兩種體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的比較

沈 慧，許 琪

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005

星形膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中約40%的細(xì)胞，對維持神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[1]。體內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞具有靜息態(tài)和反應(yīng)態(tài)兩種細(xì)胞亞型，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的上調(diào)代表著反應(yīng)態(tài)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增加[1]。星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)模式主要有原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)[2]、直接分離培養(yǎng)體內(nèi)成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞[3]和神經(jīng)干細(xì)胞分化[4]3種方式，其中又以第1種方法的使用范圍最廣。有研究表明原代星形膠質(zhì)細(xì)胞可能作為一種反應(yīng)態(tài)星形膠質(zhì)細(xì)胞，而體內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)耗材費(fèi)力且繁瑣復(fù)雜，不適合大量培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)[5]。因此，本研究將目標(biāo)放在第3種星形膠質(zhì)細(xì)胞—神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞，并比較其與原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的差異。

材料和方法

材料 小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞；小鼠原代神經(jīng)干細(xì)胞；DMEM培養(yǎng)基(MACGENE公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(BI公司)；青霉素-鏈霉素溶液(MACGENE公司)；神經(jīng)基底培養(yǎng)基(Thermo公司)；B27人工血清(Thermo公司)；谷氨酰胺(MACGENE公司)；鼠源表皮生長因子(PeproTech公司)；重組鼠堿性成纖維細(xì)胞生長因子(PeproTech公司)；重組人白介素(interleukin，IL)-1α(PeproTech公司)；重組人IL-1β(PeproTech公司)；重組人IL-6(PeproTech公司)；重組人IL-12(PeproTech公司)；重組人IL-18(PeproTech公司)；重組人腫瘤壞死因子-α(PeproTech公司)；重組人干擾素α(interferon-α，IFN-α)(PeproTech公司)；重組人IFN-γ(PeproTech公司)；重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(PeproTech公司)；重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)(PeproTech公司)；GFAP(GA5)鼠源單克隆抗體(CST公司)；抗小鼠 594 nm抗體(Thermo公司)；左旋多聚賴氨酸溶液(Sigma公司)；干細(xì)胞分離液(Thermo公司)；細(xì)胞裂解液(Sigma公司)。

小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)并鑒定 取出生1 d乳鼠的大腦，用手術(shù)鑷去除小腦、嗅球、海馬以及表面的血管，留下皮層，1 ml槍頭和5 ml注射器先后反復(fù)吹打機(jī)械破碎組織塊，800 r/min(轉(zhuǎn)子半徑12.72 cm)離心3 min后重懸鋪于多聚賴氨酸(濃度0.02 mg/ml液體覆蓋過培養(yǎng)皿底)包被液包被過的細(xì)胞培養(yǎng)皿上，10% FBS-DMEM(FBS濃度10%，雙抗1%)培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3 d后吹下附著在星形膠質(zhì)細(xì)胞上的細(xì)胞碎片，進(jìn)一步培養(yǎng)至細(xì)胞全部長滿整個培養(yǎng)皿。甲醛固定，5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封閉，GFAP孵育過夜，抗小鼠二抗 594 nm室溫孵育，顯微鏡下觀察分化情況。根據(jù)GFAP免疫熒光染色，原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的陽性細(xì)胞比例大于90%。

小鼠原代神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng) 取出15.5 d胎鼠的大腦，左手鑷子戳住胎鼠的眼睛，右手鑷子在大腦的中部劃破，去除小腦、嗅球、海馬以及表面的血管后剝離出大腦皮層，剪刀剪碎組織，用細(xì)胞分離液消化組織塊15 min，用剪去尖頭的1 ml槍頭吹下已被消化松散的表層單細(xì)胞，800 r/min(轉(zhuǎn)子半徑12.72 cm)離心3 min后重懸鋪于多聚賴氨酸包被液包被過的細(xì)胞培養(yǎng)皿上培養(yǎng)以去除過多的細(xì)胞碎片，24 h后消化下培養(yǎng)皿中的細(xì)胞移入加入神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基(2% B27，0.5%雙抗，1%谷氨酰胺，20 ng/ml 表皮生長因子，20 ng/ml重組鼠堿性成纖維細(xì)胞生長因子)的培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，等成球(2～4 d)后可正常維持貼壁或者懸浮培養(yǎng)。根據(jù)GFAP免疫熒光染色，分化星形膠質(zhì)細(xì)胞的陽性細(xì)胞比例大于90%。

神經(jīng)干細(xì)胞分化星形膠質(zhì)細(xì)胞并鑒定 用5% FBS-DMEM處理神經(jīng)干細(xì)胞48 h，甲醛固定，5% BSA封閉，GFAP孵育過夜，抗小鼠二抗 594 nm室溫孵育，顯微鏡下觀察分化情況。

不同細(xì)胞因子處理細(xì)胞并用Western blot檢測蛋白的表達(dá) 用濃度為20 ng/ml細(xì)胞因子處理細(xì)胞48 h，收取細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞樣品，致使細(xì)胞呈黏稠透明液體，加入蛋白緩沖液，95℃變性5 min，后用BCA法進(jìn)行蛋白定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白，用240 mA進(jìn)行恒流轉(zhuǎn)膜，后用相應(yīng)抗體進(jìn)行檢測。

Agilent 小鼠表達(dá)譜芯片檢測細(xì)胞基因表達(dá) 胰酶消化細(xì)胞，Trizol裂解液重懸細(xì)胞，利用Agilent 公司的小鼠基因表達(dá)微陣列，8×60K芯片，檢測小鼠物種的基因表達(dá)譜。對照組(分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞)和處理組(原代星形膠質(zhì)細(xì)胞和加入TGF-β處理的分化星形膠質(zhì)細(xì)胞)各3個平行重復(fù)樣本。利用Agilent相應(yīng)的軟件對基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，得到具有生物學(xué)意義的基因表達(dá)量的變化，并利用t檢驗(yàn)進(jìn)行單因素統(tǒng)計分析，比較兩組的差異基因。將P<0.05的陽性結(jié)果進(jìn)行后續(xù)的通路分析。

統(tǒng)計學(xué)處理 利用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件[6]進(jìn)行統(tǒng)計和作圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，多組比較采用ANOVA one way檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

不同培養(yǎng)方式制備的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和GFAP表達(dá)量的變化 神經(jīng)干細(xì)胞分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞具有分支多、分裂緩慢等特點(diǎn)(圖1A)；而原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下分裂迅速，缺少分支，鏡下呈成纖維樣形態(tài)(圖1B)。并且神經(jīng)干細(xì)胞分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP的熒光表達(dá)較弱(圖1C)，而原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞在免疫熒光染色中GFAP熒光表達(dá)更強(qiáng)(圖1D)。

不同細(xì)胞因子處理2種細(xì)胞后GFAP表達(dá)量的變化 用10種不同細(xì)胞因子(IL-1、IL-6、IL-12家族，腫瘤壞死因子，TGF以及IFN家族)處理原代星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果顯示TGF-β能使分化星形膠質(zhì)細(xì)胞的GFAP發(fā)生顯著升高(圖2A)；而所有細(xì)胞因子處理原代星形膠質(zhì)細(xì)胞后GFAP均無變化(圖2B)。統(tǒng)計結(jié)果顯示，經(jīng)過與內(nèi)參蛋白Hsp90的表達(dá)量進(jìn)行校正后，TGF-β可使GFAP升高約3倍(圖2C)。

表達(dá)譜芯片分析結(jié)果 進(jìn)一步將原代星形膠質(zhì)細(xì)胞、分化星形膠質(zhì)細(xì)胞以及TGF-β處理的分化星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)譜分析，將芯片結(jié)果中具有統(tǒng)計學(xué)意義的差異表達(dá)基因進(jìn)行整理后發(fā)現(xiàn)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中GFAP、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)、谷氨酸/天冬氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體(glutamate-aspartic acid transporter，xCT)、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1(neuregulin，NRG)、N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA)、脂蛋白脂肪酶(lipoprteinlipase，LPL)和整合素3等基因的表達(dá)水平均顯著高于分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP升高約5.5倍、GS升高約3.9倍、xCT升高約2.4倍、NRG升高約2.2倍、NMDA升高約2.5倍、LPL升高約2.3倍、整合素3升高約4.6倍)。通過TGF-β處理誘導(dǎo)分化星形膠質(zhì)細(xì)胞由靜息態(tài)向反應(yīng)態(tài)轉(zhuǎn)變，結(jié)果顯示在處理48 h后，GFAP、NRG、NMDA、LPL等表達(dá)均升高(GFAP升高約1.3倍、NRG升高約2.8倍、NMDA升高約2倍、LPL升高約2.1倍)，同時，與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)水平也明顯高于未經(jīng)TGF-β處理的分化星形膠質(zhì)細(xì)胞(表1)。

討 論

反應(yīng)態(tài)星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的出現(xiàn)是所有腦疾病的標(biāo)志性病理改變[7-8]。細(xì)胞因子的分泌、代謝的紊亂、神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展、細(xì)胞的損傷和死亡等多種方式激活的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞變?yōu)榉磻?yīng)態(tài)星形膠質(zhì)細(xì)胞的主要誘因[9-11]。

GFAP：膠質(zhì)纖維酸性蛋白

GFAP：glial fibrillary acidic protein

A.分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞有多個分支；B.原代星形膠質(zhì)細(xì)胞具有扁平的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)；C.GFAP免疫熒光染色的分化星形膠質(zhì)細(xì)胞；D.GFAP免疫熒光染色的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞

A.the differentiated astrocytes have extended multiple processes；B.the primary astrocytes have flat and fibroblast-like morphologies；C.the differentiated astrocytes immunostaining with GFAP；D.the primary astrocytes immunostaining with GFAP

圖1 2種體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)以及GFAP表達(dá)量(×100)

Fig 1 Morphology and GFAP expression of two types of cultured astrocytes(×100)

TGF-β：轉(zhuǎn)化生長因子-β；Ctrl：對照組；IL：白介素；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IFN：干擾素；GM-CSF：粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子；Mr：相對分子質(zhì)量；與對照組比較，at=6.093，aP<0.001

TGF-β：transforming growth factor-β；Ctrl：control；IL：interleukin；TNF-α：tumor necrosis factor-α；IFN：interferon；GM-CSF：granulocyte-macrophage colony stimulating factor；Mr：relative molecular mass；at=6.093，aP<0.001 compared with control group

A.分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞中TGF-β表達(dá)增加；B.原發(fā)性星形膠質(zhì)細(xì)胞TGF-β表達(dá)無變化；C.與正常對照組相比，用TGF-β處理的分化星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)升高；D.與正常對照組相比，用TGF-β處理的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)無變化

A.TGF-β increases in differentiated astrocytes；B.the primary astrocytes show no change in TGF-β expression；C.GFAP expression increases in differentiated astrocytes treated with TGF-β(compared with normal controls)；D.GFAP expression show no change in primary astrocytes treated with TGF-β(compared with normal control)

圖2 不同細(xì)胞因子處理2種星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)變化

Fig 2 Changes of GFAP expression in two astrocyte types treated with different cytokines

表1 京都基因與基因組百科全書富集性分析結(jié)果Table 1 Results of Kyoto encyclopedia of genes and genomes enrichment analysis

本研究通過嚙齒類大腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)法分離出純度較高的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞和分化星形膠質(zhì)細(xì)胞，通過比較形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)和免疫熒光結(jié)果顯示原代星形膠質(zhì)細(xì)胞具有分裂迅速、胞體較大、分枝較少且GFAP表達(dá)量較高等特點(diǎn)，這與高度分化的反應(yīng)態(tài)星形膠質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)類似。而神經(jīng)干細(xì)胞分化而來的星形膠質(zhì)細(xì)胞基本不具分裂能力，胞體相較于原代細(xì)胞小，分枝多，且GFAP表達(dá)量低，這與分化早期的靜息態(tài)星形膠質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)類似。

基因表達(dá)譜芯片檢測結(jié)果顯示，原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中GS、xCT、NRG、NMDA、LPL和膠質(zhì)纖維酸性蛋白GFAP等基因的表達(dá)水平均顯著高于分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞，表明原代星形膠質(zhì)細(xì)胞相較于分化星形膠質(zhì)細(xì)胞更近似進(jìn)入反應(yīng)態(tài)。

結(jié)合前人報道[1-2]，筆者認(rèn)為原代培養(yǎng)方式培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞就是一種處于反應(yīng)態(tài)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，因此，不適合作為一種普通的星形膠質(zhì)細(xì)胞研究其在不同細(xì)胞因子作用下的反應(yīng)情況；而經(jīng)神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞目前研究較少，其與原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的差異也知之甚少，本研究比較原代星形膠質(zhì)細(xì)胞和分化星形膠質(zhì)細(xì)胞，表明原代星形膠質(zhì)細(xì)胞確實(shí)處于一種反應(yīng)態(tài)，而分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞則未進(jìn)入反應(yīng)態(tài)。用多種細(xì)胞因子處理2種細(xì)胞后，篩選出一種可以使分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞向反應(yīng)態(tài)過渡的細(xì)胞因子—TGF-β，從而獲得了一種研究反應(yīng)態(tài)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能的體外細(xì)胞模型。

綜上，本研究通過比較原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞，為探究不同狀態(tài)的星形膠質(zhì)細(xì)胞功能提供了可能，使我們對星形膠質(zhì)細(xì)胞在疾病中的作用有了更全面的了解，并對靶向星形膠質(zhì)細(xì)胞的疾病治療提供了幫助。