銀杏內酯K通過抑制小膠質細胞介導的炎性反應保護髓鞘

苗 強 ，張曉雪 ，陰俊俊 ，任思思 ，韓慶賢 ，于婧文 ，李俊蓮 ，尉杰忠 ，肖保國 ，馬存根 ，

（1.山西中醫(yī)藥大學國家中醫(yī)藥管理局多發(fā)性硬化益氣活血重點研究室、神經(jīng)生物學研究中心，山西晉中030619；2.山西大同大學腦科學研究所，中樞神經(jīng)炎癥變性疾病新藥創(chuàng)制省市共建山西省重點實驗室培育基地，山西大同037009；3.復旦大學附屬華山醫(yī)院，上海200025）

多發(fā)性硬化（Multiple sclerosis，MS）是一種自身免疫介導的炎性脫髓鞘疾病［1]。對于多發(fā)性硬化中醫(yī)典籍尚無明確記載，當代醫(yī)家對MS的辨證論治主要依據(jù)其臨床癥狀，各自的認識也不盡相同。一般來說，MS的發(fā)病是在先天稟賦不足的基礎上，受毒邪侵擾，導致絡脈瘀阻，產生病變［2－3]。盡管MS的病因病機尚不完全清楚，但本虛標實是其基本的病理特征，本虛可見腎虛、氣虛、氣血兩虛等虛證，標實則以絡脈瘀阻為主［3－5]。血瘀證是 MS常見證型之一，活血可顯著改善MS臨床征象［6]。

活血化瘀通絡是銀杏葉的主要功效［7]。在中國，銀杏葉提取物常被制成口服藥片和膠囊或注射用針劑用于缺血性心腦血管疾病，如心絞痛和中風［8]。銀杏內酯 K（Ginkgolide K，GK）是一種從銀杏葉提取物中分離的萜類物質。研究發(fā)現(xiàn)，GK能有效減少缺血性腦卒中大鼠的腦梗死區(qū)域和腦水腫，改善神經(jīng)功能缺損評分［9]。GK還可以通過激活肌醇需求酶1α/X盒結合蛋白通路保護心臟［10]。然而，目前還沒有關于GK是否能夠保護髓鞘的報道。

CPZ誘導的脫髓鞘常被用來模擬人類MS［11]。CPZ可選擇性螯合線粒體復合體IV中的銅離子，導致成熟的少突膠質細胞因能量代謝紊亂而死亡，最終造成髓鞘脫失。目前，髓鞘保護或髓鞘再生的確切機制尚未完全闡明，市場也缺乏髓鞘保護或再生的治療藥物。因此，本研究利用CPZ誘導的脫髓鞘，探討了GK在脫髓鞘疾病中的髓鞘保護能力和治療潛力，并分析了其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 24只雄性C57BL/6小鼠（10～12周齡），體質量20～25 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于山西中醫(yī)藥大學清潔級動物實驗室。實驗開始前所有小鼠先適應性喂養(yǎng)1 w。

1.1.2 實驗試劑 雙環(huán)己酮草酰雙腙（Cuprizone，CPZ）購于美國Sigma公司；抗髓磷脂堿性蛋白（MBP）抗體、抗誘導型一氧化氮合酶（iNOS）抗體和抗精氨酸酶1（Arg－1）抗體購自Abcam公司，抗Iba－1抗體購自日本W(wǎng)ako公司；腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、白介素－1β（IL－1β）、白介素－6（IL－6）、白介素－10（IL－10）和轉化生長因子－β（TGF－β）試劑盒購于R&D System；Alexa Flour 488標記的羊抗兔IgG和HRP標記的羊抗兔IgG購自康維公司。GK由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司友好提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與給藥 將小鼠隨機分成正常組（Norma）l、CPZ組和GK組3組，每組8只。CPZ按0.2%（質量分數(shù)）的比例與飼料混合，CPZ組和GK組小鼠投食含CPZ的飼料，正常組投食普通飼料，累計6w。按10mg/mL的比例將GK用PEG400超聲5min溶解，隨后用生理鹽水稀釋到2μg/μL。CPZ喂食4 w后，GK組小鼠每只腹腔注射GK溶液200μL（20 mg/kg），CPZ組和正常組小鼠腹腔注射等體積的PEG400和生理鹽水混合溶液，直到實驗結束，累計2 w。

1.2.2 組織準備 每組一半小鼠用10%水合氯醛深度麻醉，并用生理鹽水經(jīng)心臟內灌注，然后用4%多聚甲醛固定。取出腦組織分別浸泡在濃度為15%、25%和30%的蔗糖溶液中梯度脫水，隨后OTC包埋組織，使用低溫切片機對腦組織進行切片，厚度為10μm。腦切片儲存在－80℃的冰箱，用于免疫熒光染色。各組的另一半小鼠麻醉后，僅進行生理鹽水心臟內灌注，分離腦組織并儲存于－80℃的冰箱，隨后進行組織勻漿用于Western blot和ELISA檢測。

1.2.3 免疫熒光染色 首先從－80℃冰箱中取出腦組織切片室溫復溫30min，然后用1%BSA/PBS在室溫下封閉30 min，洗凈封閉液后分別添加兔抗 MBP（1∶500）和兔抗 Iba－1（1∶500）4 ℃孵育過夜，次日洗凈一抗，按1∶1 000的比例添加山羊抗兔IgG，在室溫下孵育2 h。隨后洗凈二抗，50%甘油封片。CPZ組參照上述步驟，但不添加一抗。用熒光顯微鏡獲取免疫熒光圖像，通過Image－Pro Plus 6.0軟件進行分析和定量。

1.2.4 Western Blot檢測 腦組織經(jīng) RIPA 裂解液裂解，BCA法測定蛋白濃度。用10%SDS－PAGE凝膠電泳分離蛋白，上樣量為40μg。電泳條件為濃縮膠100 V 20min，分離膠150 V 40min。甲醇活化PVDF膜，隨后用標準濕式轉膜裝置額定電流200mA轉膜2 h。取出蛋白膜5%脫脂奶粉封閉，隨后用抗 iNOS 抗體（1∶1 000）和抗 Arg－1（1∶1 000）抗體4℃孵育過夜，Tubulin作為內參。次日TBST洗膜后，用HRP標記的二抗室溫孵育2 h，然后重復洗膜步驟，經(jīng)化學發(fā)光顯色液顯色。

1.2.5 ELISA檢測 ELISA實驗采用雙抗夾心法，根據(jù)試劑盒說明書操作，分別檢測各組小鼠腦組織中 TNF－α、IL－1β、IL－6、IL－10 和 TGF－β 的濃度。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有的實驗結果都基于3次獨立實驗，數(shù)據(jù)分析運用GraphPad Prism 7軟件。多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用Tukey檢驗或者t檢驗。數(shù)據(jù)結果表示為均值±SEM，并設定P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 GK減少了CPZ導致的髓鞘脫失

MBP是髓鞘的主要蛋白成分，CPZ導致的小鼠脫髓鞘主要集中在腦胼胝體區(qū)。我們采用免疫熒光染色觀察小鼠胼胝體區(qū)的MBP表達情況。結果顯示，與正常組相比，CPZ組小鼠胼胝體區(qū)MBP 熒光強度顯著降低（P＜0.01），表明 CPZ 造成了小鼠嚴重的髓鞘脫失。而與CPZ組相比，GK組小鼠胼胝體區(qū)MBP熒光強度明顯增加（P＜0.05），這表明GK有效改善了CPZ誘導的髓鞘脫失，顯示出對脫髓鞘疾病的治療潛力。結果見圖1。

圖1 GK減少了CPZ誘導的脫髓鞘小鼠的髓鞘脫失

2.2 GK減少了小膠質細胞的活化

CPZ喂食6 w后，小鼠胼胝體中Iba－1+小膠質細胞的數(shù)量顯著增加，GK組則明顯下降。與正常小鼠相比，用CPZ喂養(yǎng)的小鼠胼胝體區(qū)Iba－1+小膠質細胞的數(shù)量增加（P＜0.001）。相反，GK 明顯抑制了胼胝體中Iba－1+小膠質細胞的數(shù)量（P＜0.01）。表明小膠質細胞可能參與了中樞脫髓鞘病程。結果見圖2。

圖2 GK減少了CPZ誘導的脫髓鞘小鼠胼胝體小膠質細胞的活化

2.3 Western Blot檢測 iNOS 和 Arg－1 的表達

活化的小膠質細胞可以分化為M1型和M2型，其中M1型主要表達iNOS，分泌促炎細胞因子；M2型主要表達Arg－1，分泌抗炎細胞因子。我們通過Western Blot法檢測小鼠腦組織中iNOS和Arg－1的表達，觀察小膠質細胞的亞型表達情況。結果顯示，與正常組相比，CPZ誘導的脫髓鞘小鼠腦組織 iNOS 的表達明顯升高（P＜0.001），Arg－1 的表達明顯下降（P＜0.001）；與 CPZ 組相比，GK降低了 iNOS 的表達（P＜0.001），相反促進了 Arg－1的表達（P＜0.001）。表明 GK 促進了活化的小膠質細胞向抗炎型分化。結果見圖3。

2.4 ELISA檢測各組小鼠腦組織中細胞因子的濃度

圖3 GK對iNOS和Arg－1的影響

我們用ELISA法測量了小鼠腦組織中的炎性/抗炎細胞因子的濃度。與正常小鼠相比，CPZ組小鼠腦組織中炎性細胞因子IL－1β和IL－6的濃度明顯增加（P＜0.001），而GK顯著地降低了IL－1β 和 IL－6 的濃度（P＜0.01）。然而各組 IL－1β表達差異無統(tǒng)計學意義。此外，我們也檢測了抗炎細胞因子IL－10和TGF－β的表達。與正常組相比，CPZ 組 IL－10 的表達明顯降低（P＜0.001），但TNF－α的表達差異無統(tǒng)計學意義。而與CPZ組相比，GK顯著提升了IL－10和TNF－α的表達（P＜0.001，P＜0.05）。結果表明，CPZ 誘導的脫髓鞘伴隨著明顯的神經(jīng)炎癥，GK可以有效抑制CPZ導致的神經(jīng)炎癥。結果見圖4。

圖4 GK對CPZ誘導的脫髓鞘小鼠腦組織中促炎/抗炎細胞因子的影響

3 討論

CPZ模型是一種常用的脫髓鞘動物模型，它反映了MS患者病理的基本特征，包括行為功能障礙和脫髓鞘［12]。少突膠質細胞和髓鞘形成細胞的丟失以及由此導致的髓鞘分解是MS的主要發(fā)病機制［13]。CPZ誘導的脫髓鞘伴隨著顯著的小膠質細胞活化和神經(jīng)炎癥反應，表明神經(jīng)炎癥與脫髓鞘關系密切。而GK的神經(jīng)保護作用，不僅與減少髓鞘脫失有關，也與抑制小膠質細胞活化和神經(jīng)炎癥反應有關。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Iba－1+小膠質細胞的數(shù)量在喂食CPZ的小鼠胼胝體區(qū)大量增加，表明小膠質細胞的活化可能與少突膠質細胞的丟失和死亡有關［14]。一些研究表明，活化的小膠質細胞通過分泌各種細胞毒性分子加重神經(jīng)炎癥［15－16]。iNOS是M1型小膠質細胞的重要標志物，M1型小膠質細胞表達TNF－α和IL－6等炎性細胞因子，這些細胞因子導致了中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性微環(huán)境的形成和少突膠質細胞的損傷［17－18]。免疫熒光染色、Western blot和ELISA的數(shù)據(jù)顯示，GK有效地抑制了小膠質細胞的活化，下調了iNOS、TNF－α等炎性細胞因子，表明GK的有效性與抑制小膠質細胞活化及其介導的炎癥反應有關，這都有利于減輕髓鞘損傷和促進髓鞘再生。然而，抑制小膠質細胞介導的炎癥微環(huán)境是否與脫髓鞘的改善相一致仍需要進一步的研究。