UPF2介導(dǎo)八肋游仆蟲NMD途徑SURF和EJC的耦聯(lián)

柴楊麗,呂佳,周寶春,梁愛華,柴寶峰

(山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所 化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點實驗室,山西 太原 030006)

0 引言

基因的準(zhǔn)確表達(dá)對于機體細(xì)胞正常的生理活動至關(guān)重要,它受到細(xì)胞中多種不同分子機制的調(diào)控[1-2]。其中無義介導(dǎo)的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)途徑能夠識別并降解異常的mRNA,如含有提前終止密碼子(premature termination codons, PTCs)的無義mRNA(nonsense mRNA),避免這種異常mRNA翻譯成潛在截短有毒蛋白質(zhì),對機體產(chǎn)生毒害效應(yīng)[1,3-4]。

NMD途徑廣泛存在于真核生物。原生動物是一組最早分支的單細(xì)胞真核生物,研究這類生物的NMD途徑,可以幫助我們理解NMD的起源和進(jìn)化機制[5]。這種特殊的單細(xì)胞真核生物可以利用簡單的細(xì)胞元件來完成一些較為復(fù)雜的代謝和調(diào)控過程[6],如在藍(lán)氏賈第蟲(Giardialamblia)細(xì)胞的NMD途徑中,只有UPF1一種核心蛋白質(zhì)參與無義介導(dǎo)的mRNA降解激活途徑[6-7]。幾乎在所有的真核生物中,都存在3種UPF蛋白,即UPF1,UPF2和UPF3,但在原生動物中卻有一些例外,一般會缺少UPF2或UPF3[6-10]。八肋游仆蟲(Euplotesoctocarinatus)是一種單細(xì)胞真核生物,在進(jìn)化上處于特殊地位。基因組分析結(jié)果顯示該生物僅有UPF1和UPF2,而缺失UPF3[11]。

在NMD途徑中,UPF(UPF1、UPF2、UPF3)因子在無義mRNA識別和降解過程中都發(fā)揮著重要的作用[1,9,12-14]。UPF1最早在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn),是NMD途徑中最核心的因子,它的N端有一個富含半胱氨酸和組氨酸的CH(Cys-His)結(jié)構(gòu)域,C端部分具有ATP依賴的RNA解旋酶活性[12-16]。UPF2存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中[17-18],含有三個保守的MIF4G(middle domain of translation initiation factor 4G)結(jié)構(gòu)域,通過第三個MIF4G結(jié)構(gòu)與UPF3的RRM(RNA recognition motif)相互作用,并通過它的C末端與UPF1的CH結(jié)構(gòu)域結(jié)合[9,19-21]。UPF3在細(xì)胞核mRNA的加工過程中,與外顯子連接復(fù)合體(exon-exon junction complex, EJC) 中的Y14相互作用。NMD途徑中的SMG1-UPF1-肽鏈釋放因子(SURF)復(fù)合體和EJC復(fù)合體通過UPF2和UPF3耦聯(lián),啟動NMD途徑,識別無義mRNA[1,3,12,18]。但在八肋游仆蟲中,并沒有鑒定到UPF3蛋白質(zhì)。在研究人類NMD途徑中UPF2 的功能和結(jié)構(gòu)時,發(fā)現(xiàn)它的第二個MIF4G結(jié)構(gòu)在位置上與EJC的核心因子Y14很接近[9,22]。在八肋游仆蟲中,UPF2包含三個串聯(lián)的MIF4G結(jié)構(gòu)和一個C末端UPF1的結(jié)合區(qū)域。那么,在不存在UPF3的情況下,UPF2是否可以直接將SURF復(fù)合體和EJC復(fù)合體聯(lián)系起來呢?

為此,本研究從八肋游仆蟲細(xì)胞中克隆了UPF1、UPF2和EJC核心因子基因的關(guān)鍵功能域,并對它們的關(guān)系進(jìn)行了分析,以證實UPF2因子在八肋游仆蟲細(xì)胞NMD途徑啟動過程中所發(fā)揮的作用，為進(jìn)一步闡明NMD途徑的進(jìn)化和分子機制提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料,菌株和質(zhì)粒

所用實驗材料為八肋游仆蟲;菌株有E.coliDH5α,E.coliBL21和酵母菌株AH109;質(zhì)粒有大腸桿菌蛋白表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-1和pET-28a,酵母雙雜交載體pGADT7和pGBKT7,均為實驗室所保存。

1.2 主要試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒(EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)和膠回收試劑盒(EasyPure Quick Gel Extraction Kit),Anti-GST和Anti-His抗體均購于北京全式金生物技術(shù)有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒(Plasmid Mini Kit I)購于OMEGA公司;各種酶制劑(BamH I,EcoR I,XhoI,SalI 等)均購于TaKaRa公司;寡聚核苷酸引物由華大基因合成。

1.3 序列檢索和分析

在NCBI Homologene數(shù)據(jù)庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene)中鑒定到UPF2因子同系物,使用MEGA7(MEGA 7.0.14)軟件對EoUPF2及其他UPF2的24個同系物構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹;用DNASTAR.Lasergene.v7.1軟件比對核酸和蛋白序列,設(shè)計基因擴(kuò)增引物。

1.4 八肋游仆蟲cDNA的獲得

采用離心法大量富集八肋游仆蟲,TRIZOL試劑快速提取法提取其總RNA并檢測濃度和純度;利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將得到的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以八肋游仆蟲cDNA為模板,利用表1的特異性引物,擴(kuò)增目的基因片段。對目的基因片段與對應(yīng)載體pGADT7和pGBKT7進(jìn)行酶切,T4 DNA連接酶16℃過夜連接,得到酵母雙雜交的重組質(zhì)粒pGADT7-EoUPF2-MIF4G-2、pGADT7-EoUPF2-MIF4G-3、pGBKT7-EoY14a-RRM和pGBKT7-EoY14b-RRM。 基于pET-28a和pGEX-6p-1構(gòu)建Pull-down實驗的重組質(zhì)粒pET-28a-EoUPF2-MIF4G-2、pET-28a-EoUPF2-MIF4G-3、pGEX-6p-1-EoY14a-RRM和pGEX-6p-1-EoY14b-RRM。各重組質(zhì)粒測序正確后用于下一步實驗。

表1 本文用到的寡核苷酸引物

1.6 酵母雙雜交

YPD固體培養(yǎng)基平板上活化AH109菌株,用YPD液體培養(yǎng)基獲得大量活性較好的AH109,進(jìn)行酵母共轉(zhuǎn)化實驗。以重組質(zhì)粒pGADT7-eRF1/pGBKT7-eRF3共轉(zhuǎn)化結(jié)果作為陽性對照,pGADT7/pGBKT7作為陰性對照,其他對照組以及實驗組pGADT7-EoUPF2-MIF4G-2/pGBKT7-EoY14a-RRM、pGADT7-EoUPF2-MIF4G-2/pGBKT7-EoY14b-RRM、pGADT7-EoUPF2-MIF4G-3/pGBKT7-EoY14a-RRM、pGAD

T7-EoUPF2-MIF4G-3/pGBKT7-EoY14b-RRM。SD-Leu-Trp和SD-Leu-Trp-His-Ade固體培養(yǎng)基進(jìn)行初篩和嚴(yán)謹(jǐn)篩選之后,進(jìn)行顯色反應(yīng)。

1.7 體外Pull-down和Western blot分析

將重組質(zhì)粒pET-28a-EoUPF2-MIF4G-2、pET-28a-EoUPF2-MIF4G-3、pGEX-6p-1-EoY14a-RRM和pGEX-6p-1-EoY14b-RRM (pET-28a/pGEX-6p-1分別帶有His/GST標(biāo)簽) 分別轉(zhuǎn)到大腸桿菌表達(dá)菌株BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),確保目的蛋白大部分在上清中。將帶有His標(biāo)簽的pET-28a-EoUPF2-MIF4G-2大量表達(dá),純化后結(jié)合到鎳柱中,再將大量表達(dá)的pGEX-6p-1-EoY14a-RRM上清灌到結(jié)合了pET-28a-EoUPF2-MIF4G-2的鎳柱中進(jìn)行孵育,用洗滌液(His-binding buffer)洗滌后,用洗脫液(His-elution buffer)洗脫目的蛋白質(zhì)。將500 mmol/L的鎳柱洗脫溶液,使用濃縮柱4 000 rpm,離心20 min濃縮。制備樣品,12%SDS-PAGE分離樣品,Western blot進(jìn)行分析。其他三對pET-28a-EoUPF2-MIF4G-2與pGEX-6p-1-EoY14b-RRM、pET-28a-EoUPF2-MIF4G-3與pGEX-6p-1-EoY14a-RRM、pET-28a-EoUPF2-MIF4G-3與pGEX-6p-1-EoY14b-RRM同理。

1.8 定量PCR分析Y14a和Y14b拷貝數(shù)

2 實驗結(jié)果

2.1 UPF2結(jié)構(gòu)的初步分析

UPF2作為關(guān)鍵的NMD因子,進(jìn)化上非常保守。為了研究EoUPF2的進(jìn)化關(guān)系,基于24個物種的UPF2氨基酸序列比對,運用最大似然法(ML)和鄰接法(NJ)構(gòu)建了UPF2的系統(tǒng)進(jìn)化樹,所得結(jié)果基本相似(圖1)。從圖1可以看出,這24個的UPF2的系統(tǒng)進(jìn)化樹有較多分支,而原生動物四膜蟲(Tetrahymena),小瓜蟲(Ichthyophthiriusmultifiliis),尖毛蟲(Oxytrichatrifallax),八肋游仆蟲處在一大分支上,進(jìn)化地位較低。另外,與之最接近的一個分支是釀酒酵母(S.cerevisiae)和裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)。

A:ML trees; B:NJ treesFig.1 Phylogenetic trees based on UPF2 protein sequencesA:ML樹;B:NJ樹圖1 基于UPF2蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

在圖1的系統(tǒng)進(jìn)化樹中,釀酒酵母NMD途徑的研究較為深入。這里使用InterPro database分析了釀酒酵母與八肋游仆蟲NMD核心蛋白UPF1和UPF2的保守結(jié)構(gòu)域(圖2)。從圖2可以看出,二者的UPF蛋白結(jié)構(gòu)非常相似。其中UPF1都包含1個N端與UPF2相互作用結(jié)構(gòu)域,這部分包含3個鋅離子結(jié)合模體(motifs);而C端部分都含有核苷三磷酸水解酶的P-loop結(jié)構(gòu),主要發(fā)揮DNA解旋酶和ATP酶的作用。UPF2包含串聯(lián)的MIF4G結(jié)構(gòu)域,它們分別起到與RNA和蛋白結(jié)合的作用。值得注意的是,EoUPF2的結(jié)構(gòu)分析中,沒有與ScUPF2相似的C末端結(jié)構(gòu)域,但是在實驗中截短的C末端部分與EoUPF1確實有相互作用(圖3),所以認(rèn)為EoUPF2存在C末端結(jié)構(gòu)域。

The structure of UPF1 and UPF2 in S.cerevisiae and E.octocarinatus. The CH domain in N-terminal of UPF1 is indicated in grey, and the ATPase domain and helicase activity domain in C-terminal are indicated in black. The MIF4G of UPF2 is shown in black, and the interaction part between C-terminal and the CH domain of UPF1 is indicated in light grey.Fig.2 Structure of UPF2 protein in S.cerevisiae and E.octocarinatusInterPro database分析的釀酒酵母和八肋游仆蟲的UPF1和UPF2的結(jié)構(gòu)。 UPF1中N端的灰色部分代表的是CH結(jié)構(gòu)域,黑色為C端的ATPase和解旋酶活性結(jié)構(gòu)域; UPF2中的灰色部分代表MIF4G結(jié)構(gòu),淺灰色部分是C端與UPF1的CH結(jié)構(gòu)域相互作用部分圖2 釀酒酵母與八肋游仆蟲UPF蛋白的結(jié)構(gòu)

2.2 UPF2直接介導(dǎo)SURF與EJC復(fù)合體的耦聯(lián)

A:Interaction between CH domain of EoUPF1 and EoUPF2 C-terminal;B:Yeast two hybrids experiment analysis of interactions between EoUPF1-CH and EoUPF2-Ct, including positive and negative controls. The blue colour means the interaction between two factors. “+” represents co-transformation of two genes; C:the Pull down products were analyzed by Western blot, showing that the fusion protein His-EoUPF1-CH was pulled down by the GST-EoUPF2-Ct.Fig.3 Interaction between UPF2 and UPF1A:EoUPF1的CH結(jié)構(gòu)域與EoUPF2的C末端具有相互作用;B:酵母雙雜交實驗分析EoUPF1-CH和EoUPF2-Ct的相互作用(包括陽性對照和陰性對照), 陽性對照中的藍(lán)色代表兩種因子之間相互作用, “+”代表共轉(zhuǎn)化;C:Western blot分析Pull down產(chǎn)物,顯示了His-EoUPF1-CH與GST-EoUPF2-Ct共純化。圖3 UPF2與UPF1相互作用

A:The pull down products were analyzed by Western blot,showing that the fusion protein GST-Yeast EoY14a/b-RRM were pulled down by both His-EoUPF2-MIF4G-2 and His-EoUPF2-MIF4G-3;B:yeast two-hybrids experiment analysis of interactions between pGADT7-EoUPF2-MIF4G-2 and pGBKT7-EoY14a/b-RRM,interactions between pGADT7-EoUPF2-MIF4G-3 and pGBKT7-EoY14a/b-RRM. “+” represents cotransformation of two genes;C:The model showed that the MIF4G domain of EoUPF2 mediates the connection between EoUPF1 and EoY14a/b.Fig.4 Interaction between UPF2 and Y14a or Y14bA:Western blot分析pull down產(chǎn)物,顯示了His EoUPF2-MIF4G-2與GST EoY14a/b-RRM, His EoUPF2-MIF4G-3與GST EoY14a/b-RRM共純化;B:酵母雙雜交分析了pGADT7-EoUPF2-MIF4G-2與pGBKT7-EoY14a/b-RRM,pGADT7-EoUPF2-MIF4G-3與 pGBKT7-EoY14a/b-RRM共轉(zhuǎn)化后的相互作用;C:模型顯示EoUPF2通過其MIF4G結(jié)構(gòu)域?qū)oUPF1與EoY14a/b連接圖4 UPF2與Y14a或Y14b相互作用

UPF1與UPF2相互作用(圖3A),再通過UPF3與EJC復(fù)合體聯(lián)系,而八肋游仆蟲細(xì)胞中沒有UPF3,那么是否UPF2直接與EJC復(fù)合體連接,從而啟動NMD途徑的發(fā)生呢?首先,通過酵母雙雜交實驗(圖3B)和Pull-down實驗(圖3C),證實了EoUPF2通過其C末端部分與上游EoUPF1的CH結(jié)構(gòu)域相互作用,EoUPF1是SURF復(fù)合體的核心組分,說明UPF2通過EoUPF1與八肋游仆蟲NMD的SURF復(fù)合體相互作用。其次,Pull-down實驗(圖4A)和酵母雙雜交實驗(圖4B)證實UPF2通過它的兩個MIF4G結(jié)構(gòu)可以與EJC復(fù)合體的主要組分Y14a和Y14b的RRM結(jié)構(gòu)域相互作用(圖4C)。以上結(jié)果表明,UPF2通過EoUPF1與Y14將SURF復(fù)合體與EJC復(fù)合體耦聯(lián),啟動八肋游仆蟲NMD途徑,進(jìn)而識別無義mRNA,再利用EoUPF1招募mRNA降解相關(guān)的蛋白因子。

2.3 八肋游仆蟲EJC核心因子Y14a和Y14b的表達(dá)水平

在八肋游仆蟲細(xì)胞中鑒定到兩個Y14a和Y14b因子,而且證實兩者均與EoUPF2相互作用,但二者到底有何不同尚不明確。首先利用β-半乳糖苷酶實驗分析了二者與EoUPF2的相互作用強度,結(jié)果顯示UPF2與Y14a的作用更強一些(圖5A)。進(jìn)一步利用定量PCR方法分析了Y14a和Y14b在八肋游仆蟲細(xì)胞中的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)Y14b的拷貝數(shù)幾乎是Y14a的兩倍。這些結(jié)果表明,EoUPF2與Y14a和Y14b的相互作用強度與Y14a和Y14b本身的拷貝數(shù)無關(guān)。

A:β-galactosidase activity determination of interacting intensity between pGADT7-EoUPF2-MIF4G-2 and pGBKT7-EoY14a/b-RRM, pGADT7-EoUPF2-MIF4G-3 and pGBKT7-EoY14a/b-RRM;B:qPCR analyzed the difference of copy number Y14a and Y14b in the macronuclear genome in E. octocarinatus.Fig.5 Intensity of interaction between UPF2 and Y14a or Y14b and their copy number in macronucleusA:β-半乳糖苷酶活性實驗分析pGADT7-EoUPF2-MIF4G-2與pGBKT7-EoY14a/b-RRM, pGADT7-EoUPF2-MIF4G-3與pGBKT7-EoY14a/b-RRM的相互作用強度;B:通過qPCR分析了Y14a與Y14b在八肋游仆蟲大核基因組中的拷貝數(shù)差異圖5 Y14a與Y14b與UPF2的作用強度及其在大核中的拷貝數(shù)

3 討論

人和酵母NMD途徑的啟動和無義mRNA的降解機制的研究取得了一些進(jìn)展,但關(guān)于NMD途徑的進(jìn)化機制及其一些具體的細(xì)節(jié)仍存在很多問題[9,19-20]。八肋游仆蟲是進(jìn)化程度比較低的單細(xì)胞真核生物,之前的許多研究表明,參與這些生物的細(xì)胞代謝過程的元件在種類和結(jié)構(gòu)上相對較為簡單[6,7,11]。UPF蛋白作為NMD途徑的核心因子,參與NMD途徑的啟動、無義mRNA的識別和降解過程[1,3,12,18]?；蚪M分析結(jié)果顯示,在八肋游仆蟲細(xì)胞中僅有UPF1和UPF2兩種UPF蛋白因子,沒有UPF3。之前的研究發(fā)現(xiàn)在藍(lán)氏賈第蟲中也只有UPF1一種UPF蛋白[7],說明UPF蛋白因子與生物的進(jìn)化水平有一定的聯(lián)系(圖1)。盡管在這些真核生物中UPF蛋白因子各不相同,但都具有能完成NMD途徑的功能。因此,這些生物的NMD途徑必然有其自身的特點。就八肋游仆蟲UPF蛋白因子的結(jié)構(gòu)而言,EoUPF1與EoUPF2與酵母相應(yīng)的UPF因子的結(jié)構(gòu)基本一致(圖2),說明這些因子具備完成原生生物NMD途徑的基本結(jié)構(gòu)和功能。但是如何彌補元件(如UPF3)的缺失呢?在高等生物細(xì)胞NMD途徑中,通過UPF2和UPF3介導(dǎo)SURF復(fù)合體和EJC復(fù)合體耦聯(lián),啟動NMD途徑[1,3,12],即EJC模型。本研究證實UPF2通過SURF結(jié)構(gòu)中的UPF1和EJC結(jié)構(gòu)中的Y14相互作用,介導(dǎo)了兩個復(fù)合體的耦聯(lián),進(jìn)而啟動了NMD途徑(圖6)。

Fig.6 NMD pathway of the cell of the E.octocarinatus圖6 八肋游仆蟲細(xì)胞的NMD途徑

Y14a和Y14b表達(dá)量不同,在基因表達(dá)過程中的作用可能不同:對于有內(nèi)含子的基因,Y14作為剪接因子參與mRNA的加工過程,最終成為EJC復(fù)合體因子[23],與UPF2相互作用,介導(dǎo)NMD途徑的啟動和無義mRNA的識別和降解。對于沒有內(nèi)含子的基因,作為RNA結(jié)合蛋白,調(diào)控RNA的表達(dá)和穩(wěn)定性。有研究表明,Y14可以與UPF1相互作用,引導(dǎo)無義mRNA被NMD途徑識別[11]。

已有研究表明,第一類肽鏈釋放因子eRF1可以結(jié)合在40S亞基A位點并識別所有3個終止密碼子,與eRF3的C末端結(jié)合[24-25];而第二類肽鏈釋放因子eRF3是1個核糖體依賴的GTPase,幫助eRF1釋放完整的多肽,作為1個輔助因子發(fā)揮作用[12,24]。人與酵母形式的UPF1與eRF1和eRF3均有相互作用,只是eRF1主要靠離子鍵與UPF1結(jié)合[12,24]。在人類NMD研究中還發(fā)現(xiàn)了磷酸化激酶SMG1,可以被UPF1招募,與eRF1和eRF3一起形成SURF復(fù)合物[1,3,26]。幾乎在所有NMD的研究中,UPF1都會被磷酸化來發(fā)揮作用,但是在八肋游仆蟲的序列比對中,我們并沒有發(fā)現(xiàn)SMG1,但是我們?nèi)匀徽J(rèn)為EoUPF1會被某一種磷酸化酶磷酸化(圖6中問號部分),并由EoUPF2架橋聯(lián)系起EJC組分,從而形成八肋游仆蟲NMD較為完整的啟動機制(圖6),而這個完整的啟動機制還需要我們進(jìn)一步實驗研究證實。

4 結(jié)論

在八肋游仆蟲NMD途徑的研究中,首先對EoUPF2的進(jìn)化關(guān)系和結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)它具備完成NMD途徑的基本結(jié)構(gòu)和功能。進(jìn)一步對關(guān)鍵蛋白之間相互作用研究,發(fā)現(xiàn)UPF2既通過它的C末端與SURF復(fù)合體中的UPF1相互作用,又通過MIF4G結(jié)構(gòu)域與EJC復(fù)合體中的Y14相互作用,進(jìn)而介導(dǎo)了SURF復(fù)合體和EJC復(fù)合體的耦聯(lián),對于NMD途徑的啟動機制發(fā)揮著重要的作用。