施加硒代蛋氨酸和亞硒酸鈉對(duì)韭菜總硒及硒形態(tài)的影響

張俊杰,郭志強(qiáng),王娟娟,魏學(xué)紅,2*

(1.山西大學(xué) 大型科學(xué)儀器中心,山西 太原 030006;2.山西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,山西 太原 030006)

0 引言

硒元素作為人體必需的痕量礦物質(zhì),對(duì)人類健康極其重要。是人體硒蛋白的重要結(jié)構(gòu)組成和酶活性發(fā)揮的部分,具有催化活性甲狀腺激素產(chǎn)生、抗氧化、抗癌及抗HIV病毒等免疫功效[1-3]。硒需要從外界膳食獲取,常規(guī)成人攝入量為40～300 μg/d,用以滿足人體酶代謝或者預(yù)防癌癥發(fā)生[4]。植物是主要的硒源之一[5-6],利用微生物可以提高植物營(yíng)養(yǎng)與質(zhì)量[7],通過(guò)植物育種、基因工程,或者施加硒肥,也可以提高植物硒的富集量[8]。國(guó)內(nèi)市面上出現(xiàn)了各種富硒農(nóng)產(chǎn)品及含硒保健品,以達(dá)到硒的補(bǔ)充攝入。由于硒元素為低含量營(yíng)養(yǎng),高含量有毒的元素,因此對(duì)硒含量的監(jiān)測(cè)控制也顯得尤為重要。

硒元素測(cè)定方法眾多,主要包括分子熒光法、氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法、原子吸收光譜法、電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜法、電化學(xué)分析法和電感耦合等離子體質(zhì)譜法(Inductive coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)等。其中,ICP-MS技術(shù)具有靈敏度高[9],樣品前處理方便快捷等優(yōu)點(diǎn),在準(zhǔn)確測(cè)量生物、食品、環(huán)境、地質(zhì)等樣品中的硒元素含量[10-12]、同位素組成及其各種形態(tài)方面表現(xiàn)出色,且有著廣泛的應(yīng)用前景[13]。環(huán)境保護(hù)部規(guī)定土壤和沉積物中硒的測(cè)定采用微波消解-原子熒光法[14]。新頒布的食品中的硒測(cè)定的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),在保留了氫化物原子熒光光譜法和熒光分光光度法的基礎(chǔ)上,增加了ICP-MS法[15]。

韭菜本身營(yíng)養(yǎng)豐富,是一種富硒能力較強(qiáng)的蔬菜[16],低濃度硒的添加能明顯改善韭菜的品質(zhì)[17],是較為理想的富硒植物。已有研究人員對(duì)韭菜施加蚯蚓轉(zhuǎn)化的有機(jī)硒肥[18],或者硒礦粉、亞硒酸鈉[19]和硒酸鈉無(wú)機(jī)硒肥以達(dá)到富硒目的[20]的報(bào)道。本文以有機(jī)形態(tài)的硒代蛋氨酸及無(wú)機(jī)形態(tài)的亞硒酸鈉,對(duì)韭菜進(jìn)行富硒化的培養(yǎng),對(duì)硒元素的富集效果進(jìn)行研究,以期達(dá)到富硒韭菜中硒富集的評(píng)價(jià)及探索硒在韭菜中的存在形態(tài),并預(yù)估硒的富集途徑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

NexION 350X電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(PerkinElmer,美國(guó))、恒溫加熱消解儀(上海博通化學(xué)科技有限公司,中國(guó))、Multiwave PRO微波消解儀(Anton Paar,意大利)、Ex2250ZH電子天平(奧豪斯儀器,中國(guó)常州)、DHG-9070干燥箱(一恒科學(xué)儀器有限公司,中國(guó)上海)、Flexar高效液相色譜儀(High performance liquid chromatography,HPLC)(PerkinElmer,美國(guó))、Hamilton PRP-X100陰離子交換柱(4 mm×250 mm,10 μm)(漢密爾頓,美國(guó))、雷磁pH計(jì)和KQ-250DB超聲儀(舒美,中國(guó)昆山)。

1.2 試劑和標(biāo)準(zhǔn)品

濃硝酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)65%-68%,優(yōu)級(jí)純)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,中國(guó)上海)、1 000 μg/mL硒元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(國(guó)家有色金屬及材料研究中心,中國(guó))、超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm)(采用EASY15 Heal Force超純水系統(tǒng)(力康發(fā)展有限公司,香港)制備)、甲醇、磷酸氫二銨、甲酸、硒酸鹽(Selenate,Se(Ⅵ)標(biāo)準(zhǔn)溶液,亞硒酸鹽(Selenite,Se(Ⅳ)標(biāo)準(zhǔn)溶液,硒代胱氨酸(selenocystine,Se-Cys)標(biāo)準(zhǔn)溶液和硒代蛋氨酸(selenomethionine,Se-Met)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品處理

1.3.1 富硒韭菜樣品信息

田間試驗(yàn)在山東省淄博市博山區(qū)上瓦泉村有機(jī)富硒蔬菜園區(qū)進(jìn)行,該園區(qū)土壤及溫濕度情況如文獻(xiàn)中所述[13]。于2015年1月13日第一次施硒肥,2015年1月22日第二次施硒肥,2015年1月29日收割。樣品分組、施肥種類及施加濃度如表1所示。

1.3.2 韭菜中總硒的提取

新鮮的韭菜樣品,液氮冷凍干燥,用研缽研碎。稱取約2.5 g(精確至 0.000 1 g)至聚四氟乙烯消解管中,加入6 mL濃硝酸,按照表2中設(shè)定的程序進(jìn)行消解。完成后,待消解液冷卻至低于60℃,將消解液轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶中,用少量水洗滌消解罐3次,洗液合并于容量瓶中,用水稀釋至刻度,混勻。樣品空白除樣品加入步驟,其余操作均與樣品相同。以體積分?jǐn)?shù)2% HNO3作為溶劑空白。稀釋10倍進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 土壤中總硒的提取

從韭菜種植田地中隨機(jī)設(shè)置8個(gè)取樣點(diǎn),采集土壤樣品。將土壤置于陰涼干燥處自然風(fēng)干后用研缽研磨,棄碎石及渣子,過(guò)100目篩。稱取約0.5g(精確至 0.0001 g)土壤樣品至聚四氟乙烯燒杯中,加入6 mL濃硝酸和2 mL氫氟酸,電熱板加熱預(yù)消解后,再按照表2中的程序進(jìn)行微波消解。完成后趕酸至1～2 mL,將消解液轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶中,用少量水洗滌消解罐3次,洗液合并于容量瓶中,用水稀釋至刻度,混勻。樣品空白除樣品加入步驟,其余操作均與樣品相同。以2% HNO3作為溶劑空白。

1.3.4 韭菜樣品硒形態(tài)的提取

將韭菜樣品液氮凍干,研缽粉碎,稱取2.0 g(精確至 0.000 1 g),加入1∶1(V∶V)的甲醇/水溶液8 mL,超聲30 min,對(duì)韭菜中的硒代謝物進(jìn)行提取,完成后離心,過(guò)濾。

表1 韭菜的富硒化培養(yǎng)

1.4 測(cè)定條件

ICP-MS參數(shù)為功率1 600 W,等離子體氣體流速18 L/min,輔助氣流速1.2 L/min,載氣流速0.97 L/min,霧化器為Meinhard型,樣品錐和截取錐為鎳錐,霧室和中心管為石英材質(zhì),駐留時(shí)間為50 ms,總硒和形態(tài)測(cè)定,分別選擇同位素82Se和78Se。儀器調(diào)諧時(shí)應(yīng)達(dá)到的技術(shù)指標(biāo),包括靈敏度指標(biāo)9Be:>2000cps,115In:>40000cps,238U:>30000cps;背景值:Bkgd 220≤1 cps,氧化物比例(156CeO+/140Ce+):≤2.5%,雙電荷離子比例(70Ce2+/140Ce+):≤3.0%,質(zhì)量數(shù)和分辨率指標(biāo)以元素Li、Mg、In和U元素10%峰高處峰寬為準(zhǔn),在0.65～0.80 amu范圍。其他參數(shù)如矩管位置、載氣流量、四級(jí)桿偏轉(zhuǎn)電壓、檢測(cè)器電壓和雙檢測(cè)器電壓,均使用相應(yīng)的調(diào)諧液進(jìn)行校準(zhǔn),直至符合要求。所有測(cè)試均在標(biāo)準(zhǔn)模式(standard,STD)下進(jìn)行,且刪除硒元素校準(zhǔn)方程。

表2 微波消解步驟

硒形態(tài)測(cè)定采用60 mmol的磷酸氫二銨為流動(dòng)相,用甲酸調(diào)節(jié)pH至6.0,液相色譜流速1 mL/min,進(jìn)樣量50 μL。

1.5 數(shù)據(jù)處理

1.5.1 總硒含量的測(cè)定

以標(biāo)準(zhǔn)溶液待測(cè)元素分析峰響應(yīng)值為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程。利用供試品中待測(cè)元素的峰響應(yīng)值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算得出相應(yīng)的濃度,計(jì)算樣品中硒元素的含量。每個(gè)樣品測(cè)定時(shí)均取3次讀數(shù)的均值。

1.5.2 有機(jī)硒含量測(cè)定

根據(jù)各個(gè)硒代謝物的色譜峰面積,對(duì)應(yīng)其系列濃度,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,利用樣品中硒代謝物色譜峰面積值,從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算得出相應(yīng)的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 富硒韭菜中總硒的測(cè)定

精密量取硒標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL)10 μL,用2%硝酸溶液,定容至10 mL,成為硒濃度為1 μg/mL的單獨(dú)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。分別取硒標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液(1 μg/mL)5、10、50、100和500 μL,先后加入10 mL容量瓶中,用2 %硝酸溶液定容,得到含硒標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1、5、10和50 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。線性曲線y=195x+42.2,線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999 9以上,可用于富硒韭菜中總硒的測(cè)定。

韭菜葉子經(jīng)烘干殺青,微波消解后進(jìn)行ICP-MS分析,以鍺元素為內(nèi)標(biāo),在STD模式下,進(jìn)行方法驗(yàn)證。以11次空白測(cè)定值的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算檢出限。平行制備6份樣品,分別測(cè)定后,計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,得出重復(fù)性。同一樣品連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,得出精密度。回收率實(shí)驗(yàn)設(shè)置低、中、高3個(gè)不同濃度,每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)重復(fù)(n=6)進(jìn)行。表征結(jié)果見(jiàn)表3。該方法的檢出限可達(dá)到0.03 ng/mL;測(cè)定重復(fù)性和精密度分別為4.17%和1.52%;低、中和高濃度的加標(biāo)回收率在80.6%-102.9%之間,該方法可達(dá)到硒元素含量的穩(wěn)定、準(zhǔn)確和高靈敏測(cè)定。

表3 ICP-MS測(cè)定總硒方法驗(yàn)證

2.2 種植地土壤中總硒的測(cè)定

由于土壤基質(zhì)復(fù)雜,為獲得準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果,使用土壤試驗(yàn)樣本,以標(biāo)準(zhǔn)模式的標(biāo)準(zhǔn)加入法得出的測(cè)定結(jié)果為參考值,比較了不同模式下,對(duì)土壤硒測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明,在標(biāo)準(zhǔn)模式下,采用82Se作為測(cè)定同位素,不用校準(zhǔn)方程,結(jié)果最準(zhǔn)確;另外,碰撞模式采用78Se,反應(yīng)模式采用80Se,也可得出相對(duì)正確的結(jié)果,而其他同位素的測(cè)定結(jié)果距離準(zhǔn)確值相差很大,不可取。而采用儀器默認(rèn)方法,即標(biāo)準(zhǔn)模式下,測(cè)定82Se,使用校準(zhǔn)方程,以消除氪元素對(duì)82Se的干擾,得出的結(jié)果有誤,因此,實(shí)際測(cè)試樣品時(shí),需要根據(jù)樣品基質(zhì)的實(shí)際情況,合理地使用校準(zhǔn)方程。本試驗(yàn)土壤中硒濃度全部采用標(biāo)準(zhǔn)模式不加校準(zhǔn)方程測(cè)定82Se得出。取硒標(biāo)準(zhǔn)溶液10.0 ng/mL,系列稀釋成含硒標(biāo)準(zhǔn)溶液0.156、0.625、2.50、5.00、10.0 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用2%硝酸溶液定容。線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999 8,得出土壤樣品總硒含量為0.36±0.080 μg/g,此種植地土壤中硒含量較高,主要是施加硒肥導(dǎo)致的結(jié)果,利于韭菜植株通過(guò)土壤吸收硒元素。

2.3 韭菜中硒形態(tài)的測(cè)定

收集的硒形態(tài)四種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),包括硒酸鈉、亞硒酸鈉、硒代半胱氨酸及硒代蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)過(guò)陰離子交換柱分離,HPLC-ICP-MS分析,15 min之內(nèi)可在色譜上達(dá)到良好的分離。這四種硒形態(tài)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列稀釋成5、10、50、100和1 000 ng/mL的濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,線性相關(guān)系數(shù)均在0.997 3以上(表4)。四種硒系形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)品及韭菜中相應(yīng)形態(tài)的HPLC-ICP-MS色譜圖如圖1所示。對(duì)韭菜硒形態(tài)進(jìn)行提取分析,得出韭菜中主要含有亞硒酸鹽形態(tài),不存在其他三種硒形態(tài) (圖1)。

表4 四種硒形態(tài)的線性結(jié)果

(a) Standards of selenium metabolites with 100 ng/mL concentration(1,Se-Cys,2,Se(Ⅳ), 3,Se-Met,4,Se(Ⅵ));(b) extract of Chinese chivesFig.1 Chromatography of selenium species using HPLC-ICP-MS(a)100 ng/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液;(b)韭菜樣品提取液圖1 硒形態(tài)的HPLC-ICP-MS色譜圖

2.4 韭菜硒富集效果評(píng)價(jià)

為得到韭菜中的硒富集效果及其硒存在形態(tài),對(duì)韭菜總硒及小分子硒形態(tài)、韭菜種植地土壤中的總硒分別進(jìn)行了測(cè)定,以得出硒富集的效果及途徑。富硒韭菜總硒及小分子硒形態(tài)的測(cè)定結(jié)果如表5所示。

施加硒肥后,韭菜硒含量與對(duì)照組相比明顯升高,且升高程度與硒肥種類、施肥時(shí)間與施肥次數(shù)均有關(guān)系。兩種硒肥,若收割前兩周只施一次,不論濃度大小,硒含量無(wú)明顯的差別(A1、B1、C1、D1)。只施一次肥的情況下,收割前一周施肥,比收割前兩周施肥,硒元素濃度要高(B1vs B2、D1vs D2)。對(duì)于Se-Met,施加20 μg/g的濃度,施一次跟施兩次之間差別不大,濃度升高至40 μg/g和60 μg/g,施兩次肥硒比施一次硒含量有明顯的升高(A、B、C組分別比較);對(duì)于Na2SeO3,硒含量跟施肥時(shí)間,施肥次數(shù)均有關(guān),收割前一周施比前兩周施,硒含量高,施兩次肥比施一次硒含量高(D組比較)。同等劑量60 μg/g的Se-Met和Na2SeO3,施一次硒含量無(wú)差別,施兩次, 施Na2SeO3比Se-Met硒含量高(C1vs.D1,C2vs.D3)。

隨著韭菜中總硒濃度的升高,亞硒酸鹽的濃度值一直保持穩(wěn)定,亞硒酸鹽在總硒中所占比例有下降趨勢(shì)(表5),推測(cè)施加硒肥的實(shí)驗(yàn)組,硒以其他的形態(tài)進(jìn)行了富集,如流向硒蛋白及硒多糖的合成方向。

3 結(jié)論

使用微波消解-ICP-MS,對(duì)韭菜和土壤樣品總硒濃度的測(cè)定模式及方法進(jìn)行驗(yàn)證,得到了韭菜及土壤中總硒測(cè)定的可靠方法,對(duì)樣品中的總硒進(jìn)行了準(zhǔn)確測(cè)定,進(jìn)一步使用HPLC-ICP-MS,對(duì)韭菜中的硒形態(tài)進(jìn)行了分析,達(dá)到了富硒化培育韭菜的硒富集效果的評(píng)價(jià)。施加不同濃度的有機(jī)或者無(wú)機(jī)硒肥,均能達(dá)到韭菜一定程度的硒富集效果。富集效果跟施肥的種類、施肥時(shí)間、施肥次數(shù)及施肥濃度均有關(guān)。無(wú)機(jī)形態(tài)亞硒酸鈉的富集效果優(yōu)于有機(jī)形態(tài)的硒代蛋氨酸,收割前一周施肥優(yōu)于收割前兩周,施肥兩次優(yōu)于施肥一次,高濃度施肥優(yōu)于低濃度。富硒組的亞硒酸鹽含量基本未變,且亞硒酸鈉占總硒比例逐漸減小,推測(cè)硒富集可能流向其他硒形態(tài),如硒多糖或者硒蛋白化合物的合成方向。在缺硒性質(zhì)的韭菜種植地土壤中檢測(cè)到了硒元素,猜測(cè)所施硒肥已有部分進(jìn)入到土壤中,韭菜植株可從土壤間接吸收硒元素,完成硒富集。

表5 韭菜總硒及小分子硒形態(tài)分布