• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    2株海鞘共附生真菌的次生代謝產(chǎn)物研究

    2019-09-03 07:57:46喬玉寶樊成奇唐瑩瑩田曉清
    海洋漁業(yè) 2019年4期
    關(guān)鍵詞:海鞘硅膠乙腈

    喬玉寶,樊成奇,唐瑩瑩,田曉清

    (1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所,上海 200090;2.上海海洋大學(xué),上海 201306;3.農(nóng)業(yè)部遠(yuǎn)洋與極地漁業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200090;4.農(nóng)業(yè)部東海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200090)

    海洋環(huán)境一般具有高鹽和寡營(yíng)養(yǎng)等特點(diǎn),一些局部海區(qū)還具有高壓、低溫和低光照等特征,這些特殊性導(dǎo)致生活在其中的很多生物尤其是微生物在長(zhǎng)期的適應(yīng)性進(jìn)化過(guò)程中可能會(huì)產(chǎn)生一些有別于陸地生物的防御體系,從而使得它們成為抗腫瘤、抗菌、抗病毒和抗心血管疾病等藥物先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源[1]。在新結(jié)構(gòu)海洋天然產(chǎn)物中,海洋真菌和放線(xiàn)菌來(lái)源分別占8.5%和3.5%,脊索動(dòng)物海鞘的次級(jí)代謝產(chǎn)物也占到4.7%,它們都是結(jié)構(gòu)新穎的海洋天然產(chǎn)物重要來(lái)源[2]。

    我國(guó)海鞘資源豐富,已記錄的中國(guó)沿海海鞘分布在渤海5種、黃海21種、東海24種、南海53種,種類(lèi)合計(jì)有 70余種,其中許多屬種如Hartmeyeria等為我國(guó)所特有[3-4]。目前國(guó)內(nèi)海鞘的次級(jí)代謝產(chǎn)物研究與國(guó)際先進(jìn)水平還存在一定差距,主要集中在瘤海鞘屬柄海鞘(Styela clava)[5]和短腹海鞘屬星座美洲海鞘(Aplidium constellatum)[6]。中國(guó)學(xué)者對(duì)海鞘共附生微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物研究也還處于起步階段,早期文獻(xiàn)報(bào)道了香豆素類(lèi)新結(jié)構(gòu)化合物來(lái)源于海鞘的青霉菌[7];2017年,裴召苓等[8]從中國(guó)黃海的威海海域柄海鞘來(lái)源放線(xiàn)菌Streptomyces coelicoflavus(HQA809)中分離鑒定了2個(gè)吡喃酮類(lèi)化合物,從菊海鞘(Botryllus schlosseri)來(lái)源的Nocardiopsis dassonvillei(HQA404)中分離鑒定了1個(gè)吩嗪類(lèi)化合物和1個(gè)苯酚類(lèi)化合物,其中吩嗪類(lèi)化合物對(duì)鰻弧菌(Vibrio anguillarum)和副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)的MIC值分別為50 μM和25μM,顯示出很好的活性。本課題組前期也進(jìn)行了不同海鞘化學(xué)成分的研究[9-11]以及中國(guó)各海區(qū)的海鞘共附生微生物資源的持續(xù)收集和活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ)研究[12]。在此基礎(chǔ)上,本文研究了分離自瘤海鞘屬皺瘤海鞘(S.plicata)和冠瘤海鞘(S.canopus)樣品的共附生真菌Purpureocillium sp.FBZ-1和Penicillium sp.BNG-1的次級(jí)代謝產(chǎn)物,以期為今后海鞘共附生微生物代謝產(chǎn)物的相關(guān)研究提供參考資料。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    生物材料:新鮮海鞘于2015年3月23、24日分別采自廣西北海南汅(冠瘤海鞘)和防城港白龍碼頭(皺瘤海鞘),海水沖洗后立即封裝于無(wú)菌管內(nèi),冷藏保存運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室,海鞘品種由東海水產(chǎn)研究所樊成奇研究員鑒定。

    微生物鑒定材料:真菌DNA小劑量快速提取試劑盒(上海生工生物公司);18S引物(上海美吉生物公司);PCR擴(kuò)增體系(康為世紀(jì))。

    色譜填料和試劑:HP-20大孔吸附樹(shù)脂(Mitsubishi Chemical,Japan);凝膠 Sephadex LH-20(Pharmacia Biotech,Sweden);凝膠 Sephadex G-25(Pharmacia Biotech,Sweden);預(yù)制 GF254 TLC硅膠板(青島海洋化學(xué)公司);液相用乙腈、甲醇(色譜級(jí),Tedia,USA);其余溶劑均為分析純(AR,上海國(guó)藥集團(tuán))。

    分離培養(yǎng)基:孟加拉紅固體培養(yǎng)基(葡萄糖10.0 g,蛋白胨 5.0 g,磷酸二氫鉀 1.0 g,硫酸鎂0.5 g,瓊脂20.0 g,1/3000孟加拉紅溶液100 mL,陳海水 1 000 mL)[13];PDA固體培養(yǎng)基(馬鈴薯200.0 g,葡萄糖10.0 g,瓊脂18.0 g,陳海水1 000 mL);YPD固體培養(yǎng)基(酵母膏10.0 g,蛋白胨 20.0 g,葡萄糖20.0 g,瓊脂18.0 g,陳海水1 000 mL)。用于分離菌株時(shí)每種培養(yǎng)基添加氯霉素和萘啶酮酸各 30 U·mL-1,pH 6.0~6.5[14]。

    發(fā)酵培養(yǎng)基:YPD液體培養(yǎng)基。

    1.2 儀器

    超凈工作臺(tái):北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司DL-CJ-INDII型;高壓滅菌器:上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)LDZX-75KBS型;大型恒溫培養(yǎng)箱:Shanghai Chemstar Instruments Co.,Ltd ATB-032型;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海一恒科技有限公司DHG-9123A型;微生物恒溫培養(yǎng)箱:上海一恒科技有限公司DHP 9162A型;高速微量離心機(jī):上海生工生物有限公司HICO 21型;PCR儀:杭州朗基科學(xué)儀器有限公司AG-22331型;凝膠成像系統(tǒng):上海天能科技有限公司GIS-1600型;超聲儀:上海漢克科學(xué)儀器有限公司SK250LH型;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海亞榮生化儀器廠(chǎng)RE-2000;顯微鏡:上海光學(xué)儀器一廠(chǎng)XSP-44X.9型;半制備 HPLC系統(tǒng):Shimadazu LC-20AT pump,SIL-20A auto sampler,SPD-M20A PDA detector以及 YMC-Pack ODS-AQ column(250×10 mm,S-5μm,12 nm,常用進(jìn)樣量 100μL,流速 2.5 mL·min-1);UV:Shimadzu SPD-M20A PDA detector; ESI-MS:Finnigan LCQ DECA instrument;NMR:Bruker AM-400 spectrometer(TMS內(nèi)標(biāo));LC-MS:Agilent 1290 HPLC-6224 TOF MS;波譜學(xué)技術(shù)1H-NMR(400 MHz)、13C-NMR(126 MHz)等。

    1.3 共附生微生物的分離和培養(yǎng)

    1.3.1 菌株的分離純化

    將冠瘤海鞘和皺瘤海鞘樣品在超凈工作臺(tái)內(nèi)剪碎,分別稱(chēng)取1 g左右海鞘樣品加入到裝有10 mL無(wú)菌水的50 mL無(wú)菌管中,震蕩混勻后靜置于4℃冰箱過(guò)夜。將樣品懸液進(jìn)行1×10-1、1×10-2、1×10-3的梯度稀釋?zhuān)總€(gè)梯度分別取100μL涂布于孟加拉紅、PDA和YPD固體培養(yǎng)基上,由于菌種的適宜生長(zhǎng)環(huán)境是27℃左右,故將培養(yǎng)皿放于27℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)[15]。培養(yǎng)約1~2周后長(zhǎng)出菌落,根據(jù)顏色、形態(tài)等特征挑取差異較大的菌落,接種至相應(yīng)新鮮培養(yǎng)基上繼續(xù)分離培養(yǎng)。最終得到的菌株保存于相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上,置于4℃冰箱保種。

    1.3.2 菌落形態(tài)觀(guān)察

    由于課題研究真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物,根據(jù)菌株形態(tài)挑選出疑似真菌純化菌株接種在YPD平板培養(yǎng)基,27℃下倒置培養(yǎng)7~10 d,觀(guān)察并記錄菌落大小、顏色、質(zhì)地、有無(wú)分泌物等特征[16]。載玻片上滴一滴清水,刮取少量菌絲體和孢子在清水中分散均勻,蓋上蓋玻片,在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察菌絲形態(tài)、直徑等特性和孢子的顏色、外形并記錄[17]。

    1.3.3 菌株18S rDNA-ITS序列分析

    將真菌發(fā)酵液減壓抽濾得菌絲體。取適量菌體,加入液氮充分研磨至粉末狀[18]。使用真菌DNA小劑量快速提取試劑盒提取真菌基因組DNA,并于 -20℃保存?zhèn)溆?。采?18S-EF3:TCCTCTAAATGACCRAGTTTG和 18S-EF4:GGAAGGGRTGTATTTATTAG,擴(kuò)增真菌 18S rDNA-ITS序列。

    PCR擴(kuò)增體系為50μL∶2×Taq PCR Master Mix 25μL,引物各2μL,模板 DNA 5μL,重蒸水16μL。擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10 min[19]。取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠,100 V電泳30 min,檢測(cè) DNA大小,然后用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照。提取的DNA-20℃保存之后送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。所測(cè)結(jié)果在NCBI網(wǎng)站比對(duì),種屬歸類(lèi)。

    1.4 FBZ-1菌株代謝產(chǎn)物分離純化

    1.4.1 FBZ-1菌株發(fā)酵

    配制兩瓶300 mL YPD液體培養(yǎng)基,置于500 mL三角瓶中,121℃高溫滅菌30 min,再接入經(jīng)過(guò)活化培養(yǎng)的FBZ-1菌株,20℃、160 r·min-1進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng),5 d后得到種子發(fā)酵液。將種子液按一定比例接種于含有0.75 L YPD液體培養(yǎng)基的2 L三角瓶中,在20°C、160 r·min-1分兩批進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng),每批發(fā)酵培養(yǎng)一周,共得到約20 L發(fā)酵液。

    1.4.2 FBZ-1化合物的提取分離

    菌株FBZ-1的20 L發(fā)酵液經(jīng)抽濾分為胞外濾液和菌體兩部分。因菌體和發(fā)酵液極性不一樣,故菌體用甲醇和丙酮超聲提取,發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取。菌體置于-80℃冰箱中冷凍,然后取出自然解凍破壁,依次加入2 L的丙酮和甲醇(MeOH)超聲破碎,分別提取2次,提取液減壓低溫濃縮除去有機(jī)溶劑。將胞內(nèi)水溶液上Middle Chromatogram Isolated gel(MCI gel),用水洗脫 4個(gè)柱體積1 200 mL,再用 MeOH/H2O(10∶90)洗脫900 mL,洗脫液舍棄;繼續(xù)依次用MeOH/H2O(40∶60→60∶40→80∶20→100∶0)梯度洗脫,每梯度洗脫液用量均為1 200 mL。胞外濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1 L,用乙酸乙酯按照1∶1萃取4次,將上層的乙酸乙酯相濃縮后,用40%MeOH超聲震蕩溶解后過(guò)MCIgel,也依次用MeOH/H2O(40∶60→60∶40→80∶20→100∶0)對(duì) MCIgel中的濃縮液進(jìn)行梯度洗脫,每梯度洗脫液用量均為2 500 mL。將胞外、胞內(nèi)同梯度的洗脫液分別合并,濃縮蒸干,得到 40%Me(3.54 g)、60%Me(1.63 g)、80%Me(0.35 g)和100%Me(1.70 g)4個(gè)部位。

    最主要的40%Me部分用水溶解后過(guò)MCI gel,依次用 MeOH/H2O(10∶90→20∶80→35∶65→50∶50→100∶0)進(jìn)行梯度洗脫,每個(gè)梯度洗脫 1 L濃縮蒸干得到40%MeI(2.36 g)、40%MeⅡ(3.82 g)、40%MeⅢ(2.70 g)和 40%MeⅣ(1.81 g)。

    40%MeI部分過(guò)正相硅膠柱,依次用CHCl3/MeOH/H2O(6∶1∶0.1→5∶1∶0.1→4∶1∶0.1→3∶1∶0.1)進(jìn)行梯度洗脫,每個(gè)梯度洗脫1 L得到40%MeIa和40%MeIb,其中40%MeIa經(jīng) HPLC反復(fù)進(jìn)樣制備,分離得到化合物1(4 mg,17.83 min)。流動(dòng)相為乙腈-水(均含0.1%三氟乙酸):0 min,15%乙腈;7 min 30 s,20%乙腈;8 min,30%乙腈;14 min 30 s,40%乙腈;14 min 42 s,70%乙腈;18 min 30 s,70%乙腈;19 min,15%乙腈。40%MeIb部分經(jīng)檢測(cè)后不做處理。

    40%MeⅡ部分用反相RP-18柱色譜,依次用CH3CN/H2O(15∶85→25∶75→60∶40→80∶20→100∶0)進(jìn)行梯度洗脫,每個(gè)梯度洗脫1L,將洗脫液濃縮蒸干得到40%MeⅡa和40%MeⅡb兩個(gè)部分。其中40%MeⅡa部分經(jīng)HPLC反復(fù)進(jìn)樣制備得到40%MeⅡa1、40%MeⅡa2和其余部分,40%MeⅡa1部分過(guò)正相硅膠柱,依次用CHCl3/MeOH(20∶1→16∶1→12∶1)進(jìn)行梯度洗脫,每個(gè)梯度洗脫 500 mL,得到化合物 2(4 mg);40%MeⅡa2部分經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析分離,用70%乙醇洗脫300 mL得到化合物3(6 mg)和化合物 4(5 mg)。

    40%MeⅢ部分經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析分離,70%無(wú)水乙醇洗脫,得到40%MeⅢa、40%MeⅢb、40%MeⅢc 3個(gè)部分,其中 40%MeⅢb部分經(jīng)HPLC反復(fù)進(jìn)樣制備,得到化合物5(12 mg,14.42 min)、化合物 6(12 mg,14.42 min)、化合物 7(3 mg,16.05min)和化合物 8(2 mg,19.26 min)。液相流動(dòng)相為乙腈-水(均含0.1%三氟乙酸):0 min,15%乙腈;2 min,20%乙腈;14 min,25%乙腈;21 min,45%乙腈;21 min 30 s,70%乙腈;24 min 30 s,70%乙腈;25 min,15%乙腈。40%MeⅢc部分經(jīng)HPLC反復(fù)進(jìn)樣制備,濃縮得到化合物9(5 mg,26.42 min)。流動(dòng)相為乙腈-水(均含0.1%三氟乙酸):0 min,15%乙腈;2 min,20%乙腈;14 min,25%乙腈;24 min,45%乙腈;24 min 30 s,70%乙腈;26 min 30 s,70%乙腈;27 min,15%乙腈。

    60%Me部分經(jīng)薄層層析和HPLC-TOF MS分析未發(fā)現(xiàn)有價(jià)值的成分,故不做處理。

    80%Me經(jīng) MeOH溶解后用粗硅膠(200~300目)拌樣上硅膠柱,依次用 CHCl3/MeOH(40∶1→30∶1→20∶1)進(jìn)行梯度洗脫,每個(gè)梯度洗脫500 mL,得化合物 10(37 mg)。

    1.5 BNG-1菌株代謝產(chǎn)物分離純化

    1.5.1 BNG-1菌株發(fā)酵

    配制300 mL YPD液體培養(yǎng)基,置于500 mL三角瓶中,高溫滅菌(121℃,30 min),再接入經(jīng)過(guò)活化培養(yǎng)的BNG-1菌株,進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。選取發(fā)酵培養(yǎng)的條件為20℃、160 r·min-1,5 d后得到種子發(fā)酵液。將種子液按一定比例接種于含有約0.75 L YPD液體培養(yǎng)基的2 L三角瓶中,在20℃、160 r·min-1條件下進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng),每批發(fā)酵24瓶培養(yǎng)一周,兩批共得到36 L發(fā)酵液。第3批和第4批采用無(wú)菌的20 L發(fā)酵罐培養(yǎng),在20℃、100 r·min-1條件下培養(yǎng)兩周,又得到40 L發(fā)酵液。

    1.5.2 BNG-1化合物的提取分離

    菌株BNG-1的76 L發(fā)酵液經(jīng)抽濾分為胞外濾液和菌體兩部分,菌體放在自封袋做好標(biāo)記置于-80℃冰箱中冷凍待用。胞外濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5 L左右,由于浸膏較多,采用萃取將化學(xué)極性部位分段后再采用柱色譜層析進(jìn)行分離純化。用乙酸乙酯按1∶1萃取后分成水相和乙酸乙酯相,其中乙酸乙酯相用水(含20%的MeOH)溶解后用石油醚按1∶1萃取4次,下層水相另作處理。將萃取后的石油醚相濃縮蒸干,用石油醚、水以及甲醇等溶劑均難溶,用丙酮溶解后分層,取上清液粗硅膠拌樣過(guò)正相硅膠柱,依次用 CHCl3/MeOH/H2O(5∶1∶0.1→4∶1∶0.1→3∶1∶0.1→2∶1∶0.1)進(jìn)行梯度洗脫,每個(gè)梯度洗脫500 mL,分成4個(gè)部分,分別為 PEI、PEⅡ、PEⅢ和 PEⅣ。其中 PEI過(guò)正相硅膠柱,依次用CHCl3/MeOH(10∶1→8∶1→6∶1→5∶1)進(jìn)行梯度洗脫,每個(gè)梯度洗脫 300 mL,得到 PEIa、PEIb、PEIc 3個(gè)部分。PEIa部分過(guò)凝膠柱,用乙醇等梯度洗脫,得到PEIa1、PEIa2和PEIa3 3個(gè)部分。其中PEIa1經(jīng)HPLC反復(fù)進(jìn)樣制備得到化合物11(76 mg,16.96 min)和化合物 12(15 mg,26.62 min)。進(jìn)樣量 60μL,流動(dòng)相為乙腈-水(均含0.1%三氟乙酸):0 min,25%乙腈;2 min,25%乙腈;14 min,35%乙腈;25 min,60%乙腈;25 min 30 s,70%乙腈;28 min 30 s,70%乙腈;29 min,25%乙腈。PEIb部分通過(guò)正相硅膠柱,依次用CHCl3/MeOH(10∶1→8∶1→6∶1→5∶1)進(jìn)行梯度洗脫,每個(gè)梯度洗脫300 mL,得化合物13(278 mg)。PEIc部分用氯仿溶解后經(jīng)正相硅膠柱,依次用 CHCl3/MeOH(10∶1→8∶1→6∶1→5∶1)進(jìn)行梯度洗脫,每個(gè)梯度洗脫300 mL,分別得化合物14(15 mg)和化合物15(10 mg)。

    菌體置于-80℃冰箱中冷凍,然后取出自然解凍破壁,依次加入2 L的丙酮和甲醇(MeOH)超聲破碎30min,分別提取3次,提取液減壓濃縮得到總浸膏。將浸膏用水/石油醚按1∶1萃取4次,將萃取后的水相與之前胞外的水相合并,減壓濃縮除去殘余的石油醚,過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱,用水洗脫3個(gè)柱體積,再用 MeOH/H2O(10∶90)洗脫6 L,洗脫液舍棄。繼續(xù)依次用MeOH/H2O(30∶70→60∶40→85∶15→100∶0)梯度洗脫,每個(gè)梯度用量分別為6 L,濃縮得到30%Me(53.86 g)、60%Me(48.74 g)和 85%Me(17.88 g)3個(gè)部分。

    30%Me過(guò)反相RP-18柱,先用10%MeOH洗脫900 mL除雜,再依次用20%MeOH、30%MeOH和50%MeOH洗脫,每個(gè)梯度洗脫900 mL,減壓濃縮得到 30%MeI(8.28 g)、30%MeⅡ(5.55 g)和 30%MeⅢ(4.69 g)。30%MeI部分用水溶解后過(guò) G-25凝膠柱,用蒸餾水洗脫經(jīng)HPLC分析檢測(cè)后合并濃縮得到30%MeIa和30%MeIb兩個(gè)部分。30%MeIa部分用H2O溶解后經(jīng)HPLC反復(fù)進(jìn)樣制備,依次得到化合物16(3 mg,7.98 min)、化合物 17(20 mg,18.37 min)、化合物18(8 mg,22.09 min)和幾個(gè)不純的化合物Ia1、Ia2和Ia3。進(jìn)樣量40μL,流動(dòng)相為乙腈-水(均含0.1%三氟乙酸):0 min,17%乙腈;2 min,17%乙腈;21 min,32%乙腈;22 min,70%乙腈;24 min 30 s,70%乙腈;25 min,17%乙腈。Ia2部分過(guò)凝膠柱得化合物19(20 mg)。30%MeIb也經(jīng)HPLC反復(fù)進(jìn)樣制備,得到化合物化合物20(13 mg,12.43 min)、21(2 mg,14.90 min)和 1個(gè)混合物Ib1。進(jìn)樣量30μL,流動(dòng)相為乙腈-水(均含 0.1%三氟乙酸):0 min,15%乙腈;2 min,15%乙腈;17 min,25%乙腈;18 min,70%乙腈;20.5 min,70%乙腈;21 min,15%乙腈。Ib1過(guò)正相硅膠柱,依次用 CHCl3/MeOH(6∶1→5∶1→4∶1)進(jìn)行梯度洗脫,每個(gè)梯度洗脫300 mL得到化合物22(10 mg)。

    60%Me(48.74 g)部分上正相硅膠柱,依次用 CHCl3/MeOH(16∶1→12∶1→10∶1→8∶1)進(jìn)行梯度洗脫,每個(gè)梯度洗脫1.5 L,得到60%MeI、60%MeⅡ和60%MeⅢ3部分。其中60%MeI經(jīng)凝膠柱分離得到MeIa、MeIb、MeIc和MeId 4個(gè)部分。其中MeIa部分經(jīng)HPLC反復(fù)進(jìn)樣制備,得化合物 23(5 mg)、化合物 24(35 mg)。進(jìn)樣量 40 μL,流動(dòng)相為乙腈-水(均含0.1%三氟乙酸):0 min,15%乙腈;2 min,15%乙腈;26 min,40%乙腈;27 min,80%乙腈;29 min 30 s,80%乙腈;30 min,15%乙腈。

    85%Me部分用粗硅膠拌樣上柱,依次用CHCl3/MeOH(20∶1→16∶1→12∶1→10∶1)進(jìn)行梯度洗脫,每個(gè)梯度洗脫1 L得到9個(gè)部分,其中85%MeⅢ部分過(guò)凝膠柱,得到Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc和Ⅲd。Ⅲd經(jīng)過(guò)正相硅膠柱,依次用 CHCl3/MeOH(20∶1→16∶1→12∶1)進(jìn)行梯度洗脫,每個(gè)梯度洗脫300 mL得到Ⅲd1,Ⅲd1經(jīng)凝膠柱分離純化,依次得化合物25(3 mg)、化合物 26(45 mg)。85%MeⅦ部分過(guò)正相硅膠柱,依次用 CHCl3/MeOH(20∶1→16∶1→12∶1→10∶1)進(jìn)行梯度洗脫,每個(gè)梯度洗脫500 mL,得到Ⅶa、Ⅶb和Ⅶc。Ⅶa部分過(guò)凝膠柱得到Ⅶa1、Ⅶa2和Ⅶa3。Ⅶa3部分經(jīng)HPLC反復(fù)進(jìn)樣制備,得到化合物27(15 mg,7.59 min)和化合物 28(8 mg,9.25 min)。進(jìn)樣量 50 μL,流動(dòng)相為乙腈-水(均含0.1%三氟乙酸):0 min,40%乙腈;2 min,40%乙腈;3 min,50%乙腈;15 min,60%乙腈;15 min 30 s,40%乙腈。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌種鑒定

    2.1.1 顯微鏡菌絲形態(tài)觀(guān)察

    參照文獻(xiàn)[20]中的方法將1.3.2中菌株形態(tài)觀(guān)察結(jié)果記錄如下(放大40倍觀(guān)察),鏡檢結(jié)果顯示菌株 FBZ-1(圖1-a)、BNG-1(圖1-b)符合真菌的形態(tài)特征。

    表1 菌株FBZ-1、BNG-1菌絲體特征[20]Tab.1 M ycelium characters of strains FBZ-1 and BNG-1

    2.1.2 測(cè)序結(jié)果

    從這2株海鞘中也分離鑒定了其他共附生微生物,由于課題原因未做測(cè)序鑒定。菌株FBZ-1和BNG-1送樣均測(cè)序拼接成功。將上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司所測(cè)結(jié)果在NCBI網(wǎng)站比對(duì),種屬歸類(lèi)如表2。

    圖1 菌株 FBZ-1(a)、BNG-1(b)的顯微鏡照片F(xiàn)ig.1 M icrophotographs of strains FBZ-1(a)and BNG-1(b)colony

    從比對(duì)結(jié)果可以得出,F(xiàn)BZ-1屬于淡紫擬青霉屬,BNG-1屬于青霉屬。

    2.2 真菌FBZ-1、BNG-1化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

    從防城港白龍皺瘤海鞘共附生的淡紫擬青霉FBZ-1和北海南汅的冠瘤海鞘共附生的青霉BNG-1這2株真菌發(fā)酵液中,主要采用萃取和柱層析技術(shù)(MCI柱層析、正反相硅膠柱層析、凝膠柱層析及半制備高效液相色譜等)進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物的分離純化,并運(yùn)用波譜學(xué)技術(shù)(HPLC TOFMS、1H-NMR、13C-NMR等)和物理化學(xué)方法,鑒定了其中28個(gè)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

    化合物1:綠色固體。正離子模式的ESI-MS數(shù)據(jù):m/z243.0879[M+H]+,265.069 8[M+Na]+,推斷化合物 1對(duì)應(yīng)分子式為C12H10N4O2。1H-NMR(CD3OD,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH2.52(s,3H),2.54(s,3H),7.73(s,1H),7.93(s,1H)。13C-NMR(126 MHz,Pyr)δ 161.30,151.15,146.96,144.03,142.33,139.09,138.27,130.16,128.97(CH),126.43(CH),19.71(CH3),19.18(CH3)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道一致,因此化合物1鑒定為已知生物堿類(lèi)化合物lumichrome。

    化合物2:熒光黃色無(wú)定型粉末。1H-NMR(CD3OD,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH0.95(t,J=14.8 Hz,3H),1.02(d,J=6.8 Hz,3H),1.43(d,J=6.8 Hz,3H),1.50(m,1H),1.96(m,1H),2.52(m,1H),3.89(m,1H),4.02(m,1H)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道一致,因此化合物2鑒定為已知化合物環(huán)(異亮氨酸-丙氨酸)。

    化合物3:白色固體。正離子模式的ESI-MS數(shù)據(jù):m/z 217.0966[M+H]+,433.186 4[2M+H]+,推斷化合物 3對(duì)應(yīng)分子式為C12H12N2O2。1H-NMR(CD3OD,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH3.07(m,1H),3.43(m,1H),3.97(m,1H),4.42(s,1H),4.61(s,1H),7.04(m,1H),7.13(m,1H),7.32(m,1H),7.48(m,1H)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報(bào)道一致,因此化合物3鑒定為已知生物堿類(lèi) 1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸。

    化合物4:黃色固體。1H-NMR(CD3OD,400MHz)數(shù)據(jù)如下:δH7.47(m,1H),7.79(m,2H),8.45(m,2H),8.68(d,J=12.0 Hz,1H),9.12(s,1H)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報(bào)道一致,因此化合物4鑒定為已知生物堿類(lèi)化合物β-咔啉。

    表2 18S rDNA序列與NCBI中已知序列的比對(duì)結(jié)果Tab.2 18S rDNA sequences com pared w ith known sequences in NCBI

    圖2 菌株FBZ-1中化合物1~10的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structures of com pounds 1~10 from FBZ-1

    化合物5:黃色固體。準(zhǔn)分子離子峰為m/z 211.143 8 [M+H]+,推 斷 分 子 式 為C11H18N2O2。1H-NMR(CD3OD,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH0.93(t,J=6.7 Hz,3H),1.08(d,J=4.0 Hz,3H),1.34(m,1H),1.59(m,1H),1.79(m,1H),1.95(m,4H),2.18(m,1H),3.52(m,2H),3.87(d,J=3.2 Hz,1H),4.22(m,1H)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報(bào)道一致,因此化合物5鑒定為已知化合物環(huán)(異亮氨酸-脯氨酸)。

    化合物6:黃色固體。正離子模式的ESI-MS數(shù)據(jù):m/z227.138 4[M+H]+,249.120 4[M+Na]+,453.270 0[2M+H]+,475.252 0[2M+Na]+,推斷化合物 6對(duì)應(yīng)分子式為C11H18N2O3。1H-NMR(CD3OD,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH0.98(d,J=4.0 Hz,3H),1.01(d,J=4.4 Hz,3H),1.46(m,1H),1.69(m,1H),2.04(m,3H),2.35(m,1H),3.57(m,2H),4.09(s,1H),4.28(t,J=10.8 Hz,1H)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報(bào)道一致,因此化合物6鑒定為已知化合物環(huán)(亮氨酸-羥基脯氨酸)。

    化合物7:無(wú)色無(wú)定型粉末。正離子模式的ESI-MS數(shù)據(jù):m/z 211.144 0[M+H]+,233.125 5[M+Na]+,推斷化合物7對(duì)應(yīng)分子式為 C11H18N2O2。1H-NMR(CD3OD,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH0.97(m,6H),1.54(m,1H),1.93(m,3H),2.02(m,2H),2.31(m,1H),3.52(m,2H),4.15(m,1H),4.27(m,1H)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報(bào)道一致,因此化合物7鑒定為已知化合物環(huán)(亮氨酸-脯氨酸)。

    化合物8:淺黃色無(wú)定型粉末。正離子模式的ESI-MS數(shù)據(jù):m/z 245.128 3[M+H]+,推斷化合物8對(duì)應(yīng)分子式為 C14H16N2O2。1H-NMR(CD3OD,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH1.24(m,1H),1.82(m,2H),2.10(m,1H),3.18(m,2H),3.39(m,1H),3.56(dd,J=18.8,8.0 Hz,1H),4.09(dd,J=11.2,2.8 Hz,1H),4.46(s,1H),7.27(m,5H)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報(bào)道一致,因此化合物8鑒定為已知化合物環(huán)(苯丙氨酸-脯氨酸)。

    化合物9:淡黃色無(wú)定型粉末。正離子模式的 ESI-MS數(shù)據(jù):m/z 300.169 9[M+H]+,推斷化合物 9對(duì)應(yīng)分子式為 C17H21N3O2。1H-NMR(CD3OD,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH0.44(d,J=6.8 Hz,3H),0.57(d,J=6.4 Hz,3H),0.96(m,2H),1.06(m,1H),3.08(m,1H),3.45(m,1H),3.55(m,1H),4.24(m,1H),6.96(m,1H),7.06(m,2H),7.30(m,1H),7.58(m,1H)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]報(bào)道一致,因此化合物9鑒定為已知化合物環(huán)(色氨酸-亮氨酸)。

    化合物 10:黃褐色無(wú)定型粉末。1H-NMR(CDCl3,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH0.77(d,J=6.4 Hz,3H),0.82(t,J=6.4 Hz,3H),1.26(m,2H),1.50(m,1H),3.26(m,1H),3.44(m,1H),3.86(m,1H),4.33(s,1H),6.33(s,1H),7.13(m,1H),7.21(m,1H),7.36(m,1H),7.62(m,1H)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[26]報(bào)道一致,因此化合物10鑒定為已知化合物環(huán)(色氨酸-纈氨酸)。

    化合物11:白色油狀。正離子模式的ESIMS數(shù)據(jù):m/z 164.110 4[M+H]+,推斷化合物11對(duì)應(yīng)分子式為 C10H13NO。1H-NMR(CD3OD,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH1.89(s,1H),2.76(t,J=14.8 Hz,1H),3.37(t,J=14.8 Hz,1H),7.22(m,2H)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[27]報(bào)道一致,因此化合物11鑒定為已知芳香胺類(lèi)化合物N-乙酰苯乙胺。

    化合物12:黃色固體。1H-NMR(CD3OD,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH1.76(t,J=12.8 Hz,2H),2.61(t,J=15.2 Hz,2H),2.90(t,J=15.2 Hz,2H),3.55(t,J=12.8 Hz,2H),4.13(t,J=12.8 Hz,2H),7.22(m,5H)。13C-NMR(126MHz,MeOD)δ172.75,139.96,127.59(CH×2),127.43(CH×2),125.37(CH),60.57(CH2),57.38(CH2),35.03(CH2),30.75(CH2),30.08(CH2)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[28]報(bào)道一致,因此化合物12鑒定為芳香胺類(lèi)化合物N-(4-羥基)丁酰苯乙胺。

    化合物13:黃褐色油狀。正離子模式的ESIMS數(shù)據(jù):m/z 105.071 4[M+H]+,122.096 9[M+NH4]+,推斷化合物 13對(duì)應(yīng)分子式為C8H11N。1H-NMR(CDCl3,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH2.80(t,J=16.0 Hz,2H),3.10(t,J=15.6 Hz,1H),7.40(m,5H)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[29]報(bào)道一致,因此化合物13鑒定為已知芳香胺類(lèi)化合物苯乙胺。

    圖3 菌株BNG-1中化合物11~28的結(jié)構(gòu)Fig.3 Structures of compounds 11~28 from BNG-1

    化合物14:淺黃色結(jié)晶。1H-NMR(CD3OD,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH2.66(t,J=15.2 Hz,2H),3.03(t,J=14.8 Hz,2H),7.03(m,3H),7.31(d,J=8.4 Hz,1H),7.52(d,J=8.0 Hz,1H)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[30]報(bào)道一致,因此化合物14鑒定為已知芳香胺類(lèi)化合物色胺,即吲哚乙胺。

    化合物 15:黃色固體。1H-NMR(CDCL3,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH2.78(t,J=15.2 Hz,2H),3.12(t,J=14.8 Hz,2H),3.48(s,3H),7.04(s,1H),7.13(t,J=14.4 Hz,1H),7.20(t,J=14.4 Hz,1H),7.36(d,J=8.0 Hz,1H),7.61(d,J=8.0 Hz,1H)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[31]報(bào)道一致,因此化合物15鑒定為已知芳香胺類(lèi)化合物N-甲基色胺。

    化合物 16:淡黃色無(wú)定型粉末。1H-NMR(CD3OD,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH0.96(m,3H),2.47(m,1H),2.94(m,1H),3.21(dd,J=17.6,10.0 Hz,1H),4.01(s,1H),4.36(s,1H),6.94(s,1H),7.29(m,5H),8.72(s,1H)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[32]報(bào)道一致,因此化合物16鑒定為已知化合物環(huán)(苯丙氨酸-5-甲基-3,4-脫氫脯氨酸)。

    化合物 17:褐色無(wú)定型粉末。1H-NMR(CD3OD,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH1.73(d,J=6.5 Hz,3H),3.21(m,1H),3.44(m,1H),4.54(m,1H),7.05(m,1H),7.14(m,1H),7.33(m,1H),7.48(m,1H)。13C-NMR(126MHz,MeOD)δ169.45,136.02,128.67,124.82,121.19(CH),118.22(CH),116.70(CH),109.90(CH),103.16,50.96(CH),21.02(CH2),16.11(CH3)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[33]報(bào)道一致,因此化合物17鑒定為已知生物堿類(lèi)化合物 3,4-二氫-3-甲基-β-咔啉-1-酮。

    化合物18:淺褐色固體。正離子模式的ESIMS數(shù)據(jù):m/z206.0772[M+H]+,推斷化合物18對(duì)應(yīng)分子式為C11H11NO3。1H-NMR(CD3OD,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:1H-NMR(CD3OD,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH3.06(m,1H),3.24(m,1H),4.40(m,1H),7.09(t,J=14.0 Hz,1H),7.18(t,J=14.0 Hz,1H),7.23(s,1H),7.42(d,J=8.0 Hz,1H),7.68(d,J=7.2 Hz,1H)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[34]報(bào)道一致,因此化合物18鑒定為已知生物堿類(lèi)化合物2-羥基-3-吲哚丙酸。

    化合物 19:黃褐色無(wú)定型粉末。1H-NMR(C5D5N,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH2.86(m,2H),3.12(m,2H),7.15(d,J=7.8 Hz,1H),7.31(d,J=7.8 Hz,1H)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[35]報(bào)道一致,因此化合物19鑒定為已知化合物對(duì)羥基苯乙胺。

    化合物20:白色無(wú)定型粉末。正離子模式的ESI-MS數(shù)據(jù):m/z[M+H]+,推斷化合物 20對(duì)應(yīng)分子式為 C16H16N4O2。1H-NMR(CD3OD,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH0.79(m,1H),2.01(m,1H),3.20(m,1H),3.51(m,1H),4.07(m,1H),4.33(m,1H),7.06(t,J=14.8 Hz,1H),7.06(m,2H),7.43(m,1H),7.66(d,J=8.0 Hz,1H)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[35]報(bào)道一致,因此化合物20鑒定為已知化合物環(huán)(色氨酸-天冬酰胺)。

    化合物21:無(wú)色固體。1H-NMR(CD3OD,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH3.25(m,1H),3.55(m,1H),4.14(s,1H),7.09(t,J=14.8 Hz,1H),7.18(t,J=15.2 Hz,1H),7.23(s,1H),7.42(d,J=8.0 Hz,1H),7.68(d,J=7.6 Hz,1H)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[36]報(bào)道一致,因此化合物21鑒定為已知化合物色氨酸。

    化合物22:黃色固體。1H-NMR(CDCl3,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH0.98(m,12H),1.2-1.4(m,16H),1.70(m,2H),4.25(m,4H),7.63(m,2H),7.73(m,2H)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[37]報(bào)道一致,因此化合物22鑒定為已知化合物鄰苯二甲酸異辛酯。

    化合物23:白色結(jié)晶。1H-NMR(CD3OD,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH0.92(d,J=6.5 Hz,3H),1.08(d,J=6.5 Hz,3H),1.96(m,3H),2.31(m,1H),2.47(m,1H),3.52(m,2H),4.03(s,1H),4.20(t,J=14.0 Hz,1H)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報(bào)道一致,因此化合物23鑒定為已知化合物環(huán)(纈氨酸-脯氨酸)。

    化合物 24:白色無(wú)定型粉末。1H-NMR(CD3OD,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH0.94(m,6H),1.43(d,J=6.4 Hz,3H),1.60-1.85(m,3H),3.90(m,1H),4.02(m,1H)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[38]報(bào)道一致,因此化合物24鑒定為已知化合物環(huán)(亮氨酸-丙氨酸)。

    化合物 25:淺黃色固體。1H-NMR(CDCl3,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH6.21(d,J=2.0 Hz,1H),6.34(d,J=2.0 Hz,1H),6.84(d,J=8.8 Hz,2H),7.36(d,J=6.8 Hz,2H),8.06(s,1H)。13C-NMR (126 MHz,MeOD)δ181.13,164.86,162.73,158.60,157.69,153.66(CH),130.25(CH×2),123.62,122.18,115.13(CH×2),105.15,98.99(CH),93.65(CH)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[39]報(bào)道一致,因此化合物25鑒定為異黃酮類(lèi)化合物5,7,4-三羥基異黃酮。

    化合物 26:墨綠色無(wú)定型粉末。1H-NMR(C5D5N,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH2.23(s,3H),2.30(s,3H),3.60(s,6H),7.87(s,1H),8.04(s,1H)。13C-NMR (126MHz,Pyr) δ 162.10,151.84,147.73,144.87,143.09,139.86,139.15,131.05,129.74(CH),127.19(CH),49.69(CH3×2),20.44(CH3),19.86(CH3)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[40]報(bào)道一致,因此化合物26鑒定為已知化合物 2,4-N,N-dimethyllumichrome。

    化合物27:白色固體。1H-NMR(CD3OD,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH6.83(m,4H),6.93(dd,J=11.2,6.4 Hz,1H),7.01(dd,J=8.0,2.0 Hz,1H),7.35(dd,J=12.0,8.8 Hz,1H),8.05(dd,J=12.0,8.8 Hz,1H),8.11(s,1H)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[41]報(bào)道一致,因此化合物27鑒定為異黃酮類(lèi)化合物5,7,3,4-三羥基異黃酮。

    化合物28:無(wú)色固體。正離子模式的ESIMS數(shù)據(jù):m/z 255.0652[M+H]+,推斷化合物28對(duì)應(yīng)分子式為 C15H10O4。1H-NMR(CD3OD,400 MHz)數(shù)據(jù)如下:δH6.83(d,J=8.4 Hz,3H),6.93(dd,J=11.2,6.4 Hz,1H),7.35(dd,J=14.0,8.8 Hz,2H),8.05(dd,J=14.0,8.8 Hz,1H),8.11(s,1H)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[42]報(bào)道一致,因此化合物28鑒定為異黃酮類(lèi)化合物7,4-二羥基異黃酮。

    3 討論與展望

    通過(guò)對(duì)FBZ-1、BNG-1兩株真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物多樣性研究,發(fā)現(xiàn)其次代產(chǎn)物種類(lèi)少且結(jié)構(gòu)單一,主要是芳香胺、生物堿和二酮哌嗪,可能與實(shí)驗(yàn)采用的浸提、發(fā)酵的方案有關(guān),具體原因有待后期進(jìn)一步驗(yàn)證。皺瘤海鞘化學(xué)成分研究開(kāi)始較早且比較系統(tǒng),1989年就報(bào)道了在該海鞘中首次發(fā)現(xiàn)的西松烷型二萜類(lèi)成分 styelolide[43]。從中分離得到的化合物類(lèi)型包括核苷[35]、甾醇、萜類(lèi)、神經(jīng)酰胺[44-46]以及肽類(lèi)成分 plicatamide[47-48]和 tunichrome sp-1[49];而從其共附生真菌菌株FBZ-1中分離鑒定的次級(jí)代謝產(chǎn)物以環(huán)二肽類(lèi)居多。冠瘤海鞘化學(xué)成分研究目前較少,分離到的主要有混合甾醇、酰胺和酯類(lèi)物質(zhì)[50-52];從其共附生真菌菌株BNG-1中分離到的化合物有辛酯和酰胺類(lèi),樣品雖不是采自同一批次同一地點(diǎn),但通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)共附生微生物與其宿主代謝產(chǎn)物的化合物類(lèi)型存在相似性。另外,從菌株BNG-1中還分離到一種人體必需的色氨酸(不能自身合成,只能靠從外界攝取而來(lái))。目前該氨基酸在醫(yī)藥和食品行業(yè)用途廣泛,既可以穩(wěn)定抑郁癥患者情緒,還可用作食品添加劑或防腐劑使用[53-54]?;衔?6為對(duì)羥基苯乙胺,通常作為興奮劑使用,還可以用來(lái)緩解偏頭痛以及診斷嗜鉻細(xì)胞瘤,其鹽酸鹽是制備降血脂藥苯扎貝特的中間體(intermediate of bezafibrate)[35,55]?;衔?2可能為溶劑引入的增塑劑成分,化合物25、27和28可能為實(shí)驗(yàn)引入的YPD培養(yǎng)基成分,具體原因有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

    研究表明環(huán)二肽類(lèi)物質(zhì)具有廣泛的生物活性如抑菌、抗腫瘤、抗心腦血管疾病等方面的重要生理活性和應(yīng)用價(jià)值[56-57]。何培青等[58]從北極海洋細(xì)菌Pseudoalteromonas sp.2018中分離鑒定的環(huán)(脯氨酸-酪氨酸)和環(huán)(脯氨酸-亮氨酸)對(duì)辣椒疫霉(Phytophthora capsici)等多種農(nóng)作物病原真菌具有抑制作用,且最小抑制濃度為125~500μg·mL-1。從菌株FBZ-1中分離出7種環(huán)二肽類(lèi)物質(zhì),包括環(huán)(脯氨酸-亮氨酸),而淡紫擬青霉(Purpureocillium sp.)對(duì)多種植物病原線(xiàn)蟲(chóng)都具有生物防治作用[59-60],幾種環(huán)二肽共同作用可能會(huì)增強(qiáng)菌株對(duì)病原真菌的抑制活性,這可能是該菌株防治農(nóng)作物病害的主要機(jī)理。

    由于本研究未產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的新化合物,可能是由于本實(shí)驗(yàn)只使用了YPD一種發(fā)酵培養(yǎng)基且培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單的緣故。具體原因有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。周雅琳等[61]曾采用仿生培養(yǎng)和高鹽脅迫兩種不同的發(fā)酵條件誘導(dǎo)珊瑚共附生真菌產(chǎn)生新的氯代產(chǎn)物,研究表明微生物次級(jí)代謝能力是可以通過(guò)多種途徑加以調(diào)節(jié)的,例如環(huán)境脅迫等。在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的條件下,調(diào)控特殊結(jié)構(gòu)與功能的次代產(chǎn)物的基因可能不能表達(dá),而只有在特殊環(huán)境中才能應(yīng)激產(chǎn)生,從而導(dǎo)致代謝通路可能關(guān)閉[62]。因此,仿生培養(yǎng)和高鹽脅迫將是一個(gè)有效的誘導(dǎo)途徑,使微生物體內(nèi)“沉默的基因”表達(dá)出來(lái),從而獲得良好活性的化學(xué)產(chǎn)物。

    后期將進(jìn)一步優(yōu)化真菌的發(fā)酵條件,嘗試使用不同的海洋培養(yǎng)基,擴(kuò)大發(fā)酵規(guī)模并富集微量成分,以期獲得較為復(fù)雜或構(gòu)型特殊的未知化合物。同時(shí)盡量模擬海洋生物原來(lái)的生活環(huán)境,讓共附生微生物在寡營(yíng)養(yǎng)低鹽的仿生培養(yǎng)基中培養(yǎng),使用低溫低光照的培養(yǎng)條件,從而有更多的機(jī)會(huì)利用氯來(lái)合成結(jié)構(gòu)新穎、生理活性好的新次級(jí)代謝產(chǎn)物。

    課題組前期研究發(fā)現(xiàn)東海主要水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)海鞘優(yōu)勢(shì)種皺瘤海鞘資源單位產(chǎn)量大于200 g·m-2,分布遍及閩北羅源灣至東海最南端的南澳島北部水域,局部的資源單位產(chǎn)量甚至可以達(dá)到濕重10 kg·m-2以上,資源較為豐富;同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)其化學(xué)成分結(jié)構(gòu)類(lèi)型多變,具有抗腫瘤、抗乙肝病毒等顯著生物活性,提示這些物種具有潛在的重要藥用價(jià)值[5]。因此,充分利用這些海鞘類(lèi)污損生物的資源,深入探究其生物活性成分并規(guī)?;_(kāi)發(fā)具有藥用價(jià)值的海洋新藥具有重要的意義。

    猜你喜歡
    海鞘硅膠乙腈
    高純乙腈提純精制工藝節(jié)能優(yōu)化方案
    煤化工(2022年3期)2022-07-08 07:24:42
    它吃掉自己的“腦子”
    改進(jìn)樽海鞘群優(yōu)化K-means算法的圖像分割
    包裝工程(2022年9期)2022-05-14 01:16:22
    污損性海鞘的生態(tài)特點(diǎn)研究展望
    厚樸酚中壓硅膠柱層析純化工藝的優(yōu)化
    中成藥(2017年4期)2017-05-17 06:09:46
    丁二酮肟重量法測(cè)定雙乙腈二氯化中鈀的含量
    粗孔活性硅膠從含鈾廢水中吸附鈾的研究
    神秘膠球席卷海灘
    人參皂苷Rg1鍵合硅膠固定相的制備、表征及應(yīng)用(二)
    成人硅膠吸痰管應(yīng)用幼兒洗胃的體會(huì)
    欧美久久黑人一区二区| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲av综合色区一区| 成人国语在线视频| 午夜免费男女啪啪视频观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲欧洲日产国产| 国产成人精品无人区| 97精品久久久久久久久久精品| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 一二三四社区在线视频社区8| 激情视频va一区二区三区| 久久久久精品国产欧美久久久 | 99热网站在线观看| 女性生殖器流出的白浆| 男女午夜视频在线观看| 久久久久网色| 精品少妇久久久久久888优播| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 成人亚洲精品一区在线观看| 少妇粗大呻吟视频| 好男人视频免费观看在线| 免费不卡黄色视频| 亚洲黑人精品在线| 欧美激情极品国产一区二区三区| 日本五十路高清| 欧美日韩av久久| av一本久久久久| 女警被强在线播放| 成人免费观看视频高清| 日韩电影二区| 欧美 日韩 精品 国产| 又黄又粗又硬又大视频| 国产一区二区 视频在线| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲av片天天在线观看| 国产成人精品无人区| 亚洲第一青青草原| 老熟女久久久| 日本欧美国产在线视频| 黄色毛片三级朝国网站| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产黄频视频在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av | 丰满饥渴人妻一区二区三| av电影中文网址| 色视频在线一区二区三区| 丝袜人妻中文字幕| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲人成电影免费在线| 女警被强在线播放| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 国产精品久久久人人做人人爽| 午夜视频精品福利| 中文字幕精品免费在线观看视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美黄色淫秽网站| 欧美日韩视频精品一区| 男女免费视频国产| 岛国毛片在线播放| 亚洲av美国av| 搡老岳熟女国产| 国产高清视频在线播放一区 | av一本久久久久| 在线av久久热| 少妇人妻 视频| 亚洲五月婷婷丁香| 国产福利在线免费观看视频| 99re6热这里在线精品视频| 国产成人系列免费观看| 18禁观看日本| 亚洲三区欧美一区| 超碰成人久久| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| av天堂久久9| 国产熟女午夜一区二区三区| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 99热网站在线观看| 只有这里有精品99| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲黑人精品在线| 成人黄色视频免费在线看| 母亲3免费完整高清在线观看| 免费观看人在逋| 老司机影院毛片| 大香蕉久久网| 久久鲁丝午夜福利片| 久久av网站| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲图色成人| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 丝袜脚勾引网站| 午夜福利影视在线免费观看| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久久久精品国产欧美久久久 | 18禁国产床啪视频网站| 久久久精品免费免费高清| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲精品国产av蜜桃| 啦啦啦啦在线视频资源| 精品福利观看| 超碰成人久久| 老司机靠b影院| 亚洲视频免费观看视频| 精品一品国产午夜福利视频| 国产又爽黄色视频| 在线观看人妻少妇| www.自偷自拍.com| 韩国精品一区二区三区| 亚洲av综合色区一区| 成年人午夜在线观看视频| 国产精品久久久久成人av| 99国产精品一区二区三区| 欧美日韩av久久| a 毛片基地| 麻豆乱淫一区二区| 一级黄片播放器| 一级黄片播放器| 国产亚洲一区二区精品| 婷婷成人精品国产| 悠悠久久av| 久久久久久久大尺度免费视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲成人免费av在线播放| 国产真人三级小视频在线观看| 国产精品久久久av美女十八| 国产一区有黄有色的免费视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲专区中文字幕在线| 91字幕亚洲| 999精品在线视频| 晚上一个人看的免费电影| 国产精品久久久久久精品古装| 一级黄色大片毛片| 午夜两性在线视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 免费在线观看影片大全网站 | 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 男女无遮挡免费网站观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| kizo精华| 久久久久久久久久久久大奶| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产免费视频播放在线视频| 午夜精品国产一区二区电影| 性高湖久久久久久久久免费观看| 一区在线观看完整版| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产不卡av网站在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 国产精品亚洲av一区麻豆| 午夜福利视频精品| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 99热全是精品| 日本欧美视频一区| 老司机影院毛片| 日本av免费视频播放| 大片电影免费在线观看免费| 国产一区二区 视频在线| 日韩 亚洲 欧美在线| av天堂在线播放| 国产在线免费精品| 亚洲精品自拍成人| 国产成人啪精品午夜网站| 老司机亚洲免费影院| 一个人免费看片子| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 校园人妻丝袜中文字幕| 一区二区三区激情视频| 日韩视频在线欧美| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 久久九九热精品免费| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| av不卡在线播放| www日本在线高清视频| 水蜜桃什么品种好| 欧美成人午夜精品| 亚洲国产成人一精品久久久| 男人舔女人的私密视频| 丁香六月天网| 日韩视频在线欧美| 黄片小视频在线播放| 国产男女超爽视频在线观看| 久久国产精品大桥未久av| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 人成视频在线观看免费观看| 男人操女人黄网站| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 日本wwww免费看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 多毛熟女@视频| 亚洲欧洲日产国产| 黑人欧美特级aaaaaa片| 一级毛片女人18水好多 | 精品一区在线观看国产| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 性色av乱码一区二区三区2| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 成人手机av| 女警被强在线播放| 2018国产大陆天天弄谢| 乱人伦中国视频| 精品久久蜜臀av无| 青青草视频在线视频观看| 国产精品二区激情视频| 男人舔女人的私密视频| 欧美 日韩 精品 国产| 在线观看人妻少妇| h视频一区二区三区| 国产精品九九99| 欧美精品一区二区免费开放| av天堂久久9| 精品国产超薄肉色丝袜足j| videos熟女内射| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美激情高清一区二区三区| 丝袜人妻中文字幕| 国产成人91sexporn| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 黄色a级毛片大全视频| 高清欧美精品videossex| 日韩一区二区三区影片| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲成人国产一区在线观看 | www.精华液| 久久国产亚洲av麻豆专区| 黄色视频在线播放观看不卡| 91字幕亚洲| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 91九色精品人成在线观看| 欧美日韩精品网址| 自线自在国产av| 久久av网站| 国产成人精品久久二区二区91| 日本午夜av视频| av天堂久久9| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产精品一二三区在线看| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲国产精品999| 国产成人精品久久久久久| 女警被强在线播放| 精品第一国产精品| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 热re99久久精品国产66热6| 国产精品久久久av美女十八| 国产精品九九99| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 黄色片一级片一级黄色片| 久久ye,这里只有精品| 无限看片的www在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲人成网站在线观看播放| videosex国产| 国产黄频视频在线观看| 大片电影免费在线观看免费| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲熟女毛片儿| 美女午夜性视频免费| 天天添夜夜摸| 国产极品粉嫩免费观看在线| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 黄色毛片三级朝国网站| 少妇 在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 大香蕉久久成人网| av又黄又爽大尺度在线免费看| 女性被躁到高潮视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲av日韩在线播放| 精品国产一区二区久久| 在线观看国产h片| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲伊人色综图| 丝袜美腿诱惑在线| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产精品国产三级国产专区5o| 免费看不卡的av| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 久久久久久久久免费视频了| 曰老女人黄片| 日本五十路高清| 在线天堂中文资源库| 日韩一本色道免费dvd| 久久久国产一区二区| 日本欧美国产在线视频| 男女午夜视频在线观看| 视频区欧美日本亚洲| 制服诱惑二区| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产av精品麻豆| 免费在线观看黄色视频的| 久久精品国产综合久久久| av欧美777| 成年美女黄网站色视频大全免费| 视频区图区小说| 91精品国产国语对白视频| 久久久久久人人人人人| www.999成人在线观看| 十八禁人妻一区二区| 男女高潮啪啪啪动态图| a 毛片基地| h视频一区二区三区| cao死你这个sao货| 啦啦啦在线观看免费高清www| 电影成人av| 七月丁香在线播放| 午夜91福利影院| 十八禁高潮呻吟视频| 人体艺术视频欧美日本| 七月丁香在线播放| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 无遮挡黄片免费观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| av福利片在线| 国产成人免费无遮挡视频| 久久人人97超碰香蕉20202| 捣出白浆h1v1| 亚洲人成电影免费在线| 美女福利国产在线| 91字幕亚洲| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产成人91sexporn| 丰满少妇做爰视频| 人妻 亚洲 视频| 1024视频免费在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 人妻人人澡人人爽人人| 涩涩av久久男人的天堂| 免费观看人在逋| 一区二区av电影网| 国产成人a∨麻豆精品| 黄色 视频免费看| 亚洲av美国av| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 久久影院123| 秋霞在线观看毛片| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 精品高清国产在线一区| 亚洲精品在线美女| 亚洲,欧美,日韩| 久久精品亚洲av国产电影网| 在线观看国产h片| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 波多野结衣一区麻豆| 国精品久久久久久国模美| 中文字幕亚洲精品专区| 国产一区二区三区综合在线观看| 后天国语完整版免费观看| 亚洲成人手机| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 两性夫妻黄色片| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 99国产精品一区二区三区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 成年美女黄网站色视频大全免费| 中文字幕色久视频| 一本大道久久a久久精品| videos熟女内射| 电影成人av| 9色porny在线观看| 另类精品久久| 免费观看av网站的网址| 欧美久久黑人一区二区| 午夜影院在线不卡| 国产精品av久久久久免费| 亚洲成国产人片在线观看| 无限看片的www在线观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产成人精品久久二区二区91| 精品欧美一区二区三区在线| 色婷婷久久久亚洲欧美| 在线观看免费视频网站a站| 国产黄色免费在线视频| 国产视频首页在线观看| 一区二区三区激情视频| 看免费成人av毛片| 各种免费的搞黄视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 中文字幕高清在线视频| 在线观看人妻少妇| 久久99一区二区三区| 欧美另类一区| 丝袜在线中文字幕| 夫妻性生交免费视频一级片| 婷婷丁香在线五月| 男人爽女人下面视频在线观看| 考比视频在线观看| 男人操女人黄网站| 9191精品国产免费久久| 精品一品国产午夜福利视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 日日夜夜操网爽| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 99热全是精品| 女性生殖器流出的白浆| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 久热爱精品视频在线9| 男女床上黄色一级片免费看| 99香蕉大伊视频| 一级毛片我不卡| 国产91精品成人一区二区三区 | 亚洲欧美激情在线| 精品少妇黑人巨大在线播放| av片东京热男人的天堂| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲男人天堂网一区| 少妇人妻 视频| a 毛片基地| 国产一区二区三区综合在线观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 久久精品久久久久久久性| 精品国产乱码久久久久久男人| av天堂久久9| 国产野战对白在线观看| 中国美女看黄片| 男男h啪啪无遮挡| 精品视频人人做人人爽| 两性夫妻黄色片| 亚洲欧美一区二区三区久久| 欧美变态另类bdsm刘玥| 人人妻人人澡人人看| 下体分泌物呈黄色| 视频区欧美日本亚洲| 国产精品欧美亚洲77777| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 久久久久久久精品精品| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产精品一国产av| 超碰成人久久| 啦啦啦 在线观看视频| 免费黄频网站在线观看国产| 国产一区二区三区av在线| 老司机影院成人| 美女高潮到喷水免费观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 精品福利永久在线观看| 亚洲,一卡二卡三卡| 精品视频人人做人人爽| 国产成人91sexporn| 自线自在国产av| 男人操女人黄网站| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产高清不卡午夜福利| 青春草亚洲视频在线观看| 在线观看一区二区三区激情| 午夜av观看不卡| 亚洲精品日本国产第一区| 国产免费现黄频在线看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 日本欧美国产在线视频| 女人久久www免费人成看片| 国产成人啪精品午夜网站| 丁香六月天网| 男人操女人黄网站| 亚洲一区中文字幕在线| 日本黄色日本黄色录像| 多毛熟女@视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 亚洲综合色网址| 中文字幕制服av| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲国产欧美网| 国产成人一区二区在线| 一级毛片 在线播放| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 在线看a的网站| 国产免费一区二区三区四区乱码| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 国产淫语在线视频| 丝袜人妻中文字幕| 日本欧美国产在线视频| 女性生殖器流出的白浆| av天堂久久9| 精品国产一区二区三区四区第35| 日韩大码丰满熟妇| 久久精品国产综合久久久| 国产一卡二卡三卡精品| 日本vs欧美在线观看视频| 久久国产精品影院| 成人亚洲精品一区在线观看| 免费av中文字幕在线| 成年av动漫网址| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲国产精品999| 亚洲伊人久久精品综合| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 交换朋友夫妻互换小说| 美女福利国产在线| 亚洲,欧美,日韩| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 国产成人精品久久久久久| 国产1区2区3区精品| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 欧美国产精品一级二级三级| 性色av一级| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 亚洲专区中文字幕在线| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲一区二区三区欧美精品| 午夜91福利影院| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 午夜91福利影院| 国产精品二区激情视频| 午夜久久久在线观看| 91成人精品电影| 在线观看免费午夜福利视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产av国产精品国产| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久人人97超碰香蕉20202| 1024视频免费在线观看| 日韩免费高清中文字幕av| 国产欧美亚洲国产| 久久热在线av| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| av在线老鸭窝| 国产麻豆69| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 97精品久久久久久久久久精品| 久久人妻熟女aⅴ| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 久久久国产精品麻豆| 亚洲精品久久午夜乱码| 1024香蕉在线观看| 一边亲一边摸免费视频| 久久久国产欧美日韩av| 中文字幕人妻熟女乱码| 一区二区三区激情视频| 美女大奶头黄色视频| 欧美性长视频在线观看| 国产一区二区激情短视频 | 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲伊人色综图| 一区在线观看完整版| 久久久久久免费高清国产稀缺| 久久99精品国语久久久| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 波野结衣二区三区在线| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 9色porny在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 9色porny在线观看| 国产91精品成人一区二区三区 | 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 老汉色∧v一级毛片| 久久精品国产亚洲av高清一级| 精品少妇内射三级| 国产成人一区二区在线| 久久午夜综合久久蜜桃| 一区福利在线观看| 香蕉国产在线看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 在线观看免费视频网站a站| 男人操女人黄网站| 亚洲国产最新在线播放| 美女午夜性视频免费| 青草久久国产| 老司机深夜福利视频在线观看 | 国产亚洲欧美在线一区二区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 欧美人与善性xxx| 日日爽夜夜爽网站| 岛国毛片在线播放| 国产免费视频播放在线视频| www.av在线官网国产| 一级毛片女人18水好多 | 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久久欧美国产精品| av天堂久久9| 日本黄色日本黄色录像| 高潮久久久久久久久久久不卡| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 日日夜夜操网爽| 成人免费观看视频高清| 国产成人免费无遮挡视频| 国产欧美亚洲国产| 亚洲成人手机| 在线天堂中文资源库| 久久青草综合色| 精品久久久久久久毛片微露脸 | bbb黄色大片| 亚洲成人免费av在线播放| 久久久国产一区二区| h视频一区二区三区|