膜聯(lián)蛋白A1及其模擬肽Ac2-26對(duì)高糖誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響

陳建康，嚴(yán)瑜，潘曉莉，周密，張文泉，楊潔，朱鵬立

（福建省立醫(yī)院老年科，福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，福建省臨床老年病研究所，福州 350001）

2型糖尿病病程長(zhǎng)，易導(dǎo)致心、腦、腎、血管等器官發(fā)生并發(fā)癥。糖尿病心肌病變是主要并發(fā)癥之一，以心力衰竭為主要表現(xiàn)，嚴(yán)重可導(dǎo)致患者死亡。糖尿病心肌病變機(jī)制尚未明確，目前多認(rèn)為與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞死亡、自噬等有關(guān)［1］。炎癥反應(yīng)是糖尿病導(dǎo)致心肌病變的重要原因之一，已有研究［1-3］證實(shí)炎癥反應(yīng)可以使氧化應(yīng)激活性氧簇（reactive oxygen species，ROS） 增加，促進(jìn)粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的聚集和遷移，增加炎癥復(fù)合物形成，刺激炎性細(xì)胞因子［腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β （interleukin-1β，IL-1β） 等］分泌，增加轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1） 表達(dá)，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，進(jìn)一步造成心肌重塑，形成糖尿病心肌病變。目前，一些研究［2-6］表明通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)可改善糖尿病心肌病變。

已有研究［7-8］表明膜聯(lián)蛋白A1是重要的抗炎物質(zhì)，它通過(guò)抑制磷脂酶A2 （phospholipase A2，PLA2）來(lái)減少炎癥反應(yīng)復(fù)合物形成；抑制炎性細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β等） 分泌，改善炎癥反應(yīng)。模擬肽Ac2-26是膜聯(lián)蛋白A1的小分子片段，由體外獲得，具有與膜聯(lián)蛋白A1相似生物學(xué)效應(yīng)［9］。本課題組前期研究［10］發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白A1改善糖尿病大鼠心功能可能與炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究通過(guò)體外研究探討膜聯(lián)蛋白A1及模擬肽Ac2-26對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響。

1.1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、儀器及試劑

出生3 d內(nèi)的清潔級(jí)SD大鼠購(gòu)于福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院動(dòng)物中心［動(dòng)物質(zhì)量許可證號(hào)：SYXK （閩）2017-0011］，雌雄不限。主要儀器和試劑：TP800 型實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀 （日本 TaKaRa公司）、超凈工作臺(tái) （常州普天儀器制造有限公司）、CO2培養(yǎng)箱 （德國(guó)科峻公司）、流式細(xì)胞儀 （美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）、DMEM培養(yǎng)基 （美國(guó) Gibco 公司）、總 RNA 抽提試劑盒 （上海飛捷生物技術(shù)有限公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （大連寶生物工程有限公司）；兔抗大鼠TNF-α、IL-1β （南京建成生物工程研究所），模擬肽Ac2-26 （美國(guó)Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 心肌細(xì)胞制備：取6只大鼠置于超凈工作臺(tái)上，取其心室肌組織，4 ℃D-Hanks液洗凈，用細(xì)組織剪刀剪碎心室肌組織，0.1%胰蛋白酶消化為單細(xì)胞懸液，細(xì)胞差速貼壁1.5 h后，用含100 mL/L胎牛血清DMEM 培養(yǎng)液使未貼壁心肌細(xì)胞稀釋成5×10-5/L，應(yīng)用0.1 mmol/Brdu 抑制培養(yǎng)基中非心肌細(xì)胞增殖，然后將心肌細(xì)胞接種在 6 孔板中，每孔為2 mL，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育48 h，換成無(wú)血清培養(yǎng)液對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行處理。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)：根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Ac2-26濃度以0.1 mg/mL作為標(biāo)準(zhǔn)劑量干預(yù)。將分離的大鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng) 48 h后換液，在倒置顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)，待其細(xì)胞長(zhǎng)至 90%融合時(shí)，將細(xì)胞隨機(jī)分組：正常對(duì)照組［葡萄糖 （5.5 mmol/L） DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)］、正常干預(yù)組［葡萄糖 （5.5 mmol/L）DMEM 培養(yǎng)基、Ac2-26 （0.1 mg/mL） 進(jìn)行培養(yǎng)］、高糖模型組［葡萄糖 （30 mmol/L ） DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)） ］、高糖治療組［葡萄糖 （30 mmol/L） DMEM 培養(yǎng)基、Ac2-26 （0.1 mg/mL） 進(jìn)行培養(yǎng)］。各組細(xì)胞均繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。

1.2.3 TNF-α、IL-1β檢測(cè)：收集各組細(xì)胞上清液，按照試劑盒步驟采用ELISA法測(cè)定TNF-α、IL-1β水平。

1.2.4 實(shí)時(shí) PCR檢測(cè)膜聯(lián)蛋白A1及PLA2 mRNA表達(dá)：原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，各培養(yǎng)皿用PBS洗2遍，裂解細(xì)胞，提取總RNA及cDNA，按Trizol法提取總RNA，參照說(shuō)明書(shū)對(duì)膜聯(lián)蛋白A1及PLA2進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，膜聯(lián)蛋白A1正反引物序列分別為5'-TCGCAATGAAGGACGATAG-3'和5'-ATATCCTC TTACAGTC-3'，擴(kuò) 增 長(zhǎng) 度 分 別 為307 bp、318 bp，PLA2正反引物序列分別為5'-TCTGTCCAATGACGG AGTC-3'和5'-CTAGTCCAGATTTCTGCCCGTACG-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為296 bp、301 bp，使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠拍照系統(tǒng)自動(dòng)拍照，最后對(duì)圖像進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，正常干預(yù)組膜聯(lián)蛋白A1、PLA2 mRNA 表達(dá)，TNF-α、IL-1β水平下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＞ 0.05）。與正常對(duì)照組比較，高糖模型組膜聯(lián)蛋白A1及PLA2 mRNA 表達(dá)，TNF-α、IL-1β水平顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜0.01）。與高糖模型組比較，高糖治療組PLA2 mRNA表達(dá)，TNF-α、IL-1β水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.01）；而膜聯(lián)蛋白A1 mRNA 表達(dá)下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＞ 0.05）。見(jiàn)圖1，表1、2。

3 討論

圖1 各組膜聯(lián)蛋白A1及PLA2 mRNA表達(dá)Fig.1 Expression of Annexin A1 and PLA2 mRNA in each group

研究［11］顯示，糖尿病可以誘發(fā)心力衰竭發(fā)作或者促進(jìn)其發(fā)展，糖尿病心肌病是非缺血性心肌病的重要病因。既往研究［12］表明糖尿病病程進(jìn)展中伴隨著炎癥反應(yīng)，特別在形成并發(fā)癥時(shí)炎癥反應(yīng)始終參與其中，糖尿病心肌病病變過(guò)程中伴隨著炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。因此通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)可以改善糖尿病心肌?。?］。

膜聯(lián)蛋白A1是膜聯(lián)蛋白超家族中的一員，依賴(lài)鈣離子與細(xì)胞膜磷脂結(jié)合，又稱(chēng)為依鈣蛋白、磷脂酶A2抑制蛋白，大部分器官、組織均可以表達(dá)，在粒細(xì)胞/單核細(xì)胞中呈更高水平表達(dá)。膜聯(lián)蛋白A1是外周系統(tǒng)重要的抗炎物質(zhì)，改善機(jī)體炎癥反應(yīng)。既往對(duì)于膜聯(lián)蛋白A1研究多集中在感染、腫瘤等方面，近年有些研究［13-16］表明膜聯(lián)蛋白A1與心腦血管疾病 （動(dòng)脈粥樣硬化、心肌再灌注損傷、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、腦梗死、機(jī)體臟器纖維化等） 也有密切關(guān)系。模擬肽Ac2-26是膜聯(lián)蛋白A1裂解的小分子片段，同樣具有強(qiáng)大的抗炎活性，可以改善心肌梗死、抑制小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)［17-18］。 PLA2是炎癥復(fù)合物、炎癥介質(zhì)合成釋放的關(guān)鍵酶，在炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用；炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β主要由單核-巨噬細(xì)胞分泌，同樣在炎癥反應(yīng)發(fā)揮重要作用。本研究采用高糖負(fù)荷心肌細(xì)胞，模擬糖尿病對(duì)心肌病變的影響。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，正常干預(yù)組膜聯(lián)蛋白A1、 PLA2 mRNA表達(dá)，TNF-α、IL-1β水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （均P ＞ 0.05），說(shuō)明Ac2-26干預(yù)效果有限，同樣對(duì)膜聯(lián)蛋白A1影響不明顯；而在高糖模型組膜聯(lián)蛋白A1及PLA2 mRNA表 達(dá)，TNF-α、IL-1β水 平 都 明 顯 上 升 （均P ＜ 0.05），說(shuō)明糖尿病病程中存在明顯炎癥反應(yīng)，膜聯(lián)蛋白A1抗炎作用明顯增加。與高糖組比較，高糖治療組PLA2 mRNA表達(dá)，TNF-α、IL-1β水平明顯下降 （均P ＜0.05），提示Ac2-26改善了高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，但膜聯(lián)蛋白A1下降不明顯，進(jìn)一步證實(shí)了Ac2-26對(duì)膜聯(lián)蛋白A1影響有限，同時(shí)膜聯(lián)蛋白A1維持較高水平繼續(xù)發(fā)揮抗炎作用。既往研究［14］表明膜聯(lián)蛋白A1及Ac2-26在體內(nèi)、體外對(duì)缺血再灌注心肌損傷均具有改善作用，本研究證實(shí)膜聯(lián)蛋白A1與高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，Ac2-26能夠明顯減輕炎癥反應(yīng)。推測(cè)其機(jī)制可能是Ac2-26通過(guò)抑制PLA2表達(dá)使花生四烯酸、前列腺素、血小板活化因子等炎癥活性物質(zhì)分泌減少，減輕炎癥反應(yīng)，同時(shí)抑制PLA2表達(dá)后抑制了中性粒細(xì)胞表面整合素和脂多糖的表達(dá)，使TNF-α、IL-1β分泌減少；另外Ac2-26抑制單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等趨化、聚集功能，下調(diào)炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β表達(dá)來(lái)改善炎癥反應(yīng)。

表1 各組膜聯(lián)蛋白A1、PLA2 mRNA表達(dá)比較Tab.1 Comparison of Annexin A1 and PLA2 expression among the different groups

表2 各組TNF-α、IL-1β水平比較 （ng/L）Tab.2 Comparison of TNF-α and IL-1β level among the different groups （ng/L）

綜上所述，膜聯(lián)蛋白A1與高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)明顯相關(guān)，模擬肽Ac2-26改善了高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，推測(cè)在體內(nèi)同樣可以改善糖尿病大鼠心肌病變，本研究為模擬肽Ac2-26治療糖尿病心肌病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。