超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜法分析葫蘆巴成分

秦玉華，王君花，劉忠英

(1.海南熱帶海洋學(xué)院，海南 三亞 572022；2.海南省海洋食品工程技術(shù)研究中心，海南 三亞 572022；3.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130021)

葫蘆巴(Trigonellafoenum-graecum, L.)，別名苦豆、香豆子、香草，為豆科蝶形花亞科一年生草本植物。葫蘆巴種子是我國傳統(tǒng)中藥，具有抗腫瘤、降血糖、抗氧化等藥用價值，已被多版《中國藥典》收錄。此外，葫蘆巴還被廣泛用于食品工業(yè)[1-2]?，F(xiàn)代研究表明，葫蘆巴的主要成分為糖類、蛋白質(zhì)類、脂類、皂苷類、黃酮類、生物堿類和揮發(fā)性有機(jī)成分等，其中，含量最高的3類藥效活性組分依次是多糖、皂苷和黃酮。目前，對葫蘆巴中葫蘆巴堿、多糖、揮發(fā)油等成分的研究較多[3-5]，而對黃酮和皂苷類化合物的報道較少。

研究中藥化學(xué)成分的傳統(tǒng)方法是用溶劑分配和柱色譜法將其逐一分離為單一化合物，然后采用化學(xué)方法對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，操作繁瑣、分離效率和自動化程度低，且對微量組分的分離困難。高效液相色譜-質(zhì)譜法具有高效、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，可用于中藥天然產(chǎn)物有效成分的定性、定量分析[6-7]。

有文獻(xiàn)報道[8-10]，葫蘆巴多糖的提取多采用水提取工藝，而黃酮和皂苷多采用高濃度的乙醇提取工藝。本實驗室在前期研究中發(fā)現(xiàn)，與單組分比較，葫蘆巴多糖、皂苷、黃酮3個組分配伍對糖尿病的治療效果更好[11]。為此，本工作利用水提和醇提兩種方法提取葫蘆巴中的化學(xué)成分，采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF MS)技術(shù)分析提取物中的黃酮和皂苷類化合物，以期找到一種簡便快速的提取工藝能將3種組分同時提取出來，為深入開展葫蘆巴活性成分的提取和藥效學(xué)研究奠定基礎(chǔ)，同時為研究葫蘆巴的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

Acquity UPLC液相色譜儀、SYNAPT G2-S HDMS 質(zhì)譜儀：均為美國Waters公司產(chǎn)品；Unitary C18分析柱：華普新科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

葫蘆巴種子：購自長春市醫(yī)藥藥材供銷公司，經(jīng)吉林大學(xué)藥學(xué)院王廣樹教授鑒定為葫蘆巴種子；甲醇和乙酸：均為色譜純，美國Fisher公司產(chǎn)品；超純水：由Milli-Q系統(tǒng)制備；其他試劑均為色譜級。

1.3 實驗方法

1.3.1溶液制備 葫蘆巴醇提組分的制備：精密稱取5 g葫蘆巴粗粉，用10倍量的70%乙醇回流提取3次，每次2 h，減壓抽濾，合并濾液、濃縮、冷凍干燥，得到葫蘆巴醇提組分。

葫蘆巴水提組分的制備：精密稱取5 g葫蘆巴粗粉，用50倍量的水在10 ℃冷浸提取3次，每次1 h，以4 000 r/min離心10 min，收集上清液、濃縮。向溶液中加入95%乙醇至乙醇濃度為70%，邊加邊攪拌，靜置過夜，以4 000 r/min離心10 min，收集上清液、濃縮、冷凍干燥，得到葫蘆巴除糖后的水提組分。

甘草苷內(nèi)標(biāo)溶液的制備：精密稱取1 mg甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品，用50%甲醇溶解并稀釋至25 mg/L。

供試品溶液的制備：精密稱取適量的葫蘆巴醇提組分和除糖后的水提組分，用50%甲醇溶解，加入適量的甘草苷內(nèi)標(biāo)溶液，使醇提組分和水提組分供試品溶液的最終生藥濃度為10 g/L，甘草苷內(nèi)標(biāo)物的最終濃度為5 mg/L，過0.22 μm濾膜，待測。

1.3.2UPLC-MS和UPLC-MS/MS分析 色譜條件：Unitary C18分析柱(4.6 mm×150 mm×5 μm)；流動相：A為0.1%甲酸，B為乙腈；洗脫程序：0～5 min(10%～15%B)，5～10 min(15%B)，10～20 min(15%～20%B)，20～25 min(20%～23%B)，25～40 min(23%～24%B)，40～48 min(24%～25%B)，48～64 min(25%～40%B)，64～65 min(40%～55%B)，65～70 min(55%～60%B)，70～75 min(70%B)，75～80 min(70%～80%B)，80～85 min(80%～100%B)；流速0.5 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源 (ESI)；四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)量分析器；負(fù)離子模式檢測；離子源溫度120 ℃；脫溶劑氣溫度250 ℃；錐孔氣(N2)流速50 L/h；脫溶劑氣(N2)流速為600 L/h；毛細(xì)管電壓2.0 kV；錐孔電壓60 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 葫蘆巴醇提、水提組分化學(xué)成分的分析

采用UPLC-Q-TOF負(fù)離子模式分析加入甘草苷后的葫蘆巴醇提組分和水提組分供試品溶液，得到的總離子流圖示于圖1?？梢?，內(nèi)標(biāo)化合物甘草苷的保留時間為24.25 min，位于化合物11和12之間。各化合物得到了較好的分離，兩種供試品溶液的總離子流圖相似，區(qū)別是保留時間75 min后，醇提組分的色譜峰比水提組分多，說明醇提組分中極性小的化合物比水提組分多。本研究共鑒定出36種化合物，包括12種黃酮類化合物和24種皂苷類化合物，具體信息列于表1。

2.2 黃酮類化合物結(jié)構(gòu)鑒定

葫蘆巴黃酮的主要苷元為芹菜素(apigenin, api)和木犀草素(luteolin, lut)。以芹菜素為苷元的黃酮，其特征碎片為m/z383[M-H-CHOH-CHO-CH2OH]-(M-H-120-90)、m/z353[M-H-CHOH-CHOH-CHO-CH2OH]-(M-H-120-120)；以木犀草素為苷元的黃酮，其特征碎片為m/z357[M-H-CHOH-CHO-CH2OH]-(M-H-90)、m/z327[M-H-CHOH-CHOH-CHO-CH2OH]-(M-H-120)。葫蘆巴黃酮糖苷主要連接在6位和8位上，易發(fā)生糖環(huán)內(nèi)部裂解，糖環(huán)內(nèi)部裂解碎片丟失具有一定的規(guī)律性，組成糖鏈的單糖分為戊糖(木糖、阿拉伯糖)和己糖(葡萄糖、半乳糖、鼠李糖)，戊糖出現(xiàn)60、90 u碎片丟失；己糖出現(xiàn)60、90、120 u碎片丟失[12-13]，其中鼠李糖出現(xiàn)74、104 u碎片丟失，結(jié)合準(zhǔn)分子離子峰，有助于快速發(fā)現(xiàn)和鑒定碳苷類化合物。此外，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[14-15]，可根據(jù)碎片離子的相對豐度強(qiáng)弱，推測黃酮類化合物中糖苷的位置：如準(zhǔn)分子離子m/z563的碎片離子峰m/z473相對豐度明顯強(qiáng)于碎片離子峰m/z443時，可推測戊糖連接在6位C上；準(zhǔn)分子離子m/z447的碎片離子峰m/z327相對豐度明顯強(qiáng)于碎片離子峰m/z357時，可推測己糖連接在8位C上。

葫蘆巴黃酮準(zhǔn)分子離子峰主要包括m/z593、563、557、461、431、447，其中含有大量的同分異構(gòu)體，由于缺少對照品，僅鑒定了苷元的類型、糖的類型及糖苷位置，尚不能確定其具體結(jié)構(gòu)。通過分析黃酮類化合物在MS2模式下的碎片離子，并查閱相關(guān)文獻(xiàn)[15-18]，本實驗最終鑒定出11種黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，示于圖2。第12個推測為類黃酮類化合物(槲皮素類化合物)，因其雙鍵位置不確定，未列于圖2中。

圖1 葫蘆巴加入甘草苷后，醇提組分(a)和水提組分(b)的總離子流圖Fig.1 Chromatograms of ethanol extract (a) and water extract (b) after sugar removal with liquiritin of fenugreek

準(zhǔn)分子離子為m/z593、563、557、431的葫蘆巴黃酮類成分均出現(xiàn)了m/z383、353碎片離子，由此判斷它們的苷元為芹菜素。以化合物3為例，其碎片離子為m/z593、503、473、383、353，出現(xiàn)了兩次90、120 u中性丟失，即發(fā)生兩次糖環(huán)內(nèi)部裂解，表明其含有2個己糖，分別連接在6位和8位C上，其質(zhì)譜圖示于圖3。結(jié)合參考文獻(xiàn)[12]，最終確定化合物3為芹菜素-6,8-C-二葡萄糖苷。

準(zhǔn)分子離子峰m/z563出現(xiàn)了m/z503、473、443、383、353碎片離子，中性丟失依次為60、90、120 u，推測其含有1個戊糖和1個己糖結(jié)構(gòu)；準(zhǔn)分子離子峰m/z577出現(xiàn)了m/z503碎片離子，中性丟失為74 u，推測其含有鼠李糖結(jié)構(gòu)；準(zhǔn)分子離子峰m/z431先后發(fā)生中性丟失90、120 u，推測其含有1個己糖結(jié)構(gòu)。

化合物7、8均出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子峰m/z447，碎片離子為m/z357[M-H-CHOH-CHO-CH2OH]-(M-H-90)、m/z327[M-H-CHOH-CHOH-CHO-CH2OH]-(M-H-120)，確定化合物7和8的苷元為芹菜素。以化合物8為例，其MS/MS碎片離子m/z327的相對豐度明顯強(qiáng)于m/z357，推測己糖連接在8位C上，最終鑒定該化合物為木犀草素-8-C-己糖苷，其中己糖苷為葡萄糖或半乳糖，示于圖4。

2.3 皂苷類化合物結(jié)構(gòu)鑒定

葫蘆巴皂苷為甾體皂苷，包括呋喃皂苷、螺甾皂苷，苷元種類豐富。通常以一對非對映異構(gòu)體(C-25S和C-25R)的形式存在，在ODS柱上S構(gòu)型的皂苷較R構(gòu)型出峰早，由此可判斷一對非對映異構(gòu)體的構(gòu)型[19]。葡萄糖、鼠李糖、木糖構(gòu)成了糖苷，其連接在3位和26位羥基上，裂解時糖環(huán)依次整個脫落，由中性丟失順序可推斷糖基連接順序，同時，通常將最后1個丟失的糖基歸于26位羥基。

通過分析UPLC-Q-TOF MS/MS模式下的碎片離子和保留時間，并結(jié)合參考文獻(xiàn)[19-21]，推斷皂苷中的糖基數(shù)量、單糖類型、連接位點(diǎn)、C-25S/R構(gòu)型以及苷元類型等，最終鑒定出24種皂苷類化合物，結(jié)構(gòu)示于圖5。

圖2 葫蘆巴中黃酮類成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structures of flavonoids in fenugreek

圖3 化合物3的MS(a)和MS/MS(b)質(zhì)譜圖Fig.3 MS (a) and MS/MS (b) spectraof compound 3

圖4 化合物8的MS(a)和MS/MS(b)譜圖Fig.4 MS (a) and MS/MS (b) spectraof compound 8

以化合物13為例，其MS/MS譜圖示于圖6。在MS模式下，出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子峰m/z905及碎片離子峰m/z951[M+HCO2H]-，MS2模式下出現(xiàn)碎片離子m/z773[M-132]-、m/z611[M-132-162]-、m/z449[M-132-162-162]-，推測其先后失去1分子木糖、1分子葡萄糖、1分子葡萄糖，最后1個葡萄糖通常連接在C-26羥基上。此外，根據(jù)R/S構(gòu)型異構(gòu)體在ODS柱上的出峰特點(diǎn)，即25S構(gòu)型的化合物出峰早于25R構(gòu)型的化合物，最終確定該皂苷為葫蘆巴皂苷Ia:25(S)-5α-呋甾-2α, 3β, 22,26-四醇,3-O-[β-D-木吡喃糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷]-26-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

2.4 乙醇提取物和水提物主要成分的相對含量分析

分別向乙醇提取物和水提物的供試品溶液中加入甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使兩種提取物溶液的最終生藥濃度為10.0 g/L，甘草苷的最終濃度為5.0 mg/L。以甘草苷的峰面積為標(biāo)準(zhǔn)，將兩種提取物溶液中主要化合物的峰面積與甘草苷峰面積對比，得到各化合物的相對峰面積值，列于表1。從表1可以看出，與水提物相比，乙醇提取物中化合物5、10、11的相對含量明顯較高，其他黃酮類化合物的相對含量沒有明顯變化；乙醇提取物中黃酮類化合物的相對含量之和是水提物中的1.13倍，乙醇提取物中皂苷類化合物相對含量之和是水提物中的1.32倍。

圖5 葫蘆巴中皂苷類成分的結(jié)構(gòu)式Fig.5 Chemical structures of saponins in fenugreek

圖6 化合物13的MS(a)和MS/MS(b)質(zhì)譜圖Fig.6 MS (a) and MS/MS (b) spectra of compound 13

3 結(jié)論

本研究采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法對葫蘆巴醇提物和水提物中的黃酮和皂苷類化合物進(jìn)行定性分析，并以甘草苷為內(nèi)標(biāo)，對黃酮和皂苷類化合物進(jìn)行半定量分析。定性分析共鑒定出36種化合物，包括12種黃酮類化合物，24種皂苷類化合物。以代表性的黃酮類和皂苷類化合物為例，對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了詳細(xì)闡述?；谀壳皹?biāo)準(zhǔn)品種類的限制，其他黃酮和皂苷類化合物的結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步研究。葫蘆巴經(jīng)水提取，除得到多糖外，還可以得到黃酮和皂苷類化合物，但水提物中黃酮和皂苷的含量低于醇提物。該結(jié)果可為葫蘆巴降血糖藥物的開發(fā)和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、以及質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供理論依據(jù)。