達(dá)氏鱘dmc1基因的克隆及在精子生成中的表達(dá)分析

向 浩，葉 歡，李創(chuàng)舉，楊俊琳，3，厲 萍，杜 浩，危起偉

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湖北武漢 430070；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430223；3.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，湖北武漢 430072）

Dmc1最早發(fā)現(xiàn)于酵母中，是大腸桿菌（Escherichia coli）RecA 蛋 白 的 同 源 蛋 白［1］。RecA蛋白的另一個(gè)同源蛋白R(shí)ad51除了在減數(shù)分裂中起重要作用外，還參與有絲分裂重組DNA的修復(fù)。Dmc1蛋白和Rad51蛋白共同定位于減數(shù)分裂前期Ⅰ的偶線(xiàn)期，為同源染色體配對(duì)和交叉重組所必需［2］。1996年發(fā)現(xiàn)Dmc1蛋白是哺乳動(dòng)物細(xì)胞減數(shù)分裂特異的重組蛋白，僅在哺乳動(dòng)物處于減數(shù)分裂過(guò)程的生殖細(xì)胞中表達(dá)。人的Dmc1蛋白與酵母的Dmc1蛋白的同源性為54%，存在大腸桿菌RecA蛋白家族中保守的第二結(jié)構(gòu)域部分，包括兩個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)和兩個(gè)DNA結(jié)合區(qū)［3］，表明Dmc1蛋白在進(jìn)化過(guò)程中是高度保守的，同時(shí)也反映了Dmc1蛋白結(jié)構(gòu)上的穩(wěn)定性對(duì)生物體功能的重要性。

減數(shù)分裂中，染色體的正常分離依賴(lài)于合線(xiàn)期同源染色體精確配對(duì)形成的二價(jià)體，而同源重組和聯(lián)會(huì)復(fù)合體是影響同源染色體配對(duì)的主要因素［4-5］。在酵母菌 （Saccharomyces cerevisiae）中，一些減數(shù)分裂必需或特異基因如dmc1、rad51和hop1已被克?。?-8］。研究發(fā)現(xiàn)，酵母dmc1基因的突變和敲除都會(huì)使減數(shù)分裂停滯在偶線(xiàn)期，導(dǎo)致同源染色體聯(lián)會(huì)失敗，減數(shù)分裂細(xì)胞內(nèi)積聚大量的雙鏈斷裂（DSB）重組中間體［9］，表明dmc1在減數(shù)分裂的同源染色體配對(duì)和交叉重組中起著重要的作用［10］。近年來(lái)，不同倍性鯽鯉（Carassius auratus×Cyprinus carpio）［11］、日本鰻鱺 （Anguilla japonica）［12］、 蠑 螈 （Cynops orientalis）［13］、牦牛（Bos grunniens）和犏牛（Bos grunniens × Bos taurus）［14］、小 鼠 （Mus musculus）［3，6］、人（Homo sapiens）［3，6，15］等物種中克隆得到 dmc1的同源基因，而有關(guān)達(dá)氏鱘（Acipenser dabryanus）dmc1基因的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。小鼠dmc1基因在減數(shù)分裂Ⅰ細(xì)線(xiàn)期到偶線(xiàn)期中特異表達(dá)，為同源染色體聯(lián)會(huì)配對(duì)所必需。若dmc1突變或者被敲除，會(huì)導(dǎo)致減數(shù)分裂停滯在偶線(xiàn)期，不會(huì)出現(xiàn)同源染色體聯(lián)會(huì)或在少數(shù)非同源染色體之間出現(xiàn)聯(lián)會(huì)異常［16］；另外，犏牛睪丸組織dmc1基因低水平表達(dá)所表現(xiàn)出的減數(shù)分裂障礙與小鼠dmc1基因突變和敲除的表型一致，表明睪丸組織dmc1基因的低表達(dá)可能與犏牛的雄性不育有一定的關(guān)系，進(jìn)一步說(shuō)明dmc1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞減數(shù)分裂的同源重組過(guò)程中起著重要的作用［14］。蠑螈dmc1基因在前細(xì)線(xiàn)期高水平表達(dá)，并一直持續(xù)到精子生成階段［13］。日本鰻鱺中發(fā)現(xiàn)dmc1基因僅在減數(shù)分裂Ⅰ的早期表達(dá)［12］，并一直持續(xù)到粗線(xiàn)期，但其表達(dá)量逐漸減少。在不同倍性鯽鯉中，dmc1基因也只在其早期卵巢或者精巢中特異表達(dá)［11］，顯示dmc1基因在減數(shù)分裂過(guò)程中的功能保守性。

鱘魚(yú)類(lèi)是現(xiàn)存最早的脊椎動(dòng)物之一，已生存超過(guò)2億年，具有重要的進(jìn)化地位。達(dá)氏鱘隸屬鱘形目（Acipenseriformes），鱘科（Acipenseridae），鱘屬，又名沙臘子、長(zhǎng)江鱘，純淡水定居性魚(yú)類(lèi)，是長(zhǎng)江珍稀瀕危魚(yú)類(lèi)，為國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物，對(duì)其開(kāi)展種質(zhì)資源保護(hù)研究具有重要意義。目前有關(guān)達(dá)氏鱘的研究主要集中在生物形態(tài)學(xué)［17-18］、種群生態(tài)學(xué)［19-20］、遺傳學(xué)及物種鑒定方面［21］。達(dá)氏鱘生殖發(fā)育相關(guān)分子研究進(jìn)行了dead end［22］、vasa［23］基因的表達(dá)特征和功能分析。本研究利用PCR技術(shù)克隆得到達(dá)氏鱘dmc1基因的編碼區(qū)序列，利用生物信息學(xué)方法分析達(dá)氏鱘dmc1基因編碼區(qū)特征和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系；并采用RT-PCR分析達(dá)氏鱘dmc1基因在其不同組織和不同發(fā)育時(shí)期精巢的表達(dá)特征，以期獲得達(dá)氏鱘減數(shù)分裂特異標(biāo)記基因，為達(dá)氏鱘初級(jí)和次級(jí)精母細(xì)胞的鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)及樣品

實(shí)驗(yàn)用魚(yú)為全人工繁殖1～3齡的子二代達(dá)氏鱘，來(lái)自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所荊州太湖試驗(yàn)場(chǎng)。分別取試驗(yàn)魚(yú)心、肝、脾、腎、鰓、腸、垂體、下丘腦、精巢和卵巢等組織，在液氮中速凍后，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?duì)于不同發(fā)育時(shí)期的精巢組織，取一部分用Bouin’s試液固定12～16 h后，置于70%乙醇中4℃保存。

1.2 達(dá)氏鱘精巢不同發(fā)育時(shí)期組織學(xué)染色

不同發(fā)育時(shí)期的達(dá)氏鱘精巢組織在Bouin’s試液中固定后經(jīng)酒精脫水、二甲苯透明，石蠟包埋切片，切片的厚度為4μm；用蘇木精-伊紅染色法染色（Carazzi蘇木精、0.2%伊紅水溶液），中性樹(shù)膠封片。正置熒光顯微鏡（DM5000B，Leica）觀(guān)察并拍照。

1.3 RNA提取及cDNA的制備

使用 RNeasy Plus Mini Kit（Qiagen，Cat No.74134）試劑盒提取各種組織的總RNA，RNA濃度和純度用核酸測(cè)定儀（Nanodrop 2000）測(cè)定，并用DNaseⅠ（TaKaRa）消化處理總RNA以消除基因組DNA的殘留，最后1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。采用 PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser（TaKaRa，Cat No.RR047A）試劑盒合成cDNA第一鏈，操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。合成的cDNA于-20℃保存?zhèn)溆?，用于后續(xù)編碼區(qū)序列克隆和熒光定量PCR分析。

1.4 達(dá)氏鱘dmc1基因編碼區(qū)序列的獲得

根據(jù)達(dá)氏鱘性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)序列設(shè)計(jì)上、下游引物Dmc1-Fw和Dmc1-Rv（表1），以上述反轉(zhuǎn)錄獲取的精巢cDNA為模板，擴(kuò)增出dmc1基因的編碼區(qū)序列。PCR擴(kuò)增體系為25μL：上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，模板cDNA 1μL，10×PCR Buffer：2.5μL，MgCl2：2.0μL，dNTP：0.5 μL，Taq酶：0.5μL，ddH2O：18.0μL。擴(kuò)增條件為：94℃變性4 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃1 min 30 s，38 cycles；72℃延伸 10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收純化目的片段，然后克隆到pMD19-T載體上，16℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 Trans5α大腸桿菌（Escherichia coli），經(jīng) Ampicillin抗性篩選，挑取陽(yáng)性菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR鑒定，并由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 Dm c1序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

將測(cè)序所得核苷酸序列在NCBI中BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)，使用ORF Finder確定開(kāi)放閱讀框，并推導(dǎo)其相應(yīng)的氨基酸序列；利用TMHMMServer 2.0對(duì)蛋白的跨膜區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)；使用 Signal P 4.1 Server預(yù)測(cè)信號(hào)肽；ExPASy ProtParam對(duì)所推測(cè)的蛋白質(zhì)基本物理化學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析；采用CLUSTAL X軟件對(duì)核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行同源性的比對(duì)分析；利用MEGA 7.0軟件中Neighbor-joining方法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，并進(jìn)行1 000次自展檢驗(yàn)（Bootstrap）評(píng)估進(jìn)化樹(shù)分支可信度。

1.6 達(dá)氏鱘dmc1基因的組織表達(dá)特征分析

為分析dmc1基因在2齡達(dá)氏鱘雌、雄個(gè)體不同組織的表達(dá)特征，以各種組織cDNA為模板，用dmc1基因特異引物Dmc1-F1和Dmc1-R1（表1）進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，以β-actin為內(nèi)參。反應(yīng)體系：1μL cDNA為模板，上游、下游引物各0.5 μL，10×PCR Buffer：2.5μL，MgCl2：2.0μL，dNTP：0.5μL，Taq酶：0.5μL，ddH2O：18μL。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4 min；94℃ 變性30 s，54℃ 復(fù)性30 s，72℃延伸20 s，反應(yīng)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7 達(dá)氏鱘dmc1基因在不同發(fā)育時(shí)期精巢的表達(dá)分析

為驗(yàn)證設(shè)計(jì)的定量PCR引物Ad Dmc1-qRT-F和Ad Dmc1-qRT-R（表1）的可行性，以達(dá)氏鱘精巢cDNA為模板，用ddH2O做連續(xù)10倍梯度稀釋?zhuān)?個(gè)濃度梯度，從1到1∶1×104，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行熒光定量PCR來(lái)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。20μL熒光定量PCR體系：模板1μL，熒光定量PCR上、下游引物各0.4μL，2×PowerUpTMSYBR?Green Master Mix 10μL，ddH2O 8.5μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性15 s，57℃退火 15 s，72℃延伸 15 s，讀板溫度 77℃，讀板時(shí)間5 s；40次循環(huán)，做熔解曲線(xiàn)分析溫度為60～95℃。根據(jù)熒光值的變化規(guī)律，系統(tǒng)將自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和熔解曲線(xiàn)。

以上述逆轉(zhuǎn)錄獲得的達(dá)氏鱘不同發(fā)育時(shí)期的精巢cDNA為模板，采用qRT-PCR技術(shù)分析dmc1基因在不同發(fā)育時(shí)期精巢的表達(dá)情況。20 μL PCR反應(yīng)體系為：2×PowerUpTMSYBR?Green Master Mix 10μL，上、下游引物各0.4μL，ddH2O 8.5μL。PCR反應(yīng)程序同制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行的熒光定量PCR反應(yīng)程序。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行，以達(dá)氏鱘β-actin為內(nèi)參，用滅菌雙蒸水代替模板作為陰性對(duì)照。應(yīng)用2-ΔΔCT法確定dmc1基因mRNA表達(dá)量，利用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著，P＜0.01時(shí)認(rèn)為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 dmc1基因編碼區(qū)序列特征分析

獲得達(dá)氏鱘Dmc1開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）為 1 029 bp，編碼 342個(gè)氨基酸。ExPASy ProtParam分析達(dá)氏鱘Dmc1前體蛋白的理化性質(zhì)，推測(cè)達(dá)氏鱘 Dmc1的分子式為C2964H4901N1029O1223S255，總共包括10 372個(gè)原子，其蛋白質(zhì)分子量（protein molecular weight，Mr）為82.696 kDa，理論等電點(diǎn)（isoelectric point，pI）為5.04；該蛋白由22種氨基酸組成，其不穩(wěn)定指數(shù)（instability index）為 46.85，屬于不穩(wěn)定蛋白；親水性平均指數(shù)為0.829，屬于疏水性蛋白。

利用SignalP 4.1 Server在線(xiàn)分析，結(jié)果顯示該預(yù)測(cè)蛋白不存在信號(hào)肽序列，也未發(fā)現(xiàn)跨膜區(qū)，表明其不是分泌性蛋白、跨膜蛋白。結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示：達(dá)氏鱘Dmc1蛋白與其它物種一樣都含有大腸桿菌RecA蛋白家族保守的第二結(jié)構(gòu)域（63-342）、Rad51＿DMC1＿radA，B（103-337）結(jié)構(gòu)域和 recomb＿DMC1（26-340）結(jié)構(gòu)域。同時(shí)在這些保守區(qū)域內(nèi)還含有兩個(gè)嘌呤核苷酸的結(jié)合位點(diǎn)（motifs A和B）和兩個(gè)DNA結(jié)合區(qū)（L1和 L2）（圖1）。

表1 PCR相關(guān)引物序列Tab.1 Primers used for PCR

圖1 達(dá)氏鱘Dm c1氨基酸序列的預(yù)測(cè)及與其他物種Dm c1氨基酸序列的比較Fig.1 Predicted Dm c1 am ino acid sequence of Acipenser dabryanus and alignment w ith other species

2.2 達(dá)氏鱘dmc1基因同源性分析

利用CLUSTAL X分析達(dá)氏鱘Dmc1和已經(jīng)報(bào)道的其他物種Dmc1的氨基酸序列同源性。多重比對(duì)達(dá)氏鱘、日本鰻鱺、尼羅羅非魚(yú)、斑馬魚(yú)、鯽鯉、青鱂、蠑螈、爪蟾、小鼠和人的Dmc1氨基酸序列（表2），發(fā)現(xiàn)在這些物種中，Dmc1氨基酸序列具有較高的同源性，其中任意兩者的同源一致性都在85%以上，并且都含有兩個(gè)可以結(jié)合核酸motif（GEFRTGKT和 LLIID），這表明 Dmc1蛋白在進(jìn)化過(guò)程中可能比較保守。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示（圖2），Ad Dmc1屬于RecA家族Dmc1蛋白分支，且屬于四足動(dòng)物類(lèi)分支，與硬骨魚(yú)類(lèi)分支分開(kāi)。

表2 達(dá)氏鱘Dm c1氨基酸序列和其他物種的相似性比較Tab.2 Percentage identities in am ino acid sequence of Ad Dm c1 w ith other species

圖2 Dm c1氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（達(dá)氏鱘Dm c1加粗顯示）Fig.2 Phylogenetic relationship of fish Dm c1 proteins（bold font shows Acipenser dabryanus Dm c1）

2.3 達(dá)氏鱘dmc1基因在不同組織中的表達(dá)特征

采用RT-PCR方法分析dmc1基因在達(dá)氏鱘雌、雄個(gè)體9種組織中的表達(dá)特征。如圖3所示，在達(dá)氏鱘雌雄個(gè)體9種組織中，dmc1基因僅在精巢和卵巢中表達(dá)；而在心、肝、脾、腎、鰓、腸、垂體和下丘腦中未發(fā)現(xiàn)dmc1的表達(dá)，表明dmc1基因?yàn)檫_(dá)氏鱘性腺特異表達(dá)。

2.4 達(dá)氏鱘dmc1基因real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

將達(dá)氏鱘精巢cDNA模板按10倍倍比稀釋5個(gè)濃度梯度，對(duì)dmc1基因進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、熔解曲線(xiàn)（圖4）并進(jìn)行分析。可知標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中的拷貝數(shù)與CT值兩者基本呈線(xiàn)性反比關(guān)系，基因片段回歸方程為：Y=-3.176X+34.531，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)R2=0.996，表明線(xiàn)性關(guān)系良好，擴(kuò)增效率為106.486%，熔解曲線(xiàn)顯示單一的峰，無(wú)非特異性峰，擴(kuò)增產(chǎn)物單一，無(wú)非特異性擴(kuò)增及引物二聚體形成。符合實(shí)驗(yàn)的要求，可用于后續(xù)目的基因片段的定量分析。

2.5 達(dá)氏鱘不同發(fā)育時(shí)期精巢中dmc1基因m RNA的表達(dá)水平

根據(jù)HE染色結(jié)果可將達(dá)氏鱘精巢發(fā)育分為6個(gè)時(shí)期：0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期。0期精巢中，未形成精小囊，可見(jiàn)少量原始生殖細(xì)胞（圖5-a）；Ⅰ期精巢中，精原細(xì)胞增殖，可見(jiàn)大量A型精原細(xì)胞（圖5-b）；Ⅱ期精巢中出現(xiàn)B型精原細(xì)胞，但主要還是以A型精原細(xì)胞為主（圖5-c）；Ⅲ期精巢中，以初級(jí)精母細(xì)胞為主，存在著少量次級(jí)精母細(xì)胞（圖5-d）；Ⅳ期精巢中，有大量初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞，還有少量的精子（圖5-e）；Ⅴ期精巢中，主要是精子（圖5-f）。

Real-time PCR結(jié)果（圖6）顯示，在0期和 I期的精巢中，dmc1基因沒(méi)有表達(dá)，Ⅱ期精巢中其有微弱表達(dá)；在Ⅲ期和Ⅳ期中其表達(dá)量急劇增加，并在Ⅳ期達(dá)到最高水平；Ⅴ期精巢中其表達(dá)量顯著性降低（P＜0.05）。

圖3 達(dá)氏鱘dmc1基因的組織表達(dá)特性Fig.3 Tissue-specfic expression of Addmc1

圖4 dmc1基因擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)與熔解曲線(xiàn)Fig.4 Am p lification dynam ics curve and m elting curve of dm c1

圖5 達(dá)氏鱘精巢不同發(fā)育時(shí)期形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.5 M orphological structure of testis of Acipenser dabryanus at different development stages

3 討論

本研究成功克隆了達(dá)氏鱘dmc1基因的編碼區(qū)序列，獲得開(kāi)放閱讀框（ORF）為1 029bp，編碼342個(gè)氨基酸。與其他魚(yú)類(lèi)Dmc1氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)達(dá)氏鱘Dmc1與青鱂同源性最高，為91.23%，同時(shí)與人類(lèi)、小鼠也具有較高的相似性，分別為92.06%和90.88%。蛋白預(yù)測(cè)分析表明，達(dá)氏鱘Dmc1與其他物種一樣都含有大腸桿菌RecA蛋白家族保守的第二結(jié)構(gòu)域、recomb＿DMC1結(jié)構(gòu)域和Rad51＿DMC1＿radA，B結(jié)構(gòu)域，并且在這些保守區(qū)域內(nèi)還含有兩個(gè)嘌呤核苷酸的結(jié)合位點(diǎn)（motifs A和 B）［9］和兩個(gè) DNA結(jié)合區(qū)（L1、L2），其中motif A（GEFRTGKT）是ATP/GTP結(jié)合位點(diǎn)，這個(gè)motif廣泛存在于Dmc1及同源蛋白、DNA重組與修復(fù)蛋白R(shí)ecA和Rad51中［15］。根據(jù)Dmc1的多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，Ad Dmc1屬于RecA家族Dmc1蛋白分支，且屬于四足動(dòng)物類(lèi)分支，與硬骨魚(yú)類(lèi)分支分開(kāi)，初步認(rèn)為本研究克隆得到的序列是達(dá)氏鱘dmc1基因。

圖6 達(dá)氏鱘精巢不同發(fā)育時(shí)期dmc1基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平Fig.6 Relativem RNA level of dmc1 gene of testis in Acipenser dabryanus at different development stages

對(duì)多種魚(yú)類(lèi)研究發(fā)現(xiàn)，dmc1基因在不同組織的表達(dá)特征較為保守，即僅在性腺中特異表達(dá)。在紅鯽、鯉、四倍體鯽鯉及三倍湘云鯽中［11］，dmc1基因只在其早期卵巢或者精巢中特異表達(dá)。在第四代雌核發(fā)育二倍體鯽鯉中（G4）［24］中，同樣發(fā)現(xiàn)dmc1基因只在G4性腺中表達(dá)。本研究通過(guò)RTPCR分析發(fā)現(xiàn)，達(dá)氏鱘dmc1基因也只在性腺中特異表達(dá)，說(shuō)明其可能只在性腺中發(fā)揮作用。

在達(dá)氏鱘不同發(fā)育時(shí)期精巢的研究結(jié)果表明，dmc1基因在0～Ⅰ期精巢中不表達(dá)；在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期精巢中其表達(dá)量逐漸升高，并在Ⅳ期精巢中達(dá)到最高；在Ⅴ期精巢中，其表達(dá)量顯著性下降（P＜0.05）。結(jié)合HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0期精巢中未形成精小囊，可見(jiàn)少量原始生殖細(xì)胞；Ⅰ期精巢中精原細(xì)胞增殖，可見(jiàn)大量A型精原細(xì)胞；Ⅱ期精巢中出現(xiàn)B型精原細(xì)胞，但主要還是以A型精原細(xì)胞為主；Ⅲ期精巢中，以初級(jí)精母細(xì)胞為主，存在著少量次級(jí)精母細(xì)胞；Ⅳ期精巢中，有大量初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞，還有少量的精子；Ⅴ期精巢中，主要是精子，初步推斷dmc1基因主要在精母細(xì)胞中表達(dá)。這與dmc1基因在小鼠中的表達(dá)特征類(lèi)似，小鼠dmc1基因僅在減數(shù)分裂I細(xì)線(xiàn)期到偶線(xiàn)期的精母細(xì)胞中特異表達(dá)［9］。然而，在蠑螈的研究中，發(fā)現(xiàn)dmc1基因在減數(shù)分裂I細(xì)線(xiàn)期開(kāi)始顯著表達(dá)，且一直持續(xù)至精子生成階段，即dmc1基因不僅在精母細(xì)胞中表達(dá)，而且在精子細(xì)胞中也表達(dá)［13］，這表明dmc1基因可能在單倍體細(xì)胞（如精子細(xì)胞）中發(fā)揮一定的作用，并非僅調(diào)控減數(shù)分裂過(guò)程中染色體的聯(lián)會(huì)和重組。日本鰻鱺中，dmc1基因只在減數(shù)分裂Ⅰ的早期表達(dá)［12］，并持續(xù)到粗線(xiàn)期，但其表達(dá)量逐漸降低。綜上所述，雖然dmc1基因在表達(dá)時(shí)期存在種間特異性，但其主要在減數(shù)分裂過(guò)程中起作用。

精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞增殖及分化的過(guò)程，其中減數(shù)分裂又是最為關(guān)鍵的步驟。在此過(guò)程中，一些基因的存在與否、表達(dá)水平對(duì)形成具有活性的成熟精子有著至關(guān)重要的作用［25］。研究表明，dmc1基因在犏牛睪丸組織中低水平表達(dá)所表現(xiàn)出的減數(shù)分裂障礙與小鼠dmc1基因突變、敲除的表型一致，表明dmc1基因的低水平表達(dá)與犏牛的雄性不育有一定關(guān)系［14］，這可能對(duì)治療雄性不育提供新思路。在酵母中，dmc1基因的突變導(dǎo)致減數(shù)分裂中的DSBs修復(fù)大幅減少，出現(xiàn)聯(lián)會(huì)紊亂。而在人和小鼠的雄性個(gè)體中，dmc1基因的突變使聯(lián)會(huì)紊亂，造成精子生成障礙。與哺乳動(dòng)物不同，青鱂缺失dmc1基因仍會(huì)產(chǎn)生少量畸形精子，暗示青鱂中存在 DSBs修復(fù)的補(bǔ)償途徑［26］。dmc1基因作為減數(shù)分裂過(guò)程中的特異表達(dá)基因，能標(biāo)記生殖細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂的開(kāi)始，有助于闡述一些物種從有絲分裂到減數(shù)分裂的形態(tài)轉(zhuǎn)變機(jī)制［13］。經(jīng)過(guò)十多年的發(fā)展，魚(yú)類(lèi)生殖細(xì)胞移植技術(shù)已成功應(yīng)用到多種魚(yú)類(lèi)，在種質(zhì)資源保存、增殖放流和物種恢復(fù)方面具有重大的應(yīng)用潛力。近年來(lái)有關(guān)達(dá)氏鱘精原細(xì)胞移植的研究已經(jīng)取得階段性成果，但高效的移植依賴(lài)于精原干細(xì)胞的體外增殖培養(yǎng)。前期已開(kāi)展了達(dá)氏鱘精原細(xì)胞培養(yǎng)方面的工作，但對(duì)培養(yǎng)的達(dá)氏鱘精原干細(xì)胞鑒定還有所欠缺。目前，已鑒定的達(dá)氏鱘生殖細(xì)胞標(biāo)記基因有dnd和vasa，但是它們除了在精原細(xì)胞表達(dá)外，在精母細(xì)胞中也有表達(dá)。因此，有必要鑒定在特異類(lèi)型生殖細(xì)胞表達(dá)的基因。本研究中dmc1基因在精子生成中所表現(xiàn)出的結(jié)果，推斷其可能為減數(shù)分裂標(biāo)記基因，將為后續(xù)體外培養(yǎng)精原干細(xì)胞的鑒定奠定基礎(chǔ)。