QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境沉積物中磺胺類、喹諾酮類、大環(huán)內酯類抗生素

錢卓真，湯水粉，梁 焱，位紹紅，羅方方，陳 思

(1.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013；2.海南省環(huán)境科學研究院，海南 海口 570026)

磺胺類、喹諾酮類、大環(huán)內酯類抗生素是人工合成的廣譜類抗生素藥物，被廣泛應用于畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)。據(jù)文獻[1-3]報道，近年來，抗生素使用量呈現(xiàn)逐年上升趨勢，在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中被頻繁檢出。該類抗生素進入水體環(huán)境的方式有兩種：一是通過水產(chǎn)養(yǎng)殖直接投放方式進入水體環(huán)境[4]；另一種，借由現(xiàn)有水產(chǎn)養(yǎng)殖常采用塘頭配套養(yǎng)豬或水面養(yǎng)鴨的養(yǎng)殖模式，通過畜禽糞便媒介間接進入水體環(huán)境[5]。該類藥物在沉積物中性質穩(wěn)定、半衰期較長、不易降解[6-8]，可對環(huán)境造成直接污染；還可能對沉積物中微生物的耐藥性產(chǎn)生壓力，誘導抗生素抗性基因和耐藥性細菌的產(chǎn)生，從而產(chǎn)生嚴重的生態(tài)毒性[9-10]。此外，抗生素還可通過食物鏈蓄積作用進入人體，對人體器官產(chǎn)生蓄積毒性，危害人體健康。因此，近年來，抗生素的不當使用引起的環(huán)境污染和食品安全問題已成為研究熱點。

目前，用于檢測抗生素的方法有電化學法[11]、酶聯(lián)免疫吸附法[12]、高效液相色譜法[13]、高效液相色譜-串聯(lián)質譜法[14]、熒光偏振免疫分析法[15]等。其中，高效液相色譜-串聯(lián)質譜法具有準確度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，是測定抗生素殘留的主要檢測方法。與高效液相色譜-串聯(lián)質譜法結合的傳統(tǒng)樣品前處理方法主要是固相萃取法，但其步驟繁瑣、耗時、費用較高。雖然近幾年基于固相萃取法衍生出一系列樣品處理方法，如：磁性固相萃取法[16-17]、分子印跡固相萃取法[18-19]、多壁碳納米管固相萃取等[20-21]，但整體研究難度仍較大。2003年，Anastassiades等[22]報道了一種快速、簡單、廉價、高效、安全的樣品前處理技術，即QuEChERS方法，是全球檢測水果、蔬菜中農(nóng)殘的標準樣品處理方法。該方法已廣泛應用于多種基質，如肉類、血液、酒，但將其應用于沉積物中抗生素殘留測定的研究鮮有報道。

本工作擬以水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的沉積物為研究對象，通過考察提取溶劑、提取方法、吸附劑組成及配比對目標抗生素回收率的影響，建立QuEChERS結合高效液相色譜-串聯(lián)質譜同時測定水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境沉積物中磺胺類、喹諾酮類、大環(huán)內酯類抗生素殘留的分析方法，希望能為水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素的有效管理和控制提供系統(tǒng)的理論依據(jù)和技術支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TSQ Quantum Ultra高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀：美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源；AB204-E型、PL203型電子分析天平：德國Mettler Toledo公司產(chǎn)品；DT5-5型低速臺式離心機、GT16-3高速臺式離心機：北京時代北利離心機有限公司產(chǎn)品；MS3型旋渦混合器：德國IKA公司產(chǎn)品；KQ600DB超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；HSC-24B水浴氮吹儀：天津市恒奧科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；Milli-Q型超純水儀：美國Millipore公司產(chǎn)品；FD8-6 凍干機：金西盟(北京)儀器有限公司產(chǎn)品；0.22 μm尼龍微孔濾膜：天津市津騰實驗設備有限公司產(chǎn)品。

萘啶酸、噁喹酸、氟甲喹、磺胺吡啶、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲異噁唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺喹噁啉、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、鹽酸克林霉素、克拉霉素、替米考星、泰樂菌素酒石酸鹽標準品：純度均大于98%，德國Dr Ehrenstorfer公司產(chǎn)品；交沙霉素標準品：純度大于99%，歐洲藥典EPCRS產(chǎn)品；三乙酸竹桃霉素、阿奇霉素二水合物、紅霉素和羅紅霉素標準品(純度大于95%)，吉他霉素標準品(純度大于92%)：均為德國Dr Ehrenstorfer公司產(chǎn)品。上述標準品均用甲醇配制成100 mg/L的標準儲備液(稱取的標準品質量按純度修正過的質量)，再用甲醇配制成1 mg/L的26種抗生素標準混合液，將所配溶液于-20 ℃下避光保存。

甲醇、乙腈、甲酸：均為色譜純，美國Tidea公司產(chǎn)品；乙酸銨、磷酸、二水合磷酸二氫鉀、乙二胺四乙酸二鈉、氯化鈉：均為化學純，國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品；無水硫酸鎂、N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳黑(GCB)、C18：天津博納艾杰爾科技有限公司產(chǎn)品；超純水：由Milli-Q型超純水儀制備；磷酸鹽緩沖液：2.72 g KH2PO4·2H2O與0.13 mL H3PO4混合，用超純水定容至100 mL。

10個沉積物樣品采自漳州的水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)，包括泥質、泥沙、沙質3種類型，采樣深度0～20 cm，每個樣品約500 g。沉積物樣品經(jīng)凍干機干燥24 h后研磨，過80目篩，于4 ℃冰箱內保存。其中，沉積物樣品的含水率為14.1%～47.2%，有機質含量為0.45%～2.11%。

1.2 樣品前處理

稱取(2±0.02) g試樣于50 mL塑料離心管中，加入0.15 g Na2EDTA、20 mL乙腈-磷酸鹽緩沖液(1∶1，V/V)，渦旋1 min，超聲5 min，劇烈手搖2 min，再加入2 g NaCl繼續(xù)手搖1 min，以4 000 r/min離心5 min；移取7～8 mL上清液于15 mL含0.25 g MgSO4、0.05 g C18、0.12 g PSA、0.01 g GCB的離心管中，渦旋1 min，手搖1 min，以3 000 r/min離心3 min，移取5 mL上清液，50 ℃氮吹至干。加入0.5 mL乙腈-水溶液(2∶8，V/V)，超聲溶解，過0.22 μm濾膜后，供高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定。

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件 Ultimate XB-C18色譜柱(2.1 mm×150 mm×5 μm)；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；進樣量20 μL；流動相：A為4 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸甲醇溶液；洗脫程序：0～5 min(10%～90%B)，5～9 min(90%～100%B)，9～10 min(100%～10%B)，10～15 min(10%B)。

1.3.2質譜條件 電噴霧離子源，正離子檢測模式，霧化室加熱溫度220 ℃，噴霧電壓3 500 V，鞘氣壓力367 kPa，輔助氣流量5 mL/min，離子傳輸毛細管溫度320 ℃，多反應監(jiān)測模式(MRM)。母離子、子離子和碰撞能量列于表1。Q1半峰寬0.7 u，Q3半峰寬0.7 u，碰撞氣(氬氣)壓力0.2 Pa。標準品多反應監(jiān)測離子流色譜圖示于圖1。

表1 多反應監(jiān)測母離子、子離子和碰撞能量Table 1 Parent ions, daughter ions and collision energy of MRM

注：*為定量碎片離子

圖1 標準品多反應監(jiān)測離子流色譜圖(20 μg/L)Fig.1 MRM chromatograms of mixed standard solutions (20 μg/L)

2 結果與討論

2.1 提取條件的優(yōu)化

大多數(shù)的QuEChERS采用乙腈、弱酸性緩沖液作為提取溶劑，實驗在參考AOAC(Association of Official Analytical Chemists)2007.01官方QuEChERS和美國 EPA 推薦方法的基礎上，考察了1%乙酸-乙腈溶液、McIlvaine緩沖液(pH 4.0)-乙腈和0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 3.0)-乙腈的提取效果。結果表明：0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 3.0)-乙腈的提取效率最高，可同時提取3種類型的目標抗生素，且平均回收率在67.2%～112%之間，示于圖2。由于抗生素與沉積物結合較緊密，單純的渦旋方式無法有效提取沉積物中的抗生素。因此，本實驗采用超聲波輔助提取法[23]，利用超聲波的空化、機械及熱效應等來增強提取溶液分子的運動速度及穿透力，從而提高目標抗生素的提取效率。實驗考察了1、2、5、7 min超聲提取時間對目標抗生素的提取效果。結果表明，隨著超聲提取時間的延長，目標抗生素提取效率隨之增大。當超聲時間增至5 min時，目標抗生素的平均回收率趨于穩(wěn)定；當超聲時間延長至7 min時，目標抗生素的回收率無明顯變化。為了保證提取效率，同時減少雜質干擾，最終選擇5 min作為超聲提取時間。另外，實驗中還加入了NaCl，有助于分離提取液的乙腈層和水層。

2.2 凈化條件的優(yōu)化

沉積物樣品中存在脂肪、色素、甾醇等雜質，要達到既能有效除去沉積物中雜質，又不會吸附目標物的目的，關鍵是吸附劑的選擇。常見的QuEChERS吸附材料有MgSO4、PSA、C18、GCB等。作為傳統(tǒng)的干燥劑，MgSO4用于去除有機溶劑殘留的水，吸水放熱過程可促進目標物的溶出[24]，且無水 MgSO4粒度較小，在振搖和渦旋過程中與樣品的混合更加充分，并能與乙腈發(fā)生協(xié)同作用從而提高提取效率。PSA含有2個氨基，可有效吸附糖類、色素、脂肪酸和其他極性有機酸[25-27]，且PSA屬于正相吸附劑，樣品含水量越少凈化效果越好，因此必須協(xié)調無水 MgSO4用量才能發(fā)揮較好的凈化效果。C18含有十八烷基官能團，屬于非極性吸附劑，可以吸附脂肪和一些礦物質[28]。GCB保留特殊的層狀結構，能夠吸附色素、甾醇等雜質[29]，但GCB容易吸附平面結構化合物，因此必須嚴控其用量。為了選擇合適的吸附劑，實驗考察了MgSO4(1.00、0.75、0.50、0.25 g)，PSA(0.20、0.15、0.12、0.10 g)，C18(0.15、0.10、0.05、0 g)，GCB(0.04、0.02、0.01、0 g)4 種吸附劑的不同用量對目標抗生素回收率的影響，結果分別示于圖3。實驗還考察了單種吸附劑和多種吸附劑共同凈化下，目標抗生素回收率的變化，結果示于圖4。

圖2 不同提取溶劑對抗生素回收率的影響(n=3)Fig.2 Effects of the different extraction solvents on the recoveries of antibiotics (n=3)

實驗結果表明：添加濃度為25 μg/kg水平時，采用單種吸附劑MgSO4、PSA、C18、GCB的凈化效果不佳，因此選用MgSO4、PSA、C18、GCB混合吸附劑凈化。隨著PSA和C18用量的增加，回收率先升高后降低；隨著MgSO4用量的增加，回收率急劇降低；在保證回收率(60%～120%)的基礎上，加入少量GCB可有效去除提取液中的色素。綜合考慮凈化效果和方法回收率，最終確定0.25 g MgSO4、0.12 g PSA、0.05 g C18、0.01 g GCB作為混合凈化吸附劑。

2.3 基質效應

應用液相色譜-質譜測定復雜基質樣品時，基質共提物對目標物的離子化具有基質增強或基質抑制效應，從而影響目標物的定量測定?；|效應(matrix effects, ME)計算公式示于式(1)：

ME=(Sm-Sx)/Sx×100%

(1)

式中，Sm和Sx分別表示基質標準溶液曲線和溶劑標準溶液曲線的斜率。當ME<-50%或ME>50%，表示存在較強的基質抑制或增強效應；當-50%≤ME<-20%或50%≥ME>20%，表示存在中等的基質抑制或增強效應；當-20%≤ME≤20%，表示存在較弱的基質抑制或增強效應。

在最佳提取凈化條件下，有13種目標物存在中等強度的基質效應，另外13種目標物存在較弱的基質效應，結果示于圖5。這說明本實驗優(yōu)化的QuEChERS方法可有效消除沉積物中復雜的基質干擾物。

2.4 標準曲線、線性范圍和定量限

為了消除基質效應帶來的定量偏差[30]，采用基質匹配標準曲線法定量。移取適量的混合標準溶液，用空白沉積物樣品提取液分別配制成不同質量濃度的基質標準溶液，目標物濃度分別為1.0、2.5、5.0、10、50、100、200 μg/L。以各組分濃度與其色譜峰面積進行線性回歸，結果呈良好的線性關系，相關系數(shù)均大于0.99。以10倍信噪比(S/N)計算定量限(limit of quantitation, LOQ)，具體數(shù)值列于表2。

2.5 方法準確度和精密度

以實際采集的養(yǎng)殖區(qū)泥質為研究對象進行標準添加實驗，分別以低、中、高3個添加水平進行加標回收實驗，每個濃度水平做6次平行實驗，考察方法的準確度及精密度。結果表明：平均回收率在60.4%～113%，相對標準偏差為1.5%～13.6%。30天內，在25 μg/kg加標濃度下進行6次標準添加實驗，考察方法的日間精密度，相對標準偏差為3.8%～11.5%，結果列于表2。該方法的精密度和準確度均能滿足藥物殘留檢測的需求。

注：a.PSA；b.C18；c.MgSO4；d.GCB圖3 不同吸附劑加入量對抗生素回收率的影響(n=3)Fig.3 Effects of different mass of adsorbent on average recoveries of antibiotics (n=3)

圖4 單種凈化吸附劑與混合凈化吸附劑的回收率對比(n=3)Fig.4 Comparison of recoveries of single purification adsorbent and mixed purification adsorbent (n=3)

圖5 優(yōu)化的凈化條件下，抗生素的基質效應Fig.5 Matrix effects of antibiotics under optimum purification conditions

以泥質、泥沙、沙質3種類型的沉積物為研究對象，在25 μg/kg加標濃度下考察方法的適用性，回收率為63.2%～111%，相對標準偏差為4.5%～11.7%，結果列于表3。

2.6 實際樣品測定

采用本研究建立的方法對某養(yǎng)殖區(qū)的20個養(yǎng)殖池塘沉積物進行檢測，結果列于表4。結果表明，所有沉積物樣品中均能檢出一定量的抗生素藥物。其中，磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺嘧啶、紅霉素、羅紅霉素、克拉霉素均有檢出，磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑的檢出率較高，這與文獻[1-5]的結果一致。磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑作為準用獸藥，其使用頻次較高、使用量也較大；它們可強吸附于沉積物上，難以降解，能夠長時間穩(wěn)定殘留在沉積物基質中。

表2 線性方程、相關系數(shù)、定量限、平均回收率和日間精密度Table 2 Linear equations, correlation coefficents (R2), LODs, average recoveries and inter-day precisions

表3 不同類型沉積物樣品的加標回收率的精密度(n=5)Table 3 Recoveries and precisions of different types of samples (n=5)

續(xù)表3

表4 水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)沉積物樣品中抗生素殘留量Table 4 Residue of antibiotics in sediment samples from the aquaculture area

注：ND表示未檢出或低于定量限

3 結論

通過優(yōu)化QuEChERS方法的提取溶劑、提取方式、提取時間和凈化材料，實現(xiàn)了基于高效液相色譜-串聯(lián)質譜法高通量快速定性定量分析水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境沉積物中典型抗生素殘留。該方法簡單、快速，精密度、準確度和定量限均能滿足沉積物中獸藥殘留的分析要求。同時可為養(yǎng)殖環(huán)境中藥物的快速篩查平臺奠定基礎，為解決水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)生態(tài)防控、治理提供技術支持，有利于促進生態(tài)養(yǎng)殖、無公害養(yǎng)殖的持續(xù)發(fā)展。