N-乙酰半胱氨酸對(duì)術(shù)后認(rèn)知功能障礙模型小鼠認(rèn)知功能及核因子E2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶-1信號(hào)通路的影響

閆 焱

廣州市第一人民醫(yī)院麻醉科，廣州 510180

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)是手術(shù)和麻醉引起的眾多并發(fā)癥之一，Eckenhoff和Laudansky[1]認(rèn)為麻醉和手術(shù)時(shí)，炎癥介質(zhì)如白介素-6(interleukin-6，IL-6)等的爆發(fā)經(jīng)迷走神經(jīng)傳入和通過血腦屏障作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)，損傷突觸和神經(jīng)元，最終導(dǎo)致POCD，血漿中IL-6水平升高程度與認(rèn)知功能的損害密切相關(guān)[2]。與學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的海馬組織在炎癥反應(yīng)中最易受累[3]，有研究從恐懼記憶、空間認(rèn)知及反轉(zhuǎn)認(rèn)知等方面證實(shí)術(shù)后海馬組織損傷所致的炎癥反應(yīng)與認(rèn)知障礙是一致的[4-5]。腦組織的高代謝特性導(dǎo)致其容易發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，在炎癥反應(yīng)發(fā)生的同時(shí)，POCD模型大鼠海馬組織中氧化應(yīng)激標(biāo)記物丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量增加[6]，因此抗炎制劑并不能完全防止POCD的發(fā)生。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2)是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)廣泛，對(duì)多種腦組織病變具有神經(jīng)保護(hù)功能，其所調(diào)控的下游基因血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)被認(rèn)為是最強(qiáng)的抗氧化蛋白，在抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是氨基酸半胱氨酸的衍生物，是體內(nèi)形成抗氧化劑谷胱甘肽的前體物質(zhì)，而谷胱甘肽是腦內(nèi)主要的抗氧化劑，增強(qiáng)大腦對(duì)與認(rèn)知損傷有關(guān)的氧化應(yīng)激的反應(yīng)能力[7]，同時(shí)減輕炎性反應(yīng)對(duì)認(rèn)知的損傷[8]。本研究通過建立POCD小鼠模型，評(píng)價(jià)NAC對(duì)POCD小鼠認(rèn)知功能、海馬組織氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的影響，探討Nrf2/HO-1信號(hào)通路是否POCD發(fā)生的相關(guān)機(jī)制。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性3～4月齡C57BL/6J小鼠54只，體重25～35 g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于無特定病原體級(jí)動(dòng)物房，研究遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)并通過醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。將小鼠置于安靜、自然光的環(huán)境飼養(yǎng)48 h以上，保持動(dòng)物在恒溫(23±3)℃，相對(duì)濕度(50±10)%，12 h～12 h晝夜節(jié)律，自然飲水、進(jìn)食。

POCD小鼠模型建立 所有小鼠行2 %異氟醚吸入麻醉，在切皮前和手術(shù)結(jié)束時(shí)，皮下注射鹽酸丁丙諾啡0.1 mg/kg，手術(shù)后4 h再次注射，用于鎮(zhèn)痛。根據(jù)文獻(xiàn)[7]行左下肢脛骨骨折固定術(shù)，左脛骨剃毛后消毒，在脛骨近端用25號(hào)針頭鉆一0.3 mm的孔，將0.38 mm的不銹鋼棒置入髓腔內(nèi)約15 mm，行髓內(nèi)固定。分離腓骨和脛骨周圍肌肉，剝離10 mm范圍內(nèi)的骨膜，在脛骨中下1/3交界處行截骨術(shù)，沖洗傷口，縫合皮膚。手術(shù)過程中應(yīng)用保溫毯保溫36～37℃，術(shù)后小鼠置于加熱墊復(fù)蘇，清醒后送回籠中。

分組 采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，利用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為3組(n=18)：對(duì)照組、手術(shù)組、手術(shù)+NAC組，3組小鼠行相同麻醉與鎮(zhèn)痛方案，手術(shù)組和手術(shù)+NAC組行脛骨骨折內(nèi)固定術(shù)。游離NAC在血漿中的半衰期為2.15 h，為維持血漿濃度，手術(shù)+NAC組分別于麻醉前30 min、術(shù)后3 h和6 h腹腔內(nèi)注射NAC(購自碧云天，S0077)150 mg/kg，對(duì)照組和手術(shù)組在相同時(shí)間點(diǎn)腹腔注射0.9 %生理鹽水。

水迷宮測(cè)試 在直徑110 cm、高30 cm的圓形水池內(nèi)，目標(biāo)象限有一個(gè)直徑10 cm的平臺(tái)，隱藏于距離水面1 cm的水下，水溫保持23～25℃。參照文獻(xiàn)[9]，術(shù)后第3天每組利用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)取6只小鼠，小鼠每天訓(xùn)練4次，間隔30～40 min，共訓(xùn)練4 d。在60 s的時(shí)間內(nèi)，若發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，則訓(xùn)練結(jié)束，小鼠在平臺(tái)上停留15 s；若無法找到平臺(tái)，則引導(dǎo)小鼠登上平臺(tái)并停留15 s。記錄到達(dá)平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)和游泳速度。術(shù)后第7天，實(shí)施探索實(shí)驗(yàn)用于測(cè)試空間記憶，在此實(shí)驗(yàn)中，將原有平臺(tái)移走，記錄小鼠60 s內(nèi)穿越原來平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)和在目標(biāo)象限內(nèi)停留的時(shí)間。

海馬組織的提取 術(shù)后1、3 d各組利用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取6只小鼠，行斷頭處死，從枕骨大孔剪開顱骨，暴露并分離腦組織，置于冰上分離出海馬組織。取左側(cè)海馬組織用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液沖洗組織，去除殘留血液，在冰上充分研磨。將勻漿液于4℃以5000 r/min(轉(zhuǎn)子半徑13.5 cm)離心20 min，取上清液分裝，-20℃保存?zhèn)溆?。將右?cè)海馬組織加入液氮速凍，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定海馬組織IL-6和MDA的含量 參照酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒說明書操作，測(cè)定海馬組織IL-6(美國Abcam公司，ab100712)和MDA(美國Abcam公司，ab238537)的含量。經(jīng)MK3 酶標(biāo)儀讀取吸光度光密度值，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出IL-6和MDA的含量。

Western blot檢測(cè)海馬組織Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá) 每10 mg海馬組織中加入200 μl蛋白裂解液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，封閉膜1 h后加入Nrf2(1∶1500，美國 Santa Cruz公司)、HO-1(1∶1000，美國 Santa Cruz公司)、β-actin抗體(1∶3000，美國 Santa Cruz公司)，4℃過夜，第2天洗膜后用二抗生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG雜交(1∶5000，美國Cell Signaling公司)，采用Image Lab 3.0軟件進(jìn)行灰度分析。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，待測(cè)蛋白條帶與β-actin條帶灰度值的比值代表其蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)水平。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)海馬組織Nrf2和HO-1 mRNA表達(dá) 采用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，擴(kuò)增Nrf2和HO-1基因片段所需的上下游引物(引物序列及擴(kuò)增的片段長度見表1)。以β-actin作為內(nèi)參照，相對(duì)定量解析方法用于mRNA表達(dá)量解析，采用2-(ΔΔCt)方法，將對(duì)照組的mRNA表達(dá)量作為1，靶基因相對(duì)定量=2-(ΔΔCt)，ΔΔCt=ΔCt靶基因-ΔCtβ-actin，Ct值為目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定閾值所需反應(yīng)循環(huán)數(shù)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，應(yīng)用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析；水迷宮結(jié)果用重復(fù)測(cè)量方差分析。使用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)多重比較配對(duì)的t檢驗(yàn)法(Bonferroni法)，對(duì)組間和組內(nèi)不同觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行兩兩比較；使用多元方差分析法，對(duì)各時(shí)點(diǎn)進(jìn)行組間兩兩比較。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used in real-time polymerase chain reaction sequence

Nrf2：核因子E2相關(guān)因子2；HO-1：血紅素加氧酶-1

Nrf2：nuclear factor erythroid 2 related factor 2；HO-1：heme oxygenase-1

結(jié) 果

NAC對(duì)POCD小鼠認(rèn)知功能的作用 3組小鼠的游泳速度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.135，P=0.114)；與對(duì)照組和手術(shù)+NAC組小鼠相比，手術(shù)組小鼠的逃避潛伏期延長(P<0.01)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少(P<0.01)，目標(biāo)象限停留時(shí)間減少(P<0.01)，即NAC可降低POCD小鼠的認(rèn)知功能損傷(圖1)。

海馬組織IL-6、MDA的水平 與對(duì)照組相比，手術(shù)組和手術(shù)+NAC組術(shù)后1 d海馬組織IL-6和MDA含量均明顯增高(P均=0.000)，術(shù)后第3天手術(shù)組仍高于對(duì)照組(P=0.000)，手術(shù)+NAC組IL-6(P=0.251)和MDA(P=0.103)含量降至對(duì)照組水平；與手術(shù)組相比，手術(shù)+NAC組術(shù)后第1、3天海馬組織IL-6和MDA含量均明顯降低(P均=0.000)(圖2)。

海馬組織Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá) 與對(duì)照組相比，手術(shù)組和手術(shù)+NAC組術(shù)后海馬組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)均增高(P均=0.000)；與手術(shù)組相比，手術(shù)+NAC組術(shù)后海馬組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)均明顯增高(P均=0.000)(圖3)。

海馬組織Nrf2和HO-1 mRNA的表達(dá) 以對(duì)照組海馬組織Nrf2和HO-1 mRNA 為對(duì)照樣品，其相對(duì)表達(dá)量為1，計(jì)算各組海馬組織Nrf2和HO-1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示手術(shù)組和手術(shù)+NAC組Nrf2的mRNA表達(dá)在術(shù)后第1天均明顯增加(P均=0.000)；NAC可引起表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，手術(shù)+NAC組明顯高于手術(shù)組(P=0.000)。在術(shù)后第3天，Nrf2和HO-1的mRNA表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)(圖4)。

討 論

Morris水迷宮是20世紀(jì)80年代由英國心理學(xué)家Morris設(shè)計(jì)并應(yīng)用于評(píng)估嚙齒類動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能的重要工具[10]，與海馬依賴性記憶有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性[11]。Morris水迷宮動(dòng)物訓(xùn)練形成的空間參考記憶屬于陳述性記憶，儲(chǔ)存機(jī)制主要與海馬相關(guān)，認(rèn)知障礙的患者陳述性記憶首先受損且較突出[12]，運(yùn)用Morris水迷宮對(duì)NAC防治POCD進(jìn)行研究是恰當(dāng)?shù)摹１狙芯啃行∈笞笙轮劰枪钦蹆?nèi)固定術(shù)，建立POCD小鼠模型，應(yīng)用Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試，結(jié)果顯示手術(shù)組逃避潛伏期延長，探索時(shí)間明顯縮短，表明其空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯受損，發(fā)生認(rèn)知功能障礙，小鼠POCD模型建立成功。本研究證實(shí)NAC預(yù)處理可改善手術(shù)后小鼠的認(rèn)知功能，與手術(shù)組小鼠相比，逃避潛伏期明顯縮短，探索時(shí)間延長，表明NAC可能具有潛在的防治POCD的作用。

NAC：N-乙酰半胱氨酸；與對(duì)照組相比，aP<0.05，bP<0.01；與手術(shù)組相比，cP<0.05，dP<0.01

NAC：N-acetyl cysteine；aP<0.05，bP<0.01 compared with the control group；cP<0.05，dP<0.01 compared with the surgery group

圖1 3組小鼠游泳速度(A)、逃避潛伏期(B)、穿越平臺(tái)次數(shù)(C)、在目標(biāo)象限內(nèi)停留時(shí)間(D)的比較

Fig 1 Comparison of the swimming speed(A)，escape latency(B)，platform crossing times(C)and time spent in the target quadrant(D)of mice in each group

IL-6：白介素-6；MDA：丙二醛；與對(duì)照組相比，aP=0.000；與手術(shù)組相比，bP=0.000

IL-6：interleukin-6；MDA：malondialdehyde；aP=0.000 compared with the control group；bP=0.000 compared with the surgery group

圖2 3組小鼠海馬組織IL-6(A)、MDA(B)含量的比較

Fig 2 Expressions of IL-6(A)and MDA(B)in the hippocampus of mice in each group

Mr：相對(duì)分子質(zhì)量；與對(duì)照組相比，aP=0.000；與手術(shù)組相比，bP=0.000

Mr：relative molecular mass；aP=0.000 compared with the control group；bP=0.000 compared with the surgery group

圖3 3組小鼠海馬組織HO-1(A)、Nrf2(B)的蛋白表達(dá)

Fig 3 Expressions of HO-1(A)and Nrf2(B)proteins in the hippocampus of mice in each group

活性氧(reactive oxygen species，ROS)集聚可引起神經(jīng)元變性，NAC可直接清除ROS，發(fā)揮抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝等作用。腦組織抗氧化能力差，其中海馬組織是富含多不飽和脂肪酸的神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)，易受到氧化應(yīng)激過程中自由基的攻擊而損傷。NAC通過修復(fù)谷胱甘肽池[13]和清除ROS[14]發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，在維持神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要的作用[15]。有研究顯示，與學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的海馬組織發(fā)生神經(jīng)炎性和氧化應(yīng)激反應(yīng)是引發(fā)POCD的關(guān)鍵機(jī)制[16-17]。一項(xiàng)Meta分析表明IL-6水平與POCD相關(guān)，可用于指導(dǎo)POCD的預(yù)防和治療[18]；另一方面，氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的超氧化物自由基可引起腦組織損傷、加速腦細(xì)胞死亡，氧化應(yīng)激標(biāo)記物MDA含量反映細(xì)胞損傷的程度[6]。有研究顯示NAC可增強(qiáng)抗氧化酶的活性，抑制MDA的形成，降低IL-6水平，發(fā)揮腦保護(hù)的作用[19]。本研究POCD小鼠術(shù)后1、3 d海馬組織IL-6水平增加，同時(shí)MDA含量上升。經(jīng)NAC預(yù)處理后，IL-6、MDA水平明顯低于手術(shù)組，降低海馬組織氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)。

與對(duì)照組相比，aP=0.000；與手術(shù)組相比，bP=0.000

aP=0.000 compared with the control group；bP=0.000 compared with the surgery group

圖4 3組小鼠海馬組織HO-1(A)、Nrf2(B)的mRNA表達(dá)

Fig 4 The mRNA expressions of HO-1(A)and Nrf2(B)in the hippocampus of mice in each group

為探討NAC降低POCD小鼠海馬組織氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的可能機(jī)制，本研究檢測(cè)Nrf2和HO-1的蛋白和mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示Nrf2和HO-1的蛋白和mRNA表達(dá)水平均上調(diào)，NAC增強(qiáng)了Nrf2/HO-1信號(hào)通路的活性，上調(diào)抗氧化基因HO-1的表達(dá)，從而減輕氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)。越來越多的證據(jù)表明創(chuàng)傷性腦損傷后，Nrf2的抗氧化作用通過上調(diào)Ⅱ相抗氧化酶，如HO-1等完成。Nrf2是保護(hù)細(xì)胞抗氧化和炎性損傷信號(hào)通路的關(guān)鍵協(xié)調(diào)者，HO-1是受其調(diào)控的抗氧化應(yīng)激和抗炎癥反應(yīng)的重要基因。Nrf2和其調(diào)控基因不僅可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，還能調(diào)控炎癥反應(yīng)[20]。HO-1是強(qiáng)效抗氧化劑，正常狀態(tài)下以低水平表達(dá)，當(dāng)受到環(huán)境因素的刺激時(shí)，尤其是氧化應(yīng)激和ROS的刺激，其表達(dá)迅速上升，清除炎性反應(yīng)時(shí)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的氧自由基，具有強(qiáng)效抗脂類和脂蛋白氧化的作用[21]。HO-1通過抑制內(nèi)膜黏附分子表達(dá)而抑制炎性細(xì)胞的趨化、黏附和滲透，發(fā)揮抗炎作用[22]。筆者推斷NAC對(duì)POCD小鼠的保護(hù)作用與Nrf2/HO-1信號(hào)通路的激活密切相關(guān)。

本研究結(jié)果證實(shí)NAC對(duì)POCD小鼠的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。NAC預(yù)處理后的POCD小鼠降低海馬組織氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，改善認(rèn)知功能，此作用與激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)。但是本研究?jī)H檢測(cè)了Nrf2和HO-1的蛋白及mRNA表達(dá)，在此基礎(chǔ)上仍需進(jìn)一步探討NAC的作用機(jī)制。筆者認(rèn)為，NAC可作為新的藥物用于POCD的防治。