桃仁、紅花、丹參、黃芩、梔子、厚樸、法夏、茯苓、膽南星、竹茹等藥材均購于廣東廣弘藥材有限公司，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山中醫(yī)院梅全喜教授鑒定，均符合《中國藥典》2015年版各藥材項(xiàng)下規(guī)定，甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其余所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 大黃醇提工藝研究

2.1.1 大黃總蒽醌含量的測定［4－5]

2.1.1.1 對照溶液的制備 精密稱取大黃素對照品5.26mg，加0.8%醋酸鎂甲醇液溶解并定容至50mL，即得大黃素對照液（0.105 2mg/mL）。

2.1.1.2 供試品溶液的制備 精密吸取各號提取液 1 mL，水浴揮干，加冰醋酸－25%鹽酸（10∶21）15 mL使溶解，沸水浴中回流1 h，立即置冰水浴中冷卻，用乙醚萃取5次，15mL/次，合并萃取液，加無水硫酸鈉脫水后，濾過，揮干，加0.8%醋酸鎂甲醇液溶解，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，用0.8%醋酸鎂甲醇液定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.1.3 最佳測定波長的確定 取大黃素對照液適量，水浴揮干，以0.8%醋酸鎂甲醇溶液溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜?0 mL，搖勻；以0.8%醋酸鎂甲醇溶液作參比溶液，在400～600 nm波長范圍內(nèi)分別對大黃素對照液和供試品溶液進(jìn)行掃描，兩者在505 nm處均有最大吸收，故選擇505 nm作為測定波長。結(jié)果見圖1。

圖1 大黃素吸收光譜圖

2.1.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取大黃素對照品溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 置蒸發(fā)皿中，揮干，以0.8%醋酸鎂甲醇溶液洗滌殘?jiān)?，定容?5mL，搖勻。以醋酸鎂甲醇溶液為空白，在505 nm測定吸收度（A），以大黃素對照液濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），吸收度（A）為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y=24.42X－0.865，r=0.998 7。結(jié)果表明大黃素對照液濃度在4.208～42.08μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2 單因素試驗(yàn)

2.1.2.1 乙醇濃度考察 取大黃藥材飲片100 g，共4份，分別加8倍量對應(yīng)濃度乙醇溶液（30%、50%、70%、90%），加熱回流提取 30min，濾過，減壓濃縮并定容至100mL，即得。照大黃總蒽醌含量測定法進(jìn)行測定。結(jié)果見表1。

表1 乙醇濃度單因素考察結(jié)果

從表1中可以看出，隨著乙醇濃度的增加，大黃總蒽醌含量逐漸增高，乙醇濃度為70%時(shí)總蒽醌含量有最大值，因此，大黃回流提取法乙醇濃度以70%左右為宜。70%乙醇濃度可以是60%，也可以是80%，因此，選擇還需60%、70%、80%這3個(gè)濃度水平進(jìn)一步安排正交考察。

2.1.2.2 提取時(shí)間考察 取大黃藥材飲片100 g，共4份，加70%乙醇8倍量，加熱回流提取10、30、50、70min，濾過，減壓濃縮并定容至100mL，即得。照大黃總蒽醌含量測定法進(jìn)行測定。結(jié)果見表2。

表2 提取時(shí)間單因素考察結(jié)果

從表2中可以看出，隨著提取時(shí)間的增加，總蒽醌的濃度逐漸增大，當(dāng)提取時(shí)間為30 min，提取較充分，與50min和70min兩組相比，相差不大。因此，大黃回流提取時(shí)間確定為30min。

2.1.2.3 乙醇用量考察 取大黃藥材飲片100 g，共 4 份，分別加 70%乙醇溶液 4、6、8、10 倍量，加熱回流提取30min，濾過，減壓濃縮并定容至100mL，即得。照大黃總蒽醌含量測定法進(jìn)行測定。結(jié)果見表3。

表3 乙醇用量單因素考察結(jié)果

從表3中可以看出，隨著加液倍量的增加，總蒽醌的濃度逐漸增大，當(dāng)加液倍量為8倍量時(shí)，提取較充分，與10倍量相比，相差不大，可對其做進(jìn)一步的正交考察。

2.1.3 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，選取乙醇濃度（A），提取次數(shù)（B），乙醇用量（C）作為考察因素，各取3水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，篩選最佳工藝條件。以大黃總蒽醌的提取率為考察指標(biāo)，篩選最佳醇提工藝。因素水平見表4，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表5。

表4 因素水平表

表5 試驗(yàn)安排及結(jié)果

方差分析結(jié)果見表6。

表6 方差分析結(jié)果

對大黃總蒽醌提取工藝的數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀分析（表 5），可知，影響因素順序?yàn)?B＞A＞C，即提取次數(shù)對大黃總蒽醌提取率影響最大，其次為乙醇濃度，再次為乙醇用量，最佳提取工藝組合為A2B3C3。由表6可見，因素B（提取次數(shù)）各水平之間有顯著差異（P＜0.05），因素 A（乙醇濃度）和因素 C（乙醇用量）各水平間無顯著性差異（P ＞0.05）。鑒于C（乙醇用量）對提取效果無顯著性影響，為降低成本，將C3改為C2，由此確定大黃總蒽醌最佳提取工藝為A2B3C2，結(jié)合單因素提取時(shí)間考察結(jié)果，得出大黃最佳醇提工藝為藥材飲片加70%乙醇6倍量，加熱回流提取3次，每次30min。

2.1.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 為確定該工藝的優(yōu)劣和穩(wěn)定性，據(jù)所篩選的最佳條件，驗(yàn)證3批，結(jié)果見表7。由表可知，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與正交試驗(yàn)優(yōu)選結(jié)果吻合，說明正交試驗(yàn)選出的工藝條件合理，工藝條件穩(wěn)定可行。

表7 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.2 水提工藝研究

2.2.1 因素與考察指標(biāo)確定 依據(jù)中藥水提經(jīng)驗(yàn)，確定提取次數(shù)、提取時(shí)間、加水倍量等為水提效果的主要因素，以方中藥材中主要指標(biāo)成分苦杏仁苷提取率和干膏得率為考察指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2.2 樣品的制備 按處方比例稱取1/20處方量的桃仁、紅花、丹參、黃芩、梔子、厚樸、法夏、茯苓、膽南星、竹茹等藥味，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法進(jìn)行提取，濾過，濾液濃縮并定容至250mL，備用。

2.2.3 總固體物的測定 精密吸取各樣品濃縮液20 mL，至已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，照干燥失重法（中國藥典2015年版四部通則0831）測定，計(jì)算干膏得率，公式如下：

W為20 mL濃縮液中干浸膏重量，V為定容體積，Wt為藥材重量。

2.2.4 苦杏仁苷的含量測定

2.2.4.1 色譜條件［6]色譜柱：Kromasil 100－5 C18柱（4.6×250mm，5 μm）；流動相：水－甲醇（82∶18）；檢測波長：210 nm；流速：1mL/min；柱溫：30 ℃。

2.2.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取苦杏仁苷對照品適量，加70%甲醇制成每1mL含苦杏仁苷 74.5 μg的溶液，即得。

2.2.4.3 供試品溶液的制備 精密吸取樣品溶液1mL置25mL量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，搖均，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.4.4 陰性樣品溶液的制備 稱取除桃仁外的藥材加10倍量水，煎煮2次，1.5 h/次，藥液濾過，合并濾液，濃縮并定容至250mL，取1mL濃縮液，自供試品溶液的制備項(xiàng)下“取樣品溶液1mL”起同法操作，制得陰性樣品溶液。

2.2.4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取苦杏仁苷對照品溶液（74.5 μg/mL）1，2，4，6，8，10，15 μL 進(jìn)樣，記錄色譜圖，測定其峰面積，并以峰面積（Y）對進(jìn)樣量（X）進(jìn)行回歸，得回歸方程：Y=0.8549X+2.912 6，r=0.999 5。結(jié)果表明：在0.074 5～1.117 5 μg范圍內(nèi)，苦杏仁苷峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4.6 陰性干擾的判斷 吸取上述對照品、供試品及陰性對照溶液各10μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果顯示，陰性對照圖譜與對照品、供試品圖譜中苦杏仁苷相應(yīng)的保留時(shí)間無其他峰干擾，表明選擇性良好，陰性無干擾。結(jié)果見圖2。

圖2 高效液相色譜圖

2.2.4.7 樣品含量測定 精密吸取各供試品溶液各10μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，根據(jù)供試品吸收度積分值與對照品積分值，外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算，即得。

2.2.5 單因素試驗(yàn)

2.2.5.1 提取時(shí)間的考察 按處方量取黃芩、梔子等藥味共5份，各加水8倍量，煎煮1次，分別煎煮20、40、60、80、120min，濾過，濃縮定容至250 mL，測定苦杏仁苷含量和得膏率。結(jié)果見表8。

表8 提取時(shí)間考察結(jié)果表

表8結(jié)果表明，苦杏仁苷的提取率在提取60 min左右時(shí)可以達(dá)到最大，隨著時(shí)間的延長，苦杏仁苷的提取率反而降低，這可能同苦杏仁苷對熱不穩(wěn)定，長時(shí)間加熱導(dǎo)致其破壞有關(guān)；而干膏得率隨著提取時(shí)間的延長呈增加態(tài)勢。確定本工藝的提取時(shí)間為60min。

2.2.5.2 加水倍量的考察 按處方量取黃芩、梔子等藥味共 5 份，分別加水 4、6、8、10、12 倍量，加熱回流提取2次，60 min/次，濾過，合并濾液，藥液濃縮定容至250mL，測定苦杏仁苷提取率和得膏率。結(jié)果見表9。

表9 加水量考察結(jié)果表

表9結(jié)果表明，8倍水量苦杏仁苷提取率達(dá)90%，干膏得率與10倍水量和12倍水量相比無明顯差異，本著節(jié)能減耗的原則，確定本工藝加水量為8倍。

2.2.5.3 提取次數(shù)的考察 按處方量取黃芩、梔子等藥味1份，每次加8倍量水提取1 h，提取3次，分別收集3次提取液，濃縮定容至250 mL，即得。測定苦杏仁苷提取率和得膏率。結(jié)果見表10。

表10 提取次數(shù)考察結(jié)果表 （n=3）

表10結(jié)果表明，隨著提取次數(shù)的增加，苦杏仁苷的提取率和干膏得率都呈降低態(tài)勢，提取2次和提取1次相比，苦杏仁苷的提取率和干膏得率都呈顯著性降低，而提取3次和提取2次相比，降低并不明顯，考慮到節(jié)約工時(shí)和效益最大化，確定以提取2次為宜。

2.2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 由上述試驗(yàn)確立最佳提取工藝為，藥材水提取兩次，每次加水8倍量，1.0 h/次。按上述確立工藝進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，結(jié)果見表11。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，該工藝條件合理，可行，重現(xiàn)性好。

表11 提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

科學(xué)合理地選擇中藥復(fù)方的提取工藝是保持原方療效的關(guān)鍵和核心，也是中藥劑型改進(jìn)和創(chuàng)新的前提和基礎(chǔ)。腦脈醒神膠囊是在其湯劑基礎(chǔ)上改進(jìn)而成的，處方復(fù)雜，各藥味所含有效成分理化性質(zhì)各異，有針對性地將提取工藝分為大黃醇提和其余藥材水提，這樣能夠較好地提取有效成分并保留藥物的藥理活性成分［7]，更好地發(fā)揮藥效。

在大黃醇提工藝中，首先通過單因素試驗(yàn)初步考察了乙醇濃度、提取時(shí)間、乙醇用量對大黃總蒽醌提取效率的影響，確定了提取時(shí)間為30min，選擇出了正交試驗(yàn)的三因素三水平。然后用正交試驗(yàn)法考察了乙醇濃度、提取次數(shù)、乙醇用量三因素對大黃總蒽醌提取效率的影響，最終確定了最佳的大黃醇提工藝條件，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明優(yōu)選的大黃醇提工藝穩(wěn)定可行。

在水提工藝優(yōu)選中，以苦杏仁苷和干浸膏得率作為考察指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)考察了影響中藥復(fù)方制劑水提的提取次數(shù)、提取時(shí)間、加水倍量幾大主要因素，最終也較好地確定了其最佳的水提工藝條件，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明優(yōu)選的水提工藝穩(wěn)定可行。此外，現(xiàn)代藥理研究表明，苦杏仁苷具有多種生物學(xué)效應(yīng)，如具有抗腦缺血與抑制血小板聚集作用，能明顯提高腦缺血狀態(tài)下細(xì)胞色素氧化酶的活力，改善能量代謝，延長細(xì)胞生存時(shí)問，促進(jìn)組織細(xì)胞代謝及功能恢復(fù)和組織修復(fù)［8-9]，這與腦脈醒神膠囊有活血化瘀、開竅醒腦的主要作用相同，應(yīng)為該制劑中主要有效成分之一，故選擇苦杏仁苷作為工藝優(yōu)選的考察指標(biāo)是合理、可行的。