高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定火鍋底料中的羅丹明B

□ 陳瑞蓮 佛山市食品藥品檢驗檢測中心

羅丹明B又名玫瑰紅B或堿性玫瑰精，俗稱花粉紅，是一種鮮桃紅色的人工合成堿性熒光染料[1]，常用于有色玻璃、礦業(yè)和鋼鐵等行業(yè)[2]。由于羅丹明類染料具有潛在的致癌和致突變性，中國衛(wèi)生部已經(jīng)將羅丹明B列于《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）》中[3]，但由于羅丹明B著色效果好，色澤鮮亮，被一些不法商家應(yīng)用于辣椒及其制品和調(diào)味醬等的染色[4]。因此，對羅丹明B的快速檢測方法進(jìn)行研究及其重要。目前，常用于羅丹明B檢測的前處理方法主要有凝膠色譜凈化法[5]、直接提取法[6]、固相萃取柱凈化法[7]等，本文采用C18固相萃取小柱凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對羅丹明B進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，該法溶劑消耗量少，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均滿足實驗要求，適合于火鍋底料中羅丹明B的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅丹明B購自德國Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純），購自德國默克公司；C18固相萃取小柱（3 mL，500 mg），使用前依次用5 mL甲醇、5 mL水活化。

1.2 儀器與設(shè)備

Quattro Premier XE三重四級桿質(zhì)譜儀（配有Acquity UPLC超高效液相色譜儀及電噴霧離子源）美國Waters公司；固相萃取裝置；電子天平；渦旋振蕩器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；離心機。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用初始流動相將標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成1.0、2.0、5.0、25.0 ng/mL及50.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品的提取

稱取2.0 g火鍋底料于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈∶1%乙酸水=6∶1的溶液進(jìn)行提取，渦旋1 min后置于超聲波清洗機中超聲20 min，期間振搖一次。超聲結(jié)束后于8 000 r/min離心10 min，上清液過濾后待凈化。

1.3.3 樣品的凈化

將上述過濾液全部轉(zhuǎn)移至活化后的C18固相萃取小柱中，待其自然流盡后，依次用3 mL水、3 mL甲醇-水（1∶1）洗滌，最后用5 mL氨水-甲醇（1∶9）洗脫，收集全部洗脫液，流速不超過1 mL/min。將洗脫液在50 ℃下氮氣吹干，用初始流動相定容至1 mL，渦旋混勻后，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，用UPLC-MS/MS測定。

1.3.4 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色 譜 柱：Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。柱溫35 ℃；流動相：A相為乙腈，B相為0.05%甲酸水溶液。梯度洗脫程序：0～0.01 min，40%A；0.01～1.00 min，40%～70%A；1.00～2.00 min，70%～90%A；2.00～3.00 min，90% ～ 90%A；3.00～ 3.01 min，90%～40%A；3.01～6.00 min，40%A。流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式；毛細(xì)管電壓3.0 kV；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣流量700 L/min。

表1 羅丹明B保留時間及質(zhì)譜參數(shù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

取濃度為300 ng/mL的羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過注射泵與適當(dāng)流速的流動相共同進(jìn)入質(zhì)譜儀，主要對離子源參數(shù)中的毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流速以及碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，在最佳質(zhì)譜參數(shù)下（見表1），得到羅丹明B的MRM圖，見圖1。

2.2 色譜條件的選擇

羅丹明B可溶于水、丙酮、乙腈等溶劑，對于質(zhì)譜常用流動相甲醇和乙腈，乙腈的洗脫效果高于甲醇，因此選擇乙腈-水作為流動相，加入0.05%甲酸促進(jìn)羅丹明B的電離。

圖1 羅丹明B的MRM圖

圖2 羅丹明B的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 回歸方程及相關(guān)系數(shù)表

表3 回收率及精密度

2.3 市售火鍋底料中羅丹明B的檢測結(jié)果

本研究按照上述方法，測定了市售的12種火鍋底料（多油型或少油型），均未檢出羅丹明B，也從一定程度上說明，目前本地區(qū)的火鍋底料食品暫無違法添加羅丹明的情況。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將1.3.1方法中配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液上機測定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖2），并計算出相關(guān)系數(shù)（r），結(jié)果見表2。由實驗結(jié)果可知，回歸方程相關(guān)系數(shù)r大于0.999 9，線性關(guān)系良好。

2.4.2 回收率和精密度

在3個火鍋底料樣品中分別加入低、中、高濃度的待測物，每個濃度做6個平行試驗，計算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，實驗結(jié)果見表3。由實驗結(jié)果可知，回收率在90.3%～97.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.1%～9.3%，回收率高，重現(xiàn)性好，具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性，能滿足定量檢測的要求。

3 結(jié)論

本文采用乙腈+1%乙酸水做為火鍋底料的提取液，經(jīng)過C18固相萃取柱凈化后，經(jīng)過BEH C18柱，以乙腈和0.05%甲酸水為流動相進(jìn)行梯度洗脫，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測模式下進(jìn)行定性定量分析羅丹明B的含量，該法比SN/T 2430-2010《進(jìn)出口食品中羅丹明B的檢測方法》簡單快捷，凈化不需要用凝膠色譜凈化系統(tǒng)，節(jié)省了溶劑和時間，且回收率高，重現(xiàn)性好，可作為火鍋底料中羅丹明B的快速檢測方法。