甘油三酯分子的分離鑒定方法

張 靜，陶寧萍，2，王明福，王錫昌

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306； 2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306)

作為天然存在的脂類形式，甘油三酯(Triglyceride，TG)是主要的脂肪傳遞介質(zhì)，同時也是體內(nèi)重要的儲能物質(zhì)，通常以脂滴的形式貯存于骨骼肌中，水解產(chǎn)生脂肪酸后通過β氧化和氧化磷酸化作用提供能量[1-2]。TG分子由一個甘油碳骨架及上面通過酯鍵連接的三個脂肪酸分子構(gòu)成。在沒有認(rèn)識到油脂的本質(zhì)前，人們一直以為油脂中的TG是由同一種脂肪酸組成的。直到20世紀(jì)初，人們才認(rèn)識到TG是混合物，并逐漸認(rèn)識到油脂的性質(zhì)與脂肪酸的種類及其在甘油三個羥基位置上的分布有關(guān),構(gòu)成TG的脂肪酸種類、不飽和度及幾何構(gòu)型都對油脂的性質(zhì)有重要的影響[1]。

體外及體內(nèi)研究均發(fā)現(xiàn)，不同種類油脂如PO、RO、LINO、SO和LO(PO，棕櫚油；RO，菜籽油；LINO，亞麻籽油；SO，葵花籽油；LO，豬油)在消化過程中的脂肪酸釋放速率有所不同，短鏈飽和脂肪酸(如PO中的C16∶ 0)釋放程度高于長鏈多不飽和脂肪酸(如LINO中的C18∶ 3)[3-4]。因此，對TG分子進(jìn)行精確的分離鑒定，對于研究其在生物體內(nèi)的代謝作用有著十分重要的意義。

本文將從不同脂肪酸鏈TG分子、TG同分異構(gòu)體分子及TG對映體分子的分析三個方面進(jìn)行論述，以期對之后發(fā)展穩(wěn)定、快速、精確、高分辨及高通量的TG分析檢測技術(shù)提供參考。

1 不同脂肪酸鏈TG分子分離鑒定

1.1 氣相色譜法(GC)

氣相色譜法始于19世紀(jì)50年代，是分析檢測脂肪酸最常用的方法。對TG利用氣相色譜法進(jìn)行分析，通常對其先進(jìn)行甲酯化處理，使脂肪酸變成甲酯的狀態(tài)，再進(jìn)行氣相色譜分析，得到油脂脂肪酸組成。通過與脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間對照，確定脂肪酸分子類[5]。李玉琪等[6]對比了酸處理法、堿處理法、三氟化硼處理法三種不同的甲酯化方法，結(jié)果顯示不同的甲酯化方法各有優(yōu)缺點，根據(jù)出峰數(shù)目及峰面積的不同結(jié)果，三氟化硼甲酯化法效果更優(yōu)。

高溫氣相色譜法(HTGC)對于直接分析高沸點TG分子具有良好的效果。高溫毛細(xì)管柱的柱溫可以達(dá)到400℃，此條件下HTGC與質(zhì)譜聯(lián)用，TG無需進(jìn)行甲酯化衍生，即可在色譜柱上按碳數(shù)由小到大依次洗脫，縮短樣品預(yù)處理時間[7-8]。Sutton等[9]利用HTGC與飛行時間質(zhì)譜(TOF-MS)聯(lián)用，對幾種TG標(biāo)準(zhǔn)品混合物在25 min內(nèi)完成保留指數(shù)分析，實現(xiàn)了對分子及碎片離子的同時鑒定。

除了單一GC，多維GC(MDGC)近年來也多用于分析復(fù)雜樣品。Waktola等[10]使用HTGC與二維GC聯(lián)用進(jìn)行橄欖油中TG分子的分離分析。其中，第一維GC色譜柱采用相對較短的非極性柱，第二維采用中極性的色譜柱，柱溫可達(dá)到350℃。第一維GC通過相對相對分子質(zhì)量不同及碳原子數(shù)不同而區(qū)分TG分子，這也意味著具有相同相對分子質(zhì)量或碳原子數(shù)的分子會在同一個地方出峰。二維GC則可以根據(jù)每個分子的不飽和程度對其進(jìn)行進(jìn)一步區(qū)分。相比一維GC可檢出15種TG分子，二維GC可以檢出大于29種TG分子。

1.2 高效液相色譜法(HPLC)

高效液相色譜法根據(jù)其分離原理主要包括正相高效液相色譜法(NPLC)、非水反相高效液相色譜法(NARP)、超高效液相色譜法(UHPLC)和二維液相色譜法(2D-LC)[11-18]。

1.2.1 正相高效液相色譜法

通常NPLC更適用于不同極性脂類，如甘油酯、游離脂肪酸、磷脂的分離。但對于極性近似的脂類，NPLC無法做到有效分離[12]。在分離TG時，其色譜峰會有很大程度的重疊，因此NPLC很少獨立對TG分子進(jìn)行分離分析，多與其他類型色譜聯(lián)用。

1.2.2 非水反相高效液相色譜法

NARP對于脂質(zhì)的分離程度依賴于分子中碳鏈的長度和雙鍵數(shù)。常用的NARP固定相是C18鍵合硅膠，含有十八碳烷基，并與硅烷醇表面以共價鍵結(jié)合。流動相對分離效果影響很大，一般選用以乙腈為主的混合溶劑，此外還可選用丙酮、二氯甲烷、甲醇、四氫呋喃、氯仿等[17]。NARP分離TG受很多因素的影響，但在一定條件下仍具有規(guī)律性，流出順序一般是根據(jù)碳數(shù)及雙鍵數(shù)而定，每個雙鍵相當(dāng)于減少兩個碳原子，TG組分一般按照當(dāng)量碳數(shù)(Equivalent carbon number，ENC)出峰。ENC又稱為分配數(shù)(Partition number，PN)，其值為甘油三酯中脂肪酸的總碳數(shù)和(CN)減去總雙鍵數(shù)(n)的2倍，具有相同ECN值的甘油三酯組分稱為臨界對(Critical pairs)，例如，PPP與PPO、POO與OOO具有相同的ECN值。臨界對相對保留時間相同，同出一個峰(此情況下，Sn-1、2、3位排布差異對出峰時間也沒有影響)。NARP對于具有相同ENC的TG組分無法實現(xiàn)有效分離[19]。

1.2.3 超高效液相色譜法

超高效液相色譜系統(tǒng)使用粒徑不超過2 μm的色譜柱[20]。相比普通高效液相色譜，UHPLC可以在更寬的線速度范圍內(nèi)保持恒定柱效，加快分離速度，提高分離靈敏度。Arfa等[21]利用UHPLC-APCI-MS系統(tǒng)對四種北非芝麻中的TG進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示其檢測范圍在0.001～0.400 mg/mL之間，線性良好，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.995。相比HPLC-APCI-MS系統(tǒng)可檢測到19種芝麻TG分子，此種方法可檢測到30種芝麻TG分子[22]。

1.2.4 二維液相色譜法

TG分子同分異構(gòu)體由于具有相似的結(jié)構(gòu)及化學(xué)性質(zhì)，僅憑普通的液相色譜，對其分離極其困難?；诟黝惿V的優(yōu)缺點，2D-LC更適用于復(fù)雜樣本的分析，不僅可以良好地分離不同類脂質(zhì)，而且可以用于類別內(nèi)分離以及痕量物質(zhì)的檢測，被廣泛用于TG組學(xué)的研究。2D-LC分離是將收集正相色譜的組分再進(jìn)行反相色譜分析，或與之順序相反。常用的組合為離子交換/反相二維色譜[23-24]。

2D-LC主要分為離線與在線兩種形式。將非水反相/銀離子色譜(NARP/Ag+-HPLC)離線二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用，對花生油中的TG具有良好的定性與定量分析效果，該離線2D-LC具有出色的正交選擇性。整個過程需要將第一維色譜的洗脫液收集，隨后進(jìn)樣到第二維色譜，再次進(jìn)行分離，所以時間較長，且有機(jī)溶劑耗費較大[25]。相比離線分析模式，在線檢測通過接口將兩個分離體系內(nèi)互補(bǔ)的色譜柱串聯(lián)起來，第一根色譜柱的洗脫液可被收集并自動進(jìn)樣到第二根色譜柱，具有耗時短、重現(xiàn)性好的優(yōu)點。但對專用接口的要求較高，而且操作難度也相應(yīng)增大。此外，對于具有不同保留機(jī)制的兩種分離模式，必須考慮二維溶劑與在線分離系統(tǒng)的相容性，可能不適于高效快速分析。

綜上所述，未來建立快速、高通量的2D-LC，對TG分析檢測技術(shù)的發(fā)展和TG組學(xué)研究有很好的促進(jìn)作用。

1.3 超臨界流體色譜法(SFC)

SFC以超臨界流體做流動相，是依靠流動相的溶劑化能力來進(jìn)行分離、分析的色譜過程。SFC兼有氣相色譜和液相色譜的色譜。1961年，SFC的概念第一次由Lovelock和Klesper提出，之后該技術(shù)得到了快速的發(fā)展。作為GC和HPLC的補(bǔ)充，SPC具有分離溫度低、速度快、兼容性好的優(yōu)點。因此，SFC可以良好地分離熱敏性物質(zhì)，選擇性高，并且可與火焰離子化檢測器、熒光檢測器等多種檢測器聯(lián)用[26-27]。此外，相比GC或者HPLC，SFC可以簡單地將產(chǎn)品與溶劑分離，后處理更加便捷，產(chǎn)品純度更高。

在脂類的分析中，SFC常使用粒徑小于2 μm的硅膠柱，可以實現(xiàn)廣范圍、高通量的快速分析，常用于極性和非極性脂質(zhì)的區(qū)分。反相色譜柱的使用可以根據(jù)TG分子碳骨架所連接的脂肪酸種類不同，分離單個分子，比如TG的同分異構(gòu)體。Lee等[28]通過SFC與C30反相色譜柱聯(lián)用，對食用油中的TG分子進(jìn)行分析，共鑒定35種TG分子，其中包括6對同分異構(gòu)體，如PPLn/PLnP、PPO/POP等。

研究者比較HPLC與SFC對于生物樣本中脂質(zhì)信息的分析能力，結(jié)果顯示，SFC可以利用分子中的脂肪酸鏈長與雙鍵數(shù)對分子進(jìn)行分離，HPLC對雙鍵數(shù)4以上的分子保留較低，對雙鍵數(shù)0～3的分子無法分離。兩種方法同與四級桿-飛行質(zhì)譜聯(lián)用，兩者的離子相對強(qiáng)度響應(yīng)值無顯著差異，但就Hex2Cer d18∶ 1/12∶ 0分子而言，HPLC的離子相對強(qiáng)度響應(yīng)值是SFC的一半，如[M+H-Hex2]+在HPLC中的響應(yīng)值為11.5%，在SFC中為22.6%。另外，HPLC的分析時間需要10 min左右，而SFC只需要6 min左右[29]。因此，相較于HPLC，SFC更適合于非極性脂質(zhì)的分離分析。

1.4 質(zhì)譜法(MS)

針對不同的TG分子分析對象，氣相色譜及高效液相色譜系統(tǒng)通常需要與各種檢測器配合進(jìn)行，如蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)、紫外檢測器(UV)、質(zhì)譜等。由于自然樣本中的TG分子多種多樣，相應(yīng)的對照標(biāo)準(zhǔn)品難以獲得，因此對于TG的檢測多依賴于MS。利用MS可以分析得到TG分子的脂肪酸鏈種類、位置及雙鍵數(shù)目等信息。

1.4.1 不同離子源MS技術(shù)

根據(jù)離子源不同，目前脂質(zhì)分析常用的有電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)、基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(MALDI-MS)、大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜(APCI-MS)。

ESI在脂質(zhì)組學(xué)分析中應(yīng)用廣泛，尤其是在shotgun技術(shù)中，是常見的直接快速鑒定TG的MS技術(shù)[30]。一般來講，ESI離子源產(chǎn)生的正電荷響應(yīng)較強(qiáng)。但其缺陷在于，TG為非極性化合物，須在ESI噴霧溶劑中加入少量鹽離子以提高電離效率，且只能產(chǎn)生較少的離子碎片，如[M+NH4]+和[M+Na]+[20]。因此，通過ESI得到的TG分子結(jié)構(gòu)信息有限。

MALDI是最早使用的質(zhì)譜成像技術(shù)，可以直接進(jìn)樣分析而不經(jīng)高效液相色譜分離[31]。質(zhì)譜成像技術(shù)是將成像處理軟件與質(zhì)譜的離子掃描技術(shù)相結(jié)合的一種新型分析方法。相比傳統(tǒng)質(zhì)譜法，質(zhì)譜成像技術(shù)更加直觀地顯示脂肪酸分布信息。MALDI可實現(xiàn)高通量全掃描正離子模式，減少峰之間的重疊，在一個圖譜里顯示出較多種類的物質(zhì)。但由于MALDI對基質(zhì)的高要求，因此其穩(wěn)定性及重現(xiàn)性差強(qiáng)人意[32]。

TG位置異構(gòu)體的分離分析一直是相關(guān)分析的難點，APCI與非極性溶劑的兼容性良好，產(chǎn)生的質(zhì)譜圖相對簡單，尤其適用于分析TG位置異構(gòu)體[32]。TG分子在APCI中經(jīng)離子化過程，根據(jù)最終產(chǎn)生的[M+H-RCOOH]+、[M+H-RCOO-R’CO]+、[RCO]+離子不同對脂肪酸在甘油骨架上的位置進(jìn)行鑒定(Sn-2，Sn-1(3))。

1.4.2 不同質(zhì)量分析器MS技術(shù)

對于MS分析效率的評價常?？紤]三個方面：質(zhì)量分辨率，精確度和靈敏度。飛行時間質(zhì)譜(TOF-MS)和軌道離子阱質(zhì)譜(Orbitrap-MS)是脂質(zhì)分析中常用的高通量質(zhì)譜分析技術(shù)。TOF-MS中，產(chǎn)生的離子通過電場進(jìn)行加速，其飛行速度由于各自的m/z不同而產(chǎn)生差異。期間，質(zhì)量分辨率通常隨著飛行路徑的增長而增加，并且可以通過離子反射器進(jìn)行擴(kuò)展。但漂移管的長度通常受儀器所處空間大小的限制。TOF-MS的質(zhì)量分辨率通常可以達(dá)到40 000，準(zhǔn)確度約為5 μg/mL。因此，在分析相對分子質(zhì)量小于500的物質(zhì)時，仍然可能存在有數(shù)十種不同的同重物質(zhì)。通常來講，只有當(dāng)質(zhì)量分辨率超過100 000時才可進(jìn)行同位素峰的區(qū)分并且給出可靠的總結(jié)公式[33]。因此，通常將TOF-MS與四級桿(Quadrupole，Q)串聯(lián)使用來提高分析的準(zhǔn)確性。在TG分子的分析中，TOF-MS常與ESI和MALDI進(jìn)行聯(lián)用。Ikeda等[34]利用LC/ESI-QTOF MS/MS對小鼠肝臟及白色脂肪組織中的TG分子進(jìn)行全面分析，分別鑒定出67種和69種TG分子。Chao等[35]利用UPLC-ESI-QTOF-MS/MS對乙醛酸鹽誘導(dǎo)的腎結(jié)石小鼠血清及腎臟中的TG組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)腎臟中只檢測到3種TG分子，而血清中檢測到31種TG分子，并發(fā)現(xiàn)含有16∶ 0及18∶ 2兩種脂肪酸的TG為其主要存在形式，分別占TG總量的19.3%和26.3%。Carcia等[36]利用MALDI-QTOF MS對TG分子進(jìn)行鑒定分析，實現(xiàn)了對奶粉中添加植物油脂的摻偽鑒別。

Orbitrap-MS的檢測原理是基于內(nèi)部線形電極和外部圓柱形電極之間靜電場中的諧波軸向離子振蕩來進(jìn)行，對于離子的捕獲頻率依賴于離子的m/z值，其軸向捕獲頻率可以根據(jù)傅里葉變換進(jìn)行推算。掃描間隔2 s左右時，Orbitrap-MS的質(zhì)量分辨率可以達(dá)到100 000。在和HPLC聯(lián)用時，Orbitrap-MS的分辨率通常維持在60 000左右，采樣率約在4 Hz。與TOF-MS相比，Orbitrap-MS的采樣率較低，分析時間較長，但其質(zhì)量精確度可以達(dá)到1μg/mL 以下[37-39]。Q Exactive(QE)是近來常用于TG分子分析的一種Orbitrap質(zhì)譜儀。相比常見Orbitrap-MS 設(shè)備，QE在軌道阱前面又串聯(lián)了一個四級桿，離子可首先進(jìn)入四級桿質(zhì)量分析器進(jìn)行篩選，篩選后的母離子進(jìn)入QE中進(jìn)行高分辨研究。相比其他質(zhì)譜分析器，QE更適合于未知樣品的掃描定量，且對標(biāo)準(zhǔn)品的要求較低，適合對樣品中的TG分子進(jìn)行鑒定分析。Shan等[40]利用UHPLC-ESI-Q Exactive對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肺部損傷小鼠的肺部及血漿脂質(zhì)組成進(jìn)行分析，確定出TG(8∶ 0/10∶ 0/10∶ 0)等13種脂質(zhì)分子為其可能的生物標(biāo)記物。

自然界的TG組成十分復(fù)雜，除了不同脂肪酸鏈的分子，同時含有一些同分異構(gòu)體及對映體分子。它們由于自身結(jié)構(gòu)的特殊性，一般的分析方法對其難以實現(xiàn)分離鑒定。接下來，將對這兩種特殊TG分子的分離鑒定進(jìn)行總結(jié)。

2 TG同分異構(gòu)體分子分離鑒定

2.1 反相高效液相色譜法(RPLC)

通過對RPLC的固定相及流動相進(jìn)行修飾，可以對TG同分異構(gòu)體分子進(jìn)行分離。Momchilova等[41]利用三組固定相及流動相組合對PLP/PPL等同分異構(gòu)體分子實現(xiàn)分離(見圖1)。其中，A組固定相為未封端Superspher RP-18柱，流動相為乙腈-四氫呋喃(體積比80∶ 20)，流速0.7 mL/min；B組固定相為封端Superspher RP-18(e)柱，流動相為乙腈-乙醇(體積比65∶ 35)，流速0.9 mL/min；C組固定相為封端Superspher RP-18(e)柱，流動相為乙腈-二氯甲烷(體積比75∶ 25)，流速0.6mL/min。從圖1可以看出，對固定相及流動相的調(diào)整不會改變幾種TG分子的出峰順序，B組的分離度最佳。但三組的分析時間都達(dá)到170～230 min，分析時間過長，且得到的峰形較寬。

注：A.Arachidic acid，二十碳酸；E.Eicosapentaenoic acid，二十碳五烯酸；D.Docosahexaenoic acid，二十二碳六烯酸。

圖1 RPLC分離TG同分異構(gòu)體

2.2 銀離子高效液相色譜法

依據(jù)銀離子(Ag+)與雙鍵之間具有微弱的螯合力，可使不同雙鍵數(shù)的TG有效分離。Ag+與α和β位的雙鍵結(jié)合力不同，利用銀離子高效液相色譜可以將位置異構(gòu)體分開[42]。Ag+一般以AgClO4或AgNO3的形式，可以溶于流動相中，也可以直接涂于固定相上，可用硅膠或ODS作為固定相。流動相根據(jù)樣品不同差別較大，如甲醇-異丙醇、乙腈-丙酮、乙腈-四氫呋喃-二氯甲烷等[4]。

3 TG對映體分子分離鑒定

手性色譜是目前分離分析TG對映體分子的主要方法，主要通過TG對映體與手性固定相之間的作用力不同而達(dá)到分離目的。利用手性色譜可以不經(jīng)衍生化處理而對對映體分子實現(xiàn)分離。固定相是影響手性色譜分離效果的主要因素。脂質(zhì)對映體分子分離中常用到的固定相有纖維素-反式-(3，5-二甲基氨基甲酸酯)、纖維素-反式-(3-氯-4-甲苯基氨基甲酸酯)[43]。

利用手性色譜對幾種TG對映體標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分離，如PoPoP/PPoPo、PPPo/PoPP對映體，出峰時間十分接近，在樣品被分析之前，需要先用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行出峰時間校正。然而，對映體的標(biāo)準(zhǔn)品一般都需要特別合成得到，成本較高。同時，手性色譜分離TG對映體的分離時間較長。

4 數(shù)據(jù)庫在TG分析中應(yīng)用

TG分子的分析結(jié)果會產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)，目前還沒有對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行自動處理和分析的相關(guān)系統(tǒng)，常參考脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)處理方法進(jìn)行處理。其中，對樣品中的脂質(zhì)進(jìn)行定性定量分析是最為基本、最關(guān)鍵的一步，而這需要依賴數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)庫不但可以提供生物體中各種代謝物的結(jié)構(gòu)信息，還包含化合物生化信息、疾病相關(guān)的代謝差異以及有關(guān)的定量數(shù)據(jù)。對于TG而言，需要建立關(guān)于生物系統(tǒng)中所有TG化合物的數(shù)據(jù)庫，為未知的TG化合物及其代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定提供相關(guān)信息，或可用于已知TG分子生物功能的解釋[44-45]。目前，已有為脂質(zhì)組學(xué)設(shè)計的特定數(shù)據(jù)庫與軟件，如表1所示。

表1 幾種常用脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫[44-45]

5 結(jié)束語

TG作為動植物油脂的主要組成成分，其分子結(jié)構(gòu)決定了油脂的理化性質(zhì)及營養(yǎng)價值。因此，TG的分子組成可以作為油脂品質(zhì)評價的重要指標(biāo)，從而達(dá)到鑒別摻偽、確定產(chǎn)地等目的。對于結(jié)構(gòu)組成復(fù)雜的TG分子，未來對其鑒定分析將主要聚焦在實現(xiàn)更高靈敏度、更高通量的檢測；對于TG中的同分異構(gòu)體及對映體等，提高檢測方法的穩(wěn)定性，使其具有良好的重現(xiàn)性；對現(xiàn)有的脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行完善，使其可以提供更加全面的TG結(jié)構(gòu)信息，并實現(xiàn)對檢測產(chǎn)生大量數(shù)據(jù)的自動分析處理。