HPLC測(cè)定油茶籽油中BaP方法的改進(jìn)

吳耀祥，佘佳榮，李玉平

(湖南省林產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心，長(zhǎng)沙 410000)

苯并芘有苯并(a)芘和苯并(e)芘兩種異構(gòu)體，其中苯并(a)芘(BaP)較為常見(jiàn)，是由5個(gè)苯環(huán)和芘分子組成的多環(huán)芳烴化合物，由肉類(lèi)、油脂等其他食品被過(guò)度加熱裂解而產(chǎn)生[1-3]。研究表明，BaP是強(qiáng)致癌物，微小劑量就能引起癌變，對(duì)人體細(xì)胞具有強(qiáng)烈致突變和致畸性，并可能引起大鼠DNA以及肝細(xì)胞損傷[4-6]。目前，世界多數(shù)國(guó)家已加強(qiáng)對(duì)食品中BaP限量管理，相繼出臺(tái)許多關(guān)于BaP的強(qiáng)制性最低限量值標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)GB 2762—2017規(guī)定油脂及其制品中BaP限值為10 μg/kg，歐盟629/2008限值為2 μg/kg[6]。

湖南是我國(guó)油茶大省，全省油茶種植林區(qū)面積和產(chǎn)量都位居前列[7]。由于BaP對(duì)油茶籽油親和力較強(qiáng)[8]，且加工過(guò)程中的高溫，常會(huì)導(dǎo)致成品油里有一定的BaP殘留。因此，建立精準(zhǔn)的油茶籽油中BaP檢測(cè)方法，對(duì)提高油茶籽油質(zhì)量，保護(hù)人類(lèi)健康有著十分重要的意義。現(xiàn)行的BaP檢測(cè)方法有氣相色譜-質(zhì)譜法[9-10]、HPLC法[11]、HPLC-MS法[12-13]等，而回收率試驗(yàn)是評(píng)價(jià)一種檢測(cè)方法好壞的重要指標(biāo)之一。本文在借鑒相關(guān)資料[14-17]的基礎(chǔ)上，主要探究提高HPLC法測(cè)定油茶籽油中BaP的回收率，并分析導(dǎo)致其回收率低的原因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

二氯甲烷、乙腈均為色譜純，美國(guó)TEDIA公司；正己烷為色譜純，CNW公司；質(zhì)量濃度為4.95 μg/mL 甲醇中BaP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBE(E)080476，簡(jiǎn)稱(chēng)BaP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

LC2010A型液相色譜，島津企業(yè)管理儀器有限公司；InertSustain C18色譜柱(5 μm×4.6 μm×250 mm)，島津技邇商貿(mào)有限公司；UGC-12M型氮吹儀；AL204型電子分析天平；15 mL尖底離心管，美國(guó)康寧公司；SBEQ-CG1012固相萃取真空裝置、500 mg，6 mL BaP分子印跡柱；DG-2500R型多管渦旋混合儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 GB 5009.27—2016 凈化方法

稱(chēng)取0.4 g油茶籽油于15 mL尖底離心管中，加入以乙腈稀釋配制的質(zhì)量濃度為49.5 ng/mL的BaP標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，后用5 mL正己烷溶解，2 400 r/min渦旋30 s。

依次用5 mL二氯甲烷、正己烷活化柱子。將待凈化液轉(zhuǎn)移至柱子，待液面降至柱床時(shí)，用6 mL正己烷淋洗柱子，棄去濾液，用6 mL二氯甲烷洗脫并收集到離心管中，將收集液在40℃氮?dú)庀麓蹈?，?zhǔn)確移取0.4 mL乙腈復(fù)溶，2 400 r/min渦旋30 s，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，待HPLC測(cè)定。

1.2.2 改進(jìn)后凈化方法

稱(chēng)取0.4 g油茶籽油于15 mL尖底離心管中，加入以正己烷稀釋配制的質(zhì)量濃度為49.5 ng/mL的BaP標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，后用5 mL正己烷溶解，2 400 r/min渦旋30 s。

接受理論本為一種文學(xué)批評(píng)理論,高舉讀者本身就是作品能動(dòng)構(gòu)成的旗幟，認(rèn)為在作者，作品與讀者的三元關(guān)系中，讀者絕不僅僅是被動(dòng)的部分，沒(méi)有讀者的積極參與或未達(dá)成讀者的預(yù)期視野，那一部作品的歷史生命將是不可思議的。它旨在打破文學(xué)作品封閉的圓圈，從一個(gè)嶄新的視角重新審視作品，即接受理論的視角。

依次用5 mL二氯甲烷、正己烷活化柱子。將待凈化液轉(zhuǎn)移至柱子，待液面降至柱床時(shí)，用10 mL正己烷淋洗柱子，并適當(dāng)加壓抽干柱子中殘留液，后棄去濾液，用6 mL二氯甲烷洗脫并收集到離心管中，將收集液在40℃氮?dú)庀麓蹈?，?zhǔn)確移取1 mL乙腈復(fù)溶，2 400 r/min渦旋30 s，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，待HPLC測(cè)定。

1.2.3 HPLC條件

等度洗脫；流動(dòng)相為乙腈0.88 mL/min，水0.12 mL/min；流速1.0 mL/min；熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)384 nm，發(fā)射波長(zhǎng)406 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫35℃。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取質(zhì)量濃度為4.95 μg/mL的BaP標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為49.5 ng/mL的BaP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用乙腈逐級(jí)稀釋得到質(zhì)量濃度為0.495、0.99、4.95、9.9、19.8 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線梯度溶液，轉(zhuǎn)至液相進(jìn)樣瓶中，按照1.2.3的色譜條件分析，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 精密度、加標(biāo)回收率的測(cè)定

稱(chēng)取9份0.4 g油茶籽油，分別加入質(zhì)量濃度為49.5 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液50、100、150 μL，其對(duì)應(yīng)加標(biāo)質(zhì)量為2.475、4.95、7.425 ng，平行重復(fù)3次，凈化后進(jìn)HPLC分析，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中定量并計(jì)算精密度和回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 改進(jìn)方法條件的確定

2.1.1 加標(biāo)液稀釋溶劑的確定

以乙腈、正己烷分別稀釋配制的BaP標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加相同加標(biāo)量，并按照相同的凈化方法和色譜條件檢測(cè)，并對(duì)比分析兩者的結(jié)果，詳見(jiàn)表1。

表1 不同標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋溶劑的HPLC結(jié)果

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相同的前處理和色譜條件下，兩者色譜圖峰型無(wú)明顯差別，出峰時(shí)間均在12.5 min左右，峰型好且無(wú)拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明該法能使BaP得到較好分離。但正己烷稀釋的峰高、峰面積均比乙腈稀釋的高(見(jiàn)表1)，說(shuō)明乙腈稀釋的回收率較低，這可能是因?yàn)橐译媾c油茶籽油親和力較差，在油茶籽油中幾乎不溶，導(dǎo)致BaP大量殘存在乙腈溶液中，并沒(méi)有完全溶入油茶籽油；在以正己烷淋洗時(shí)把乙腈中的BaP大量洗脫，致使回收率低。而正己烷與油茶籽油親和力強(qiáng)，溶解度大，渦旋時(shí)能與油茶籽油均勻混合，則能很好避免淋洗過(guò)程中BaP的大量流失。因此，選擇以正己烷稀釋BaP標(biāo)準(zhǔn)溶液作為樣品加標(biāo)液。

2.1.2 正己烷淋洗體積的確定

稱(chēng)0.4 g油茶籽油，添加正己烷稀釋的質(zhì)量濃度為49.5 ng/mL的BaP標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，立即用5 mL正己烷溶解，2 400 r/min渦旋30 s，取出，轉(zhuǎn)移至活化好的柱子中，待樣液降至柱床時(shí)，分別以6、10 mL正己烷淋洗，后續(xù)步驟以1.2.2方法處理，比較兩者液相色譜分析的結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同體積正己烷淋洗的HPLC結(jié)果

從表2可以看出，不同體積的正己烷淋洗后的分離效果都較好，但以10 mL正己烷淋洗后的譜圖峰高較高，峰面積明顯較大，說(shuō)明信號(hào)響應(yīng)值高，BaP檢出值大。可能是因?yàn)閷?duì)于0.4 g油茶籽油，當(dāng)正己烷淋洗體積為6 mL時(shí)，其淋洗程度略顯不夠，會(huì)導(dǎo)致油茶籽油洗脫不完全，凈化不徹底，會(huì)隨著二氯甲烷洗脫時(shí)一起流入試管中，污染凈化液，影響結(jié)果。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加大正己烷淋洗體積至10 mL，分?jǐn)?shù)次洗滌，后適當(dāng)加壓使柱中殘留液全部流出，再以二氯甲烷洗脫，其效果更好。因此，選擇以10 mL正己烷淋洗。

2.1.3 乙腈復(fù)溶體積的確定

稱(chēng)0.4 g油茶籽油，添加正己烷稀釋的質(zhì)量濃度為49.5 ng/mL的BaP標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，立即用5 mL正己烷溶解，2 400 r/min渦旋30 s，取出，轉(zhuǎn)移至活化好的柱子中，待樣液降至柱床時(shí)，以10 mL正己烷淋洗，6 mL二氯甲烷洗脫，分別以0.4、1 mL乙腈復(fù)溶。結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加0.4 mL乙腈不能很好地溶解樣品，而1 mL乙腈可完全溶解樣品，因此選擇1 mL乙腈進(jìn)行復(fù)溶。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.2.4的方法操作，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=29 702x+16 125,R2=0.998 1。BaP質(zhì)量濃度在0.495～19.8 ng/mL范圍內(nèi)，峰面積與BaP質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度與回收率

按照1.2.5采用改進(jìn)前后的方法進(jìn)行精密度和加標(biāo)回收率試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 兩種方法精密度與加標(biāo)回收率結(jié)果對(duì)比

從表3可知，改進(jìn)前的方法的回收率基本穩(wěn)定在32.48%～47.27%之間，說(shuō)明在前處理時(shí)造成了BaP的大量流失，同時(shí)其RSD值也說(shuō)明，這種變化是穩(wěn)定的。而改進(jìn)后的方法回收率增至91.68%～120.62%，且RSD值小，說(shuō)明精密度和準(zhǔn)確性都進(jìn)一步提高了。

3 結(jié) 論

本文在GB 5009.27—2016的基礎(chǔ)上，改進(jìn)HPLC檢測(cè)油茶籽油中BaP的方法，通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的對(duì)比分析得出，以正己烷稀釋配制的BaP標(biāo)準(zhǔn)溶液作為加標(biāo)液，加大正己烷淋洗體積至10 mL，乙腈復(fù)溶體積至1 mL，能夠大大提高回收率。改進(jìn)后的方法操作簡(jiǎn)單，科學(xué)合理，有效提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。