結(jié)直腸癌中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞及基因表型的分析研究

武艷飛 白雪峰 王智

[摘要] 目的 結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）CD68+及CD163+的檢測及與基因表型的關(guān)系。 方法 免疫組化方法檢測41例CRC腫物，癌旁5 cm（M5）、10 cm（M10）。不典型增生（Atypical hyperplasia，AH）組織CD68+及CD163+的表達(dá)，采用病理切片掃描儀細(xì)胞計(jì)數(shù)。對41例CRC腫物進(jìn)行基因檢測。 結(jié)果 CRC患者CD68+及CD163+檢測腫物組織高于癌旁5 cm、10 cm（P<0.01）;腫物與不典型組織比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;癌旁組織M5與M10比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;回歸分析提示CD163+表達(dá)與K-ras基因突變有顯著性關(guān)系（P<0.05）。 CD68+及CD163+的表達(dá)與B-raf基因突變、MSS（微衛(wèi)星穩(wěn)定型）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓、神經(jīng)侵犯無相關(guān)性（P>0.05）。 結(jié)論 CD68+及CD163+在結(jié)直腸癌腫物間質(zhì)中高表達(dá)，并高于癌旁組織，與AH表達(dá)無相關(guān)性。CD163+在腫物的表達(dá)與K-ras基因突變有相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)直腸癌;CD68+;CD163+;基因檢測;病理切片掃描儀

[中圖分類號] R730.3? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）17-0036-05

[Abstract] Objective To detect the expression of CD68+ and CD163+ in tumor-associated macrophages（TAMs） in colorectal cancer（CRC） and its relationship with gene phenotype. Methods Immunohistochemical method was used to detect the expression of CD68+ and CD163+ in 41 cases of CRC， paracancer 5 cm（M5）， 10 cm（M10）， and atypical hyperplasia（AH） tissues. Cell counts were performed using a pathological slice scanner. Gene detection was performed on 41 CRC tumors. Results The expression of CD68+ and CD163+ in CRC patients was higher than that of paracancer 5 cm and 10 cm tissues（P<0.01）. There was no significant difference between tumor and atypical tissue（P>0.05）. The difference was not statistically significant between paracancer M5 and M10 tissues（P>0.05）. Regression analysis indicated that CD163+ expression was significantly associated with K-ras gene mutation（P<0.05）. The expression of CD68+ and CD163+ was not associated with B-raf gene mutation， MSS（microsatellite stable）， lymph node metastasis， vascular tumor thrombus， and neurological invasion（P>0.05）. Conclusion CD68+ and CD163+ are highly expressed in the interstitial of colorectal cancer， and higher than the adjacent tissues， and have no correlation with AH expression. The expression of CD163+ in the tumor is correlated with the K-ras gene mutation.

[Key words] Colorectal cancer; CD68+; CD163+; Gene detection; Pathological slice scanner

結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是發(fā)展中國家癌癥死亡的主要原因之一。發(fā)達(dá)國家每年有1，300，000個(gè)新病例被診斷出來，而CRC則是其中之一。目前，外科手術(shù)切除是CRC唯一可能的治療方法。在臨床中，約有20%～25%的新診斷CRC患者出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而且僅有很少一部分可以接受治療性手術(shù)，此外，大約50%的CRC患者在切除腫瘤2年內(nèi)會復(fù)發(fā)。研究表明，癌癥不僅是由腫瘤細(xì)胞固有的激活關(guān)系來定義的，而且還由腫瘤相關(guān)微環(huán)境（The tumor microenvironment，TME）[1]招募和激活的免疫細(xì)胞來定義。迄今為止，免疫細(xì)胞在與腫瘤相關(guān)的微環(huán)境中的作用研究較少。與目前用于結(jié)直腸癌分期的組織病理學(xué)方法相比，免疫細(xì)胞在腫瘤樣本中的位置更能預(yù)測患者的病情進(jìn)展[2，3]。本研究通過對腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（Tumor-associated macrophage，TAMs）標(biāo)記物[4]CD68+、CD163+的表達(dá)水平[5]浸潤腫瘤組織與癌旁組織、不典型增生的比較性研究，分析與基因突變、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管神經(jīng)侵犯的的關(guān)系，為臨床治療及預(yù)后監(jiān)測提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年5月～2018年9月包頭市腫瘤醫(yī)院腫瘤切除的41例CRC患者的病歷進(jìn)行回顧性分析。所有的患者均未行手術(shù)治療前的新輔助化療或放療。取腫瘤組織及癌旁5 cm及10 cm標(biāo)本，41例結(jié)直腸癌患者中男26例，女15例。年齡37～86（63.76±10.01）歲，中位年齡64歲。其中結(jié)腸癌11例，直腸癌30例。有腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的19例，未見腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的22例?？梢娒}管侵犯的8例，未見脈管侵犯的33例?？梢娚窠?jīng)侵犯的10例，未見神經(jīng)侵犯的31例?；驒z測MSS（微衛(wèi)星穩(wěn)定型）30例，MSI-L（微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定型）6例，MSI-H（微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定型）5例;B-raf有1例存在基因V600E突變，其余表達(dá)均為陰性;K-ras表達(dá)19例出現(xiàn)基因突變[6]，22例為野生型。病理分型黏液腺癌4例，中分化腺癌24例，低分化腺癌13例。這些CRC患者的標(biāo)本固定石蠟包埋。組織標(biāo)本從病理檔案中檢索?；颊咝畔⑼ㄟ^電子設(shè)備獲取醫(yī)療記錄。包括年齡、性別、是否發(fā)生脈管癌栓及神經(jīng)侵犯、腫瘤位置和腫瘤的描述。

1.2 主要儀器與試劑

CD68（克隆號kp1，批號180815041d）CD163（克隆號10D6，批號180613206b）鼠單克隆抗體，免疫組化S-P法檢測試劑盒，DAB染色試劑盒，購自福建邁新生物工程有限公司。DAKO免疫組化儀（Autostainer Link 48）;LUMATAS免疫組化儀（Titan）;VENTANA免疫組化儀（Benchmark XT）。病理切片掃描儀，購自日本濱松光子學(xué)株式會社。基因檢測試劑盒，購自北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司。PCR熒光定量檢測儀。

1.3 免疫組化流程及細(xì)胞判讀標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 免疫組化流程? 取結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織，距腫瘤5 cm、10 cm處、不典型增生組織，每個(gè)標(biāo)本進(jìn)行3 μm切片，裱片在防脫載玻片上，二甲苯脫蠟無水乙醇脫二甲苯。經(jīng)二甲苯脫蠟切片，水化后，進(jìn)行抗原修復(fù)，室溫孵育;孵育后用PBS洗滌，滴加一抗CD68+及CD163+ 37℃孵育1 h，用PBS洗滌后滴加二抗37℃孵育20 min，PBS洗凈后滴加新配置的DAB試劑;再經(jīng)復(fù)染、分化、返藍(lán)、脫水、透明、封片、讀片觀察結(jié)果。

1.3.2 細(xì)胞判讀標(biāo)準(zhǔn)? 采用病理切片掃描儀掃描切片，低倍鏡下對切片進(jìn)行掃描，確定腫瘤密度TAMs最高的區(qū)域即熱點(diǎn)區(qū)，在30倍視野下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。數(shù)10個(gè)視野取平均值，陽性細(xì)胞染色標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞漿、細(xì)胞膜染色明顯，著色和背景對比清晰。

1.4 基因檢測

1.4.1 DNA提取? 石蠟切片，厚度8 μm，5～6張。將切片裝于1.5 mL無菌離心管中，脫蠟，脫二甲苯。加入200 μL 緩沖液GA（Buffer GA）和20 μL Proteinase K進(jìn)行孵育。再加入250 μL無水乙醇后離心，加入吸附柱CR2中，依次加220 μL緩沖液GB（Buffer GB）離心、500 μL緩沖液GD（Buffer GD）離心、2次600 μL漂洗液PW（Buffer PW）離心。放置5 min吸附柱CR2轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜滴加30～100 μL緩沖液TE，室溫放置5 min，離心，將收集有DNA的離心管-20℃保存。

1.4.2 PCR擴(kuò)增? 分別加12.5 μL（B-raf、K-ras及MSI）反應(yīng)液、6.5 μL 引物和4 μL水，加入已提取的DNA樣本，離心后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)及一代基因測序。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，將病理切片掃描儀的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其中CD163+的表達(dá)情況不符合正態(tài)分布，腫物與癌旁5 cm、癌旁10 cm、不典型增生組織CD68+、CD163+ TAM的表達(dá)情況及差異用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Bonferroni法，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)（α）為0.05。腫瘤組織中兩種標(biāo)記物表達(dá)量與病理參數(shù)的比較采用二元Logistic回歸分析，P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC中CD68+、CD163+巨噬細(xì)胞的表達(dá)與癌旁組織的比較

CD68+、CD163+在腫瘤組織表達(dá)不均[6]，主要在腫瘤的間質(zhì)，多見于腫瘤壞死區(qū)的周圍[7]。而癌旁組織及不典型增生組織表達(dá)多見于黏膜層。兩者在腫瘤組織的表達(dá)水平均明顯高于癌旁5 cm、10 cm（P<0.01），腫瘤組織與不典型增生組織比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），癌旁5 cm與癌旁10 cm比較表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），提示結(jié)直腸癌組織中存在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤。因此在不典型組織中CD68+、CD163+的表達(dá)與腫瘤組織無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，癌旁5 cm與癌旁10 cm的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1、封三圖4）。

2.2 CRC中CD68+、CD163+巨噬細(xì)胞的表達(dá)與病理參數(shù)關(guān)系進(jìn)行回歸分析

基因檢測MSS（微衛(wèi)星穩(wěn)定型）30例，MSI-L（微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定型）6例，MSI-H（微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定型）5例將MSI不穩(wěn)定型的歸為一組;B-raf基因一例出現(xiàn)V600E突變，其余均為野生型;K-ras表達(dá)18例出現(xiàn)體細(xì)胞突變，突變形式B（Gly12Asp）5例、F（Gly 12Val）5例、D（Gly12Cys）4例、E（Gly12Ser）2例、G（Gly 13Asp）2例，將有突變的歸為一組，與未出現(xiàn)突變的一組進(jìn)行比較;采用二元Logistic回歸分析，結(jié)果表明，CD163+巨噬細(xì)胞的表達(dá)與K-ras基因突變有相關(guān)性（P<0.05）。CD68+、CD163+巨噬細(xì)胞的表達(dá)與MSS、B-raf基因突變、淋巴結(jié)（Lymphonodus，L）轉(zhuǎn)移及脈管癌栓（Vessel carcinoma embolus，VC）及神經(jīng)（Nerve，N）侵犯無相關(guān)性（P>0.05），CD68+巨噬細(xì)胞的表達(dá)與K-ras基因突變無相關(guān)（P>0.05）。見表2、圖1、2。

3 討論

在過去的研究中，癌癥細(xì)胞的基因組和生物學(xué)變化被廣泛地研究，以確定不同預(yù)后和治療反應(yīng)的患者亞群，以及尋找潛在的藥物靶點(diǎn)?，F(xiàn)在人們認(rèn)識到，TME對腫瘤細(xì)胞具有重要的支持作用。免疫細(xì)胞是腫瘤的主要組成部分微環(huán)境，通過與腫瘤的相互作用影響腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移細(xì)胞。巨噬細(xì)胞通常是腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞中最豐富的組成部分。巨噬細(xì)胞被認(rèn)為具有表型和功能性可塑性，可以根據(jù)細(xì)胞的位置和腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子環(huán)境[8]，將其極化成M1或M2 巨噬細(xì)胞狀態(tài)[9]。一般來說M1巨噬細(xì)胞，也被稱為經(jīng)典激活巨噬細(xì)胞，M2巨噬細(xì)胞是參與免疫調(diào)節(jié)、抗炎和支持腫瘤的活動。CD68在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中廣泛表達(dá)，使該蛋白不特異于單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞家族，是人類單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的廣泛標(biāo)記;CD163（Cluster of Differentiation 163）清道夫受體為富含半胱氨酸的膜蛋白[10]，位于吞噬細(xì)胞表面，CD163是一種血紅蛋白/結(jié)合珠蛋白復(fù)合物清除受體，位于吞噬細(xì)胞表面，只在循環(huán)單核細(xì)胞和組織巨噬細(xì)胞上表達(dá)，被認(rèn)為是M2巨噬細(xì)胞的重要特異性標(biāo)志物。M2巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的許多因子促進(jìn)腫瘤惡化，刺激腫瘤的生長[11，12]。

CD68+和CD163+標(biāo)記[13]對巨噬細(xì)胞的定義可能有些不夠全面，因?yàn)榫奘杉?xì)胞是高度可塑性的細(xì)胞，可以顯示一系列表型。然而，標(biāo)記巨噬細(xì)胞仍可用于識別不同巨噬細(xì)胞群體的主要表型或功能。雖然我們用CD68+和CD163+標(biāo)記檢測巨噬細(xì)胞表達(dá)的，但仍有可能不是所有的巨噬細(xì)胞都表達(dá)這些標(biāo)記物，因此在本研究中可能會失去部分巨噬細(xì)胞。還需要進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證，并尋找更特異的標(biāo)志物。因此，通過檢測基因MSS，B-raf及K-ras探討與巨噬細(xì)胞的浸潤的相關(guān)性[14]，尋找更多的方法研究腫瘤的性質(zhì)和特點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化S-P法檢測腫瘤部位、癌旁組織及不典型增生組織的表達(dá)情況，采用病理切片掃描儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，30倍背景下10個(gè)視野取平均值，盡量減少誤差。由于小樣本病例研究，CD163+的表達(dá)不符合正態(tài)分布。因此采用非參數(shù)檢驗(yàn)提示腫瘤組織中存在CD68+、CD163+巨噬細(xì)胞的浸潤，且高表達(dá)于癌旁組織。

本次研究結(jié)果表明CD163+的表達(dá)水平與K-ras基因突變存在相關(guān)性。在CRC中通常有40%患者檢測到K-ras突變。K-ras蛋白是EGFR信號傳導(dǎo)通路中關(guān)鍵的下游調(diào)節(jié)因子，巨噬細(xì)胞的EGFR信號通路是結(jié)腸炎相關(guān)癌變（colitis-associated carcinogenesis，CAC）的關(guān)鍵組成部分[15]。一項(xiàng)生物體內(nèi)侵襲實(shí)驗(yàn)表明TAMs通過腫瘤細(xì)胞和TAMs之間的旁分泌信號途徑促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動和侵襲，巨噬細(xì)胞在這個(gè)途徑中表達(dá)EGF，促進(jìn)細(xì)胞形成細(xì)長的突起并被癌細(xì)胞侵襲[16]。

研究發(fā)現(xiàn)K-ras突變除了促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)在的增殖和血管生成作用外，還可驅(qū)動具有M2 TAM極化的免疫抑制性腫瘤微環(huán)境[17，18]，募集骨髓來源的抑制性細(xì)胞（Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs），并增加Treg/Th17反應(yīng)，這可能是由IL-6自分泌和旁分泌方式共同作用的結(jié)果。IL-6阻斷不僅對腫瘤（上皮）細(xì)胞具有直接抑制作用，而且還可以使親腫瘤免疫抑制環(huán)境向抗腫瘤表型轉(zhuǎn)化[19]。因此巨噬細(xì)胞M2可能參與或影響了K-ras的突變路徑，CD163+的表達(dá)水平增高，是否提示K-ras的突變率增加。

綜上所述，巨噬細(xì)胞在TME中產(chǎn)生重要作用，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。腫瘤內(nèi)TAM計(jì)數(shù)與CRC腫瘤惡性程度相關(guān)[20]，腫瘤組織中TAM的計(jì)數(shù)高于癌旁組織。CD163+巨噬細(xì)胞M2表達(dá)與K-ras突變有相關(guān)性。K-ras突變驅(qū)動具有M2 TAM極化的免疫抑制性腫瘤微環(huán)境。巨噬細(xì)胞M2可能參與或影響K-ras的突變路徑，M2巨噬細(xì)胞增加與K-ras突變可能性增加相關(guān)，這將為CRC的病情進(jìn)展評估提供參考。

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（收稿日期：2018-12-20）