膜芯片技術(shù)對(duì)牛、羊、牦牛、驢肉源食品的摻偽鑒別

任易婕 霍勝楠 翟清燕 孫瀟慧 劉菲 李文靜

摘 要：采用膜芯片技術(shù)，通過對(duì)牛、羊、驢、牦牛、雞、鴨、兔、貂、狐、鼠、豬11 種目標(biāo)物種的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)牛、羊、驢、牦牛物種的摻偽鑒別。結(jié)果表明：該方法具有良好的特異性和適用性，檢測(cè)靈敏度和摻偽靈敏度均可達(dá)到0.1%，能快速、準(zhǔn)確地同時(shí)鑒別牛、羊、驢、牦牛、雞、鴨、兔、貂、狐、鼠、豬11 種動(dòng)物源性成分，可滿足肉類食品樣品中對(duì)牛、羊、牦牛、驢等摻偽鑒別的檢驗(yàn)需求。

關(guān)鍵詞：膜芯片技術(shù);高通量;動(dòng)物源性成分;肉類;摻偽鑒別

Abstract： A membrane chip technology to detect 11 target animal species including cattle， sheep， donkey， yak， chicken， duck， rabbit， mink， fox， mouse and pig was developed in order to identify adulteration in beef， mutton， donkey and yak meat products. Our experimental results showed that the method had good specificity and applicability. The method sensitivity and its sensitivity in detecting adulterated meat samples were both up to 0.1%. This method could quickly and accurately identify 11 animal origin components of cattle， sheep， donkey， yak， chicken， duck， rabbit， mink， fox， mouse and pig， and could meet the requirements for the identification of adulteration in beef， mutton， yak and donkey meat samples.

Keywords： membrane chip technology; high throughput; animal-derived constituents; meat; adulteration identification

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190417-081

中圖分類號(hào)：TS251.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2019）06-0033-06

引文格式：

任易婕， 霍勝楠， 翟清燕， 等. 膜芯片技術(shù)對(duì)牛、羊、牦牛、驢肉源食品的摻偽鑒別[J]. 肉類研究， 2019， 33（6）： 33-38. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190417-081.? ? http：//www.rlyj.net.cnREN Yijie， HUO Shengnan， ZHAI Qingyan， et al. Application of membrane chip technology in the identification of adulteration in beef， sheep， yak and donkey meat[J]. Meat Research， 2019， 33（6）： 33-38. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190417-081.? ? http：//www.rlyj.net.cn

近年來(lái)，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展日益迅速，我國(guó)食品產(chǎn)業(yè)也進(jìn)入飛速發(fā)展的黃金時(shí)期，民眾對(duì)于多種肉類的需求也逐漸上升。然而食品安全問題層出不窮，給整個(gè)食品行業(yè)和廣大消費(fèi)者造成很大的影響。驢肉因口感好、脂肪含量低、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)，受到越來(lái)越多消費(fèi)者的青睞[1]，但其產(chǎn)量低、價(jià)格高，時(shí)有摻假情況發(fā)生[2-3]。牦牛是一種產(chǎn)自西部地區(qū)的特色畜類動(dòng)物，牦牛肉氨基酸比例均衡，脂肪含量很低，可作為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的肉質(zhì)來(lái)源[4]，但其市售價(jià)格遠(yuǎn)高于其他肉制品，摻偽現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生[5-6]。常見的市售加工牛肉、羊肉，如羊肉串、肉干、肉丸等，也常有被摻假的可能性，甚至被不法商販摻入低價(jià)的豬肉、雞肉、鴨肉甚至狐貍?cè)鈁7-8]。有文獻(xiàn)報(bào)道指出，在抽檢的預(yù)包裝與散裝牛肉制品中，分別有2 批次和5 批次檢出非牛源性成分[9]。北京地區(qū)對(duì)牛羊肉進(jìn)行篩查后，發(fā)現(xiàn)其存在摻入鴨肉、雞肉、豬肉的比例高達(dá)34.9%[10]。驢肉、牦牛肉、牛肉、羊肉的摻偽時(shí)有報(bào)道，因此，對(duì)上述肉制品進(jìn)行摻偽鑒別成為廣大民眾與食品檢測(cè)的需求。但在對(duì)肉制品進(jìn)行動(dòng)物源性成分篩查時(shí)，同一份樣品往往需要同時(shí)開展多種可疑摻假動(dòng)物源性成分的檢測(cè)，工作量較大，對(duì)于大批量的肉制品篩查需要花費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間及較多的人力物力。此外，對(duì)于某些由多種肉制品加工而成的肉制品來(lái)說，單重鑒別方法顯得效率低下。因此，建立一種高通量的針對(duì)多種動(dòng)物源性成分的檢測(cè)方法迫在眉睫。

目前，動(dòng)物源性成分檢測(cè)技術(shù)有很多，包括基于代謝組學(xué)的檢測(cè)方法、基于蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法和基于核酸的檢測(cè)方法等[11-12]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)由于其靈敏度高、特異性好，且引物探針設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，成為目前應(yīng)用度最高的動(dòng)物源性成分檢測(cè)技術(shù)[13-15]。PCR方法包括普通PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)和數(shù)字PCR技術(shù)等[16-17]。目前在PCR技術(shù)中，熒光PCR方法應(yīng)用最為廣泛[14，18-20]，也是很多動(dòng)物源性成分檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中的常用方法。盡管傳統(tǒng)的動(dòng)物源性成分分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)具有很多優(yōu)點(diǎn)，但在樣本量大、高效、快速的檢驗(yàn)要求下，不能很好地滿足檢驗(yàn)需求。且現(xiàn)有分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)室儀器、環(huán)境條件、人員技術(shù)等要求較高，因此僅適用于實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，不適用于大規(guī)模、高通量篩查工作的需求，無(wú)法滿足當(dāng)前食品安全監(jiān)督、監(jiān)管的要求。因此，需要建立新的方法來(lái)進(jìn)行動(dòng)物源性成分的高通量、多指標(biāo)檢測(cè)。

膜芯片檢測(cè)方法是核酸雜交技術(shù)發(fā)展的產(chǎn)物，該方法利用反向斑點(diǎn)雜交原理，將一組寡核苷酸探針順序排列于支持膜表面，形成一系列低密度膜芯片探針陣列。利用多重PCR技術(shù)將待檢測(cè)目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過變性后形成的單鏈DNA與膜芯片上的探針雜交，經(jīng)底物顯色形成可視化的檢測(cè)結(jié)果。1992年，膜芯片技術(shù)被Fiss等[21]用來(lái)檢測(cè)分枝桿菌，隨后被應(yīng)用到食品微生物檢測(cè)[22-23]、轉(zhuǎn)基因篩查[24-26]、動(dòng)物醫(yī)學(xué)[27-28]及生物科學(xué)[29-30]等眾多領(lǐng)域。由于可視化芯片一般將多個(gè)靶位點(diǎn)同時(shí)固定在芯片上，因此可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目的基因。與傳統(tǒng)PCR方法相比，膜芯片檢測(cè)方法具有檢測(cè)通量高、檢測(cè)周期短、成本低廉、結(jié)果可靠等技術(shù)優(yōu)勢(shì)，可作為一種高通量動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法加以利用。本研究設(shè)計(jì)了一種膜芯片方法，可快速鑒別驢肉、牦牛肉、牛肉、羊肉中是否有雞、鴨、兔、貂、狐、鼠、豬等肉源成分的摻偽，為肉源性成分檢測(cè)提供了良好思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從濟(jì)南市場(chǎng)及購(gòu)物網(wǎng)站購(gòu)買各種肉類樣本，包括牛、羊、驢、雞、鴨、豬等生鮮樣本及各種加工肉制品（牛肉干2 份、牦牛肉干1 份、醬驢肉2 份、羊肉串1 份）。牦牛、兔、貂、狐、鼠、貉、馬、水牛、狗、魚等材料為本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存樣本。

肉及肉制品核酸提取試劑盒為德國(guó)凱杰公司產(chǎn)品;其余化學(xué)試劑為生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AB proFlex PCR儀 美國(guó)Thermo公司;5424R小型冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;NanoDrop 2000紫外-可見分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific有限公司;QuantStudio7 Flex實(shí)時(shí)熒光PCR儀 美國(guó)ABI公司;HL-2000紫外交聯(lián)儀 美國(guó)思博明科學(xué)器材公司。

1.3 方法

1.3.1 引物和探針設(shè)計(jì)利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)11 種動(dòng)物源性成分及內(nèi)參18S rRNA引物，同時(shí)設(shè)計(jì)可通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與DNA產(chǎn)物結(jié)合的特異性探針。反向引物的5末端用生物素Biotin修飾，引物可擴(kuò)增出長(zhǎng)度為100～200 bp的帶有生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物。探針5端連接有6 個(gè)碳原子作為連接臂的氨基修飾，用來(lái)將探針固定在膜芯片上。同時(shí)設(shè)計(jì)對(duì)照探針PC及NC，用來(lái)監(jiān)測(cè)雜交過程是否正常。設(shè)計(jì)5端用生物素修飾、可與PC探針互補(bǔ)的陽(yáng)性寡核苷酸單鏈（CPC），用于質(zhì)控膜芯片雜交過程。11 種動(dòng)物源性成分及內(nèi)參的引物探針序列如表1所示。

1.3.2 樣品制備

取100 g肉源樣本，經(jīng)四分法縮分后，進(jìn)行冷凍研磨，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 DNA提取及濃度測(cè)定

取50 mg研磨后的樣本，加入1.5 mL離心管中，參照試劑盒方法進(jìn)行DNA提取。

1.3.4 多重PCR擴(kuò)增及變性

參照普通PCR反應(yīng)體系，加入11 種引物，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。多重PCR反應(yīng)體系中，體系總體積為50 μL，各物質(zhì)的終濃度分別為：MgCl2 1.5 mmol/L，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和dUTP均為0.2 mmol/L，UNG酶1 U/50 μL，Taq酶2 U/50 μL，每條引物終濃度0.2 μmol/L。分別用來(lái)自11 種動(dòng)物的基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照，用不含這11 種動(dòng)物成分的DNA為陰性對(duì)照，水為空白對(duì)照，作為PCR擴(kuò)增系統(tǒng)和膜芯片雜交反應(yīng)的質(zhì)量控制。PCR反應(yīng)參數(shù)：37 ℃、10 min，1 個(gè)循環(huán);95 ℃、10 min，95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35 個(gè)循環(huán);72 ℃、10 min，1 個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物變性：將多重PCR產(chǎn)物進(jìn)行退火變性，以保持單鏈狀態(tài)。變性過程為95 ℃、5 min，4 ℃、10 min。退火后單鏈狀態(tài)的DNA需立即置于低溫狀態(tài)下。

1.3.5 膜芯片檢測(cè)

1.3.5.1 11 種動(dòng)物源性成分的膜芯片設(shè)計(jì)

將正方形尼龍薄膜分成16 個(gè)小區(qū)域，將探針根據(jù)圖1中的表面設(shè)計(jì)固定在不同區(qū)域。可根據(jù)不同點(diǎn)陣的顯色情況判斷是否有該物種源性成分檢出。

1.3.5.2 膜芯片手動(dòng)雜交過程

手動(dòng)雜交主要包括去活化、雜交、酶聯(lián)、顯色和讀取結(jié)果等幾個(gè)主要步驟：去活化是將沒有固定在膜上的探針的活性基團(tuán)封閉，從而增加膜芯片的特異性;雜交過程是通過已固定在膜上的探針將待測(cè)PCR產(chǎn)物中的目的基因片段捕獲;酶聯(lián)中使用的標(biāo)記是堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素，而PCR產(chǎn)物中目的基因片段帶有生物素標(biāo)記，如果PCR產(chǎn)物含有目的片段，通過生物素與鏈霉親和素的作用可以將堿性磷酸酶連接到膜上;顯色是通過酶與對(duì)應(yīng)底物發(fā)生的變色反應(yīng)來(lái)指示膜上是否有堿性磷酸酶，從而間接指示待測(cè)PCR產(chǎn)物中是否含有目的基因片段，從而判定樣品中是否含有目標(biāo)動(dòng)物源成分[21-23]。

將膜芯片置于雜交盒內(nèi)，按表2進(jìn)行手動(dòng)雜交。雜交過程在紫外交聯(lián)儀中進(jìn)行，可采用同等實(shí)驗(yàn)效果的儀器。

由圖2可知，牛、羊、驢、牦牛、雞、鴨、兔、豬、貂、狐、鼠在探針?biāo)谖恢糜刑禺愋噪s交斑點(diǎn)，內(nèi)參和陽(yáng)性對(duì)照位置雜交斑點(diǎn)顯色正常，陰性對(duì)照及其他位置無(wú)雜交顯色斑點(diǎn)。a～f分別表示貉、馬、水牛、狗、魚、貓?zhí)禺愋詸z測(cè)結(jié)果。

由圖3可知，芯片上貉、馬、水牛、狗、魚、貓物種沒有異常雜交點(diǎn)顯示，且各種對(duì)照位置均顯色正常，無(wú)其他物種的雜交顯色斑點(diǎn)。結(jié)果表明，該膜芯片對(duì)牛、羊、驢、牦牛、雞、鴨、兔、豬、貂、狐、鼠11 種物種具有良好的特異性，膜芯片上不具有的物種無(wú)特異雜交斑點(diǎn)產(chǎn)生。

2.2 11 種肉源成分檢測(cè)靈敏度實(shí)驗(yàn)

本研究以牛、羊、牦牛、驢為例，驗(yàn)證該膜芯片方法的靈敏度。將提取的牛、羊、牦牛、驢的DNA與雞、鴨混合DNA充分混勻，分別制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.0%、1.0%和0.1%的混合模板。按照方法中的操作，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增及雜交實(shí)驗(yàn)。

由圖4可知，在5.0%、1.0%和0.1%的混合比例下，牛、羊、牦牛和驢與雞、鴨的混合DNA在膜芯片上均有顯色反應(yīng)，各對(duì)照位置均顯色正常，在雞、鴨的顯色位點(diǎn)上有雜交顯色斑點(diǎn)，說明在質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.0%、1.0%和0.1%條件下，該方法可檢出牛、羊、牦牛、驢成分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法對(duì)牛、羊、牦牛、驢成分具有良好的檢測(cè)靈敏度，其檢測(cè)下限可達(dá)到0.1%。a～d分別表示牛、羊、驢、牦牛成分的靈敏度檢測(cè)結(jié)果;下腳標(biāo)1～3. 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.0%、1.0%和0.1%的混合模板。摻偽比例為0.1%;a～e分別表示摻入兔、豬、貂、狐、鼠成分的靈敏度檢測(cè)結(jié)果。

此外，進(jìn)行摻偽物種靈敏度檢測(cè)。分別將兔、豬、貂、狐、鼠DNA與雞、鴨混合DNA充分混勻進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)。由圖5可知，在0.1%摻偽比例下，兔、豬、貂、狐、鼠成分在膜芯片上均有顯色反應(yīng)，各對(duì)照位置均顯色正常，在雞、鴨的顯色位點(diǎn)上有雜交顯色斑點(diǎn)，說明在質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.0%、1.0%和0.1%條件下，該方法可檢出兔、豬、貂、狐、鼠成分，表明該方法具有良好的摻偽檢測(cè)靈敏度，方法檢出限可達(dá)0.1%。

2.3 牛、羊、牦牛、驢成分檢測(cè)適用性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為檢驗(yàn)?zāi)ば酒ǖ膶?shí)際應(yīng)用效果，從市場(chǎng)上購(gòu)買6 份加工肉制品樣品，包括牛肉干2 份、牦牛肉干1 份、驢肉2 份及羊肉串1 份。各待測(cè)樣品按照實(shí)驗(yàn)方法中所述進(jìn)行PCR擴(kuò)增和芯片雜交實(shí)驗(yàn)，每種樣品重復(fù)測(cè)定2 次，同時(shí)進(jìn)行熒光方法驗(yàn)證。豬、牛、羊靶點(diǎn)檢測(cè)采用SN/T 2051—2008《食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)PCR法》中的熒光方法進(jìn)行驗(yàn)證;驢靶點(diǎn)檢測(cè)采用SN/T 3730.4—2013《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第4部分：驢成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR法》進(jìn)行驗(yàn)證，馬靶點(diǎn)檢測(cè)采用N/T 3730.5—2013《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第5部分：馬成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR》進(jìn)行驗(yàn)證，牦牛成分檢測(cè)采用SN/T 4397—2015《出口食品中牦牛源性成分的檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》進(jìn)行驗(yàn)證。

由表3可知，芯片顯色結(jié)果為各質(zhì)控對(duì)照檢測(cè)結(jié)果正常，6 份市售樣品中有2 份樣品與標(biāo)簽不一致，其中牦牛肉干未檢出牦牛源性成分，但檢出豬成分，一份驢肉樣品未檢出驢源性成分，但檢出馬源性成分，剩余4 份樣品與產(chǎn)品配料表中標(biāo)注成分一致。通過熒光驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，6 份市場(chǎng)樣品膜芯片法檢測(cè)結(jié)果與熒光驗(yàn)證結(jié)果一致，表明該方法對(duì)于牛、羊、牦牛、驢源性成分的檢測(cè)具有良好的適用性，可用于包含上述4 種肉源成分的各種肉質(zhì)樣品檢測(cè)。

3 結(jié) 論

本研究設(shè)計(jì)了一種可以高通量鑒別11 種動(dòng)物源性成分的膜芯片方法，通過對(duì)目的肉源性成分進(jìn)行DNA提取、多重PCR擴(kuò)增并雜交后，對(duì)牛、羊、牦牛、驢源性成分進(jìn)行特異性、靈敏度與適用性驗(yàn)證。結(jié)果表明，該方法特異性良好，牛、羊、牦牛、驢源性成分的摻偽靈敏度可達(dá)到0.1%，且檢驗(yàn)結(jié)果與熒光PCR結(jié)果相一致，可快速檢測(cè)出牛、羊、牦牛、驢樣品中是否含有雞、鴨、兔、貂、狐、鼠、豬源性成分。生鮮肉和加工肉制品檢驗(yàn)結(jié)果與國(guó)標(biāo)方法相一致，可滿足適用性要求。與熒光PCR方法相比，其高通量、高效率的特點(diǎn)縮短了檢驗(yàn)所需時(shí)間與人力，能夠充分滿足市場(chǎng)監(jiān)管和日常檢驗(yàn)的需求。

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