外泌體在類風濕性關節(jié)炎發(fā)病機制中的研究進展

鄧雷弘，龔 蕓，黃曉林，巢海潮

1南昌大學研究生院醫(yī)學部，南昌 330006 2浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院內(nèi)分泌科，杭州 3100003貴州醫(yī)科大學口腔醫(yī)學，貴陽 5500044江西省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所，南昌 330006

類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以關節(jié)滑膜炎、關節(jié)軟骨及骨破壞為主要特征的一種慢性炎癥性自身免疫性疾病。目前，RA的發(fā)病機制仍不清楚，可能主要是多種免疫細胞、自身抗原及炎癥介質(zhì)等在其發(fā)病及發(fā)展過程中發(fā)揮了關鍵作用。外泌體是一種在電鏡下呈雙層脂質(zhì)膜的囊泡體，可被所有細胞分泌，也廣泛存在于血液、尿液、乳汁、腹水和腦脊液等多種體液中[1]。外泌體內(nèi)含有多種生物活性物質(zhì)，可將其內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及編碼、非編碼RNA等遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到靶細胞中而發(fā)揮重要作用。局部的炎癥反應可以影響外泌體內(nèi)的活性物質(zhì)，在不同的環(huán)境狀態(tài)下，外泌體的內(nèi)容物會隨著其周圍環(huán)境的改變而發(fā)生相應的變化。最新研究表明，在RA的慢性炎癥狀態(tài)下，滑膜液中的外泌體可攜帶自身免疫性抗原引發(fā)患者的自身免疫反應，最終促進該疾病的進展[2]。因此，外泌體及其成分很可能成為RA的診斷標志物及治療載體。本文主要綜述外泌體在類風濕性關節(jié)炎發(fā)病機制中的作用。

外泌體基本概述及生物學功能

1987年，Johnstone等[3]體外培養(yǎng)綿羊網(wǎng)織紅細胞，通過超高速離心從其上清液中分離提取到一種囊泡狀小體，其在電鏡下呈現(xiàn)雙層脂質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，命名為外泌體。早期外泌體的功能及作用尚未被人們挖掘，將其視為一種胞外排的“垃圾袋”。近年有研究學者使用差速離心和蔗糖密度梯度離心法將B淋巴細胞中的外泌體提取，并證明B淋巴細胞分泌的外泌體含有主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ-抗原復合物，可以誘導CD4+T淋巴細胞反應，也充分說明外泌體可以調(diào)控免疫細胞的功能[4]。外泌體中的蛋白成分種類繁多，大致可分為兩大類：其一是不同細胞或組織來源的外泌體均有所表達的相關蛋白，主要包括與膜轉(zhuǎn)運相關蛋白(Rab蛋白、鳥苷三磷酸酶、膜聯(lián)蛋白等)、4次跨膜蛋白家族(CD9、CD63、CD81、CD82等)、分子伴侶如熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)70和HSP90、與多泡體形成相關的蛋白(ALG-2相互作用蛋白X、腫瘤易感基因101等)；另一類特殊蛋白的來源主要與起源細胞密切相關，包括抗原呈遞細胞分泌的MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ及共刺激信號蛋白CD86等[5]。外泌體的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)能顯著保護其免于酶的降解，以旁分泌或遠距離傳輸?shù)桨屑毎l(fā)揮生物學作用，其脂質(zhì)成分主要包括膽固醇、神經(jīng)酰胺、磷酯酰絲氨酸及溶血磷脂酸等。有研究表明外泌體內(nèi)的RNA含量豐富，不僅包含已知的mRNA、微小RNA，還有大量的非編碼小RNA，如小干擾RNA、轉(zhuǎn)運RNA、核小體RNA及核仁小 RNA等[6]。

關于外泌體與靶細胞結(jié)合的機制仍在不斷探索中，外泌體一旦釋放到胞外，可以通過旁分泌或遠距離傳輸?shù)桨屑毎?，傳遞其內(nèi)在活性物質(zhì)引起靶細胞的功能及表型發(fā)生改變，從而影響其在體內(nèi)發(fā)揮的生物學作用。而外泌體作用于靶細胞的方式主要有二種：其一是靶細胞以“內(nèi)吞”的形式攝取外泌體；其二是外泌體表面的分子直接與靶細胞表面的受體相結(jié)合[7]。已有研究證明外泌體可以參與體內(nèi)或體外的免疫調(diào)節(jié)作用，Mbongue等[8]發(fā)現(xiàn)成熟的樹突狀細胞分泌的外泌體內(nèi)含MHC-Ⅱ、細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)可以直接刺激T細胞從而激活免疫反應。研究表明外泌體內(nèi)的RNA可以作為漿細胞樣樹突狀細胞表面的Toll樣受體7(Toll-like receptor 7，TLR7)受體激動劑，導致干擾素-α(interferon α，IFN-α)的水平明顯升高，而IFN-α是機體炎癥與免疫應答中的重要調(diào)節(jié)因子，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病過程中起重要作用[9]。因此外泌體可以充當抗原呈遞細胞的輔助調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)節(jié)、維持自身免疫性反應。

外泌體與類風濕性關節(jié)炎

類風濕性關節(jié)炎是一種慢性、進行性的自身免疫性疾病，以侵蝕性關節(jié)滑膜炎和關節(jié)外病變?yōu)橹饕卣鳌Ｆ渲醒?、滑膜液或滑膜組織中來源的外泌體及其成分可以在RA的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。

外泌體介導RA的炎癥反應 Distler等[10]發(fā)現(xiàn)RA患者的滑膜液中富含大量的外泌體，研究者們進一步發(fā)現(xiàn)T細胞及單核細胞來源的外泌體可以誘導基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)、MMP-3、MMP-9、MMP-13，炎性介質(zhì)白介素(interleukin，IL)-6、IL-8，單核細胞趨化因子單核細胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein，MCP)-1、MCP-2在成纖維細胞中的合成。Berckmans等[11]發(fā)現(xiàn)外泌體可以調(diào)節(jié)趨化因子及細胞因子的釋放，可能參與RA患者的滑膜炎癥及血管生成。從RA患者的滑膜液中分離得到外泌體，將成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)與外泌體共培養(yǎng)或單獨培養(yǎng)24 h后，收集細胞上清液，測定MCP-1、IL-6、IL-8、粒-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、血管內(nèi)皮生長因子及ICAM-1的濃度，發(fā)現(xiàn)與外泌體共培養(yǎng)的上清，GM-CSF水平下調(diào)，而其余的細胞因子水平都上調(diào)，其中外泌體的總數(shù)與IL-8關聯(lián)(R=0.91，P<0.0001)，與MCP-1濃度關聯(lián)(R=0.81，P<0.0001)[11]。這些細胞因子、炎癥介質(zhì)及趨化因子在RA的發(fā)病過程中占據(jù)重要的地位，可以誘導RA的炎癥反應及血管生成，進一步引發(fā)關節(jié)軟骨的損壞及關節(jié)的重塑；因此外泌體很可能作為一種新的刺激劑參與RA的發(fā)病進程。通常來說，血小板過多主要參與各種血栓性疾病，但有研究發(fā)現(xiàn)血小板來源的外泌體(platelet-derived exosomes，PLEs)可以在RA的炎癥反應過程中發(fā)揮核心作用。研究發(fā)現(xiàn)RA患者PLEs的釋放量明顯高于健康人群，且PLEs與RA的活動度密切相關(R=0.67，P=0.05)，因此血小板可能通過外泌體參與RA的炎癥反應過程，這也可能是導致RA患者發(fā)生心血管疾病的原因之一[12]。有報道RA患者的FLS分泌的外泌體含有TNF-α，且外泌體膜表面的TNF-α作為配體可以活化炎癥下游信號分子核轉(zhuǎn)錄因子-κB及T細胞的抗凋亡能力，從而進一步促進RA的炎癥反應[13]。另有研究顯示RA患者血漿中的外泌體在氧化應激的刺激下，可以誘導細胞以MD-2依賴形式表達TLR4，但通過TLR4信號通路發(fā)現(xiàn)并不能誘導炎癥反應[14]?？偟膩碚f，外泌體在RA中是發(fā)揮促炎效應的，可以誘導炎癥介質(zhì)、細胞因子等參與RA的發(fā)病進程。

外泌體內(nèi)蛋白介導RA的發(fā)病 Skriner等[15]發(fā)現(xiàn)RA患者滑膜液中的外泌體含有瓜氨酸蛋白，包括纖維蛋白α片段、纖維蛋白β原鏈、纖維蛋白β原鏈前體、纖維蛋白D片段及Spα受體?？贵w與抗原結(jié)合后形成的免疫復合物(immune complexes，IC)能夠誘導自身免疫性疾病中炎癥因子的產(chǎn)生，可能是導致自身免疫性疾病中關節(jié)骨和軟骨組織損傷的一個主要機制。有學者通過高靈敏度流式分析儀及電子顯微鏡的觀察，發(fā)現(xiàn)滑膜關節(jié)液中的外泌體包含IC，且其具有高度的異質(zhì)性；而外泌體內(nèi)的IC主要含有的自身抗原成分是波形蛋白及纖維蛋白原，可以與抗環(huán)瓜氨酸抗體(anti-cyclic citrullinated peptide antibodies，anti-CCP)相結(jié)合從而有助于外泌體量的增加[16]。研究進一步表明RA患者滑膜液中外泌體IC能表達與血小板相關的整合素CD41，故PLEs有助于RA患者滑膜液中外泌體IC的形成；而PLEs則能誘導中性粒細胞釋放白三烯從而發(fā)揮促炎效應[16]。自身抗原對于RA的重要性毋庸置疑，其能與自身抗體相結(jié)合促進RA的病程進展；而RA患者滑膜液中的外泌體含有與RA相關的自身抗原，因此外泌體內(nèi)的相關蛋白可以促進RA的炎癥和自身免疫的產(chǎn)生。Yoo等[17]通過28個關節(jié)的疾病活動度評分(Disease Activity Score in 28 Joints，DAS 28)將60例RA患者進行分組，30例紅細胞沉降率計算的28個關節(jié)疾病活動指數(shù)(Disease Activity Score 28 Erythrocyte Sedimentation Rate，DAS28-ESR)<2.6的分為臨床緩解組(clinical remission group，CRG)，另外30例DAS28-ESR>2.6的分為非臨床緩解組(non-clinical remission group，non-CRG)。從60例患者血清樣本中提取外泌體，使用質(zhì)譜分析和酶聯(lián)免疫法對外泌體中的蛋白進行鑒定和定量，發(fā)現(xiàn)外泌體中的淀粉樣蛋白A(amyloid A，AA)、淋巴管內(nèi)皮細胞透明質(zhì)酸受體1蛋白(lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1，LYVE-1)在兩組中的表達明顯不同；其中non-CRG的血清和外泌體中的AA表達水平明顯高于CRG(P=0.001)，而non-CRG的外泌體中的LYVE-1表達水平低于CRG(P=0.01)，外泌體及血清中的AA與C反應蛋白都呈正相關(分別是R=0.614，P=0.001；R=0.624，P=0.001)，non-CRG的外泌體及血清中的LYVE-1與C反應蛋白也呈正相關(分別是R=0.376，P=0.040；R=0.545，P=0.002)。以上數(shù)據(jù)表明外泌體除了含有常見的與RA疾病相關的蛋白外，蛋白質(zhì)組學還發(fā)現(xiàn)了一些新的與RA疾病活動度密切相關的蛋白分子。這更加說明外泌體內(nèi)的蛋白在RA發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。

外泌體內(nèi)的miRNA介導RA相關細胞間通訊 外泌體來源的微小RNA或mRNA進入受體細胞后可以介導細胞間的通訊而參與調(diào)控RA的發(fā)病過程。而目前關于RA的發(fā)病中研究較多的是微小RNA(micro RNA，miR)-155和miR-146a[18]。Kurowska-Stolarska等[19]證明與健康人群相比，RA患者FLS中的miR-155表達明顯上調(diào)，體內(nèi)抑制該miR-155的表達可導致TNF-α表達相應下調(diào)；體外實驗證明上調(diào)miR-155表達后細胞炎癥因子表達明顯增加，進而誘發(fā)慢性炎癥狀態(tài)。Nakasa等[20]發(fā)現(xiàn)與健康人群對比，IL-1β、TNF-α可以刺激RA患者FLS中miR-146的表達，而上調(diào)miR-146的表達則會抑制IL-6、IL-8、IL-1受體相關激酶及腫瘤壞死因子受體相關因子6基因的表達。研究表明抗原致敏的樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)來源的外泌體miR-155及miR-146a可以被免疫細胞所攝取而介導細胞間的通訊，其中miR-155可以上調(diào)TNF-α、IL-6炎癥基因的表達，而miR-146a卻抑制TNF-α、IL-6炎癥基因的表達；進一步研究顯示，在所有的免疫細胞中幾乎都可以檢測到miR-146a的表達，表明miR-146a可以參與調(diào)控機體的炎癥反應[21]。也間接闡明機體處于炎癥狀態(tài)下，免疫細胞分泌的外泌體來源的miR-155及miR-146a可以介導FLS與其他免疫細胞間的信息交流與物質(zhì)交換，從而調(diào)控RA的疾病進程。Kim等[22]通過實時定量熒光PCR分別檢測RA滑膜液、骨關節(jié)炎滑膜液、RA血漿及健康人群血漿中miR-let-7b的表達，再分別從RA或健康人群外周血中的單核細胞、T細胞、中性粒細胞中提取外泌體以及從RA患者的滑膜液中的巨噬細胞、滑膜組織中的成纖維細胞提取外泌體；發(fā)現(xiàn)RA滑膜液中miR-let-7b的表達水平高于骨關節(jié)炎滑膜液的14倍、RA血漿的260倍及健康人群血漿的450倍，RA外周血單核巨噬細胞來源外泌體中的miR-let-7b的表達水平高于T細胞的23倍和中性粒細胞的113倍，RA滑膜液中巨噬細胞來源的外泌體miR-let-7b的表達水平顯著高于RA滑膜組織中成纖維細胞的5倍。TLR-7內(nèi)源性受體主要存在于RA滑膜液中的巨噬細胞，而外泌體來源的miR-let-7b作為配體通過TLR-7受體的介導可以將幼稚單核細胞轉(zhuǎn)化為成熟的M1炎癥性巨噬細胞，從而促進TNF、IL-6、IL-1、巨噬細胞分泌炎癥性趨化因子(CC cehemokine ligand，CCL)5和CCL2炎性因子的釋放，進而導致RA的發(fā)展及病情的惡化[22]。Maeda等[23]通過高通量測序鑒定RA和正常小鼠中miRNA的表達差異，發(fā)現(xiàn)22種miRNA的表達水平在RA和正常小鼠中有明顯差別，這些miRNA能夠靶向Wnt和骨形態(tài)發(fā)生蛋白骨性相關信號通路。在炎癥因子TNF干預下，外泌體來源的miR-221-3p在FLS中表達上調(diào)，而過表達miR-221-3p則會抑制成骨細胞的分化；因此，RA患者的滑膜組織來源的外泌體中miRNA可調(diào)節(jié)引發(fā)骨關節(jié)侵蝕性的信號通路，進而引起骨的缺損及骨質(zhì)異常代謝增生。成骨細胞的骨分化和破骨細胞的骨吸收兩者間保持動態(tài)平衡對于維持骨重建至關重要，而在RA中，這兩者之間的平衡被打破可能導致骨質(zhì)的異常增生及骨關節(jié)的侵蝕，此過程的發(fā)生可能與外泌體來源的miRNA密切相關。

外泌體在RA的診斷和治療中的應用價值

目前，RA的輔助診斷主要依靠炎性標志物、自身抗體(類風濕性因子抗體及anti-CCP抗體等)及影像學表現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)外泌體內(nèi)的活性物質(zhì)可以反映分泌細胞的功能狀態(tài)，甚至可反映疾病的嚴重程度；因此外泌體有望成為RA診斷標志物的“新寵”。研究表明外泌體來源的AA蛋白和LYVE-1蛋白可以反映RA患者的相關活動度[17]。Sellam等[24]發(fā)現(xiàn)RA患者中血漿來源的外泌體的水平明顯高于健康人群，可以作為RA診斷的生物標志物。RA患者滑膜液來源的外泌體內(nèi)的瓜氨酸蛋白表達水平與健康人群有差別，其可以與anti-CCP相結(jié)合參與RA的發(fā)病，故外泌體內(nèi)的蛋白可作為RA可靠的生物學標志物[15]。Song等[25]報道，與健康人群相比，血清中外泌體來源的7種長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA lncRNA)，包括Hotair、LUST、anti-NOS2A、MEG9、SNHG4、TUG1、NEAT1在RA患者中表達水平明顯上調(diào)；而血清外泌體來源的6種lncRNA，包括Malat1、SNHG1、mascRNA、PR antisense transcripts、PRINS、HOXA3as在RA患者中表達水平則明顯下調(diào)；因此，外泌體來源的lncRNA或也可作為RA診斷的潛在標志物。同時，滑膜液中miR-let-7b的水平明顯高于健康人群，或也是RA診斷的一項潛在指標[22]?；そM織來源的miR-221-3p在RA小鼠模型和正常小鼠中有明顯的差異性表達，對于RA的診斷可能有一定的價值[23]。綜上，血清或滑膜液中的外泌體及相關成分可以類似循環(huán)中的外泌體成為RA診斷的標志物，并且具有穩(wěn)定性高、無創(chuàng)、敏感性高等特點。

對于RA的治療，至今尚無特效療法；臨床上一般使用非甾體抗炎藥、改變病情抗風濕藥、糖皮質(zhì)激素及生物制劑靶向治療(IL-6、TNF-α拮抗劑等)。但這類藥物治療RA只能改善或緩解病情，不能完全控制病情及阻遏其進一步惡化。最近研究顯示外泌體在疾病的治療方面具有以下特性：第一，外泌體能從細胞或體內(nèi)多種體液中提取，制備簡單，易于存貯；第二，外泌體的內(nèi)容物可以免于酶的降解，能直接作用于相應的靶細胞發(fā)揮局部靶向治療作用；第三，外泌體在機體內(nèi)的半衰期較長且相對安全；因此，外泌體在RA的治療上具有較大潛在的應用價值。DCs或血清來源的外泌體在RA小鼠模型中能抑制炎癥反應，可以發(fā)揮免疫抑制的治療效果。有研究表明使用IL-10或IL-4干預未成熟的DCs來源的外泌體能抑制膠原誘導小鼠關節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型的炎癥反應，并顯著降低關節(jié)損壞的嚴重程度[26]。相似的研究表明在遲發(fā)型超敏反應(delayed-type hypersensitivity，DTH)小鼠模型中，F(xiàn)as配體干預DCs來源的外泌體可以抑制T細胞的反應而發(fā)揮抗炎作用[27]。大量的研究證明間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)來源的外泌體在多種疾病能起到良好的治療效果，能促進組織的修復及再生，改善病情的惡化[28-30]。Cosenza等[31]發(fā)現(xiàn)MSCs來源的外泌體可以抑制CD4+和CD8+T細胞亞群的增殖，也可以在DTH小鼠模型中發(fā)揮抗炎效應，同樣在膠原誘導的關節(jié)炎模型中也能減緩相應的炎癥反應。Zhang等[32]首次證明MSCs來源的外泌體可以完全修復軟骨及軟骨下骨。因此,MSCs來源的外泌體在RA中不僅能發(fā)揮抗炎作用，而且能夠促進關節(jié)軟骨及軟骨下骨的再生。表明MSCs來源的外泌體可以具備扭轉(zhuǎn)RA晚期患者的關節(jié)畸形及關節(jié)外并發(fā)癥的能力，這為RA的有效治療、病情控制甚至病情扭轉(zhuǎn)帶來新的切入點。

小 結(jié)

近些年來，外泌體的研究得到了迅猛的發(fā)展。學者們致力于研究外泌體的形成及分泌機制、其內(nèi)在活性物質(zhì)的構(gòu)成、在疾病中的生物學功能以及在疾病診斷標志物和治療載體中的可能應用；目前，外泌體在RA中的可能作用及分子機制已有了初步的探索。外泌體作為一種納米結(jié)構(gòu)的囊泡小體，其內(nèi)的蛋白質(zhì)、非編碼RNA在RA的發(fā)生及發(fā)展中占據(jù)著重要地位。未來的研究應當完善外泌體在RA中的具體作用機制，明確其是通過哪些免疫信號通路的傳導調(diào)控RA的發(fā)病進展。當然，滑膜液及血漿來源的外泌體仍然是RA體液活檢診斷中的主要來源，其內(nèi)的蛋白質(zhì)、miRNA及l(fā)ncRNA是RA診斷中的主要生物學標志物。證據(jù)表明MSCs來源的外泌體能在多種疾病中發(fā)揮相應的治療作用，而其在RA中的治療效果很可能是未來科研或臨床工作者需要大力探討的研究方向之一。