早中期結(jié)直腸癌手術(shù)前后外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的監(jiān)測(cè)及預(yù)后分析

曹 霞，吳 偉，趙小玉，李 曾，韓亞兵，李 翔，田 姍，張 丹

（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部附屬三二〇一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，

2.胃腸外科，陜西漢中723000；

3.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)試驗(yàn)室，上海200433；

4.上海寶藤生物醫(yī)藥科技股份有限公司，上海201204）

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居全球第3、死亡率居全球第4位［1］。早中期結(jié)直腸癌以根治性手術(shù)治療為主，然而術(shù)后局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是早中期結(jié)直腸癌的主要死亡原因。文獻(xiàn)報(bào)道CEA、CA199可作為結(jié)直腸癌療效預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物，但敏感性及特異性均較低［2-3］。因此，發(fā)現(xiàn)早中期結(jié)直腸癌治療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)危險(xiǎn)因素并早期篩選出這部分高危復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移病人是目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）從腫瘤組織脫離進(jìn)入外周血液，部分腫瘤細(xì)胞的表型發(fā)生改變，出現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移性和侵襲性，在一定條件下發(fā)展成為轉(zhuǎn)移灶［4］。CTC可以從乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌及前列腺癌等多種上皮性惡性腫瘤患者的外周血中分離出來(lái)。CellSearch系統(tǒng)是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）唯一批準(zhǔn)用于臨床的CTC檢測(cè)平臺(tái)，主要通過(guò)帶有抗上皮細(xì)胞粘附分子（EpCAM）抗體的磁珠陽(yáng)性捕獲CTC，然后結(jié)合抗細(xì)胞角蛋白（CK）抗體識(shí)別CTC。但CTC形成及發(fā)展過(guò)程中會(huì)發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化或自身上皮特異性抗原表達(dá)缺失，引起腫瘤細(xì)胞表面EpCAM和CK的表達(dá)下調(diào)甚至缺失［5］。因此，基于EpCAM和CK表達(dá)的CellSearch系統(tǒng)在應(yīng)用上存在局限性。近年來(lái)新發(fā)展的SE-iFISH技術(shù)，利用抗白細(xì)胞標(biāo)記的抗體去除白細(xì)胞，采用檢測(cè)染色體倍數(shù)結(jié)合細(xì)胞表面腫瘤標(biāo)記物的方法判定CTC，富集和識(shí)別的過(guò)程中不受EpCAM和CK表達(dá)的影響，提高了檢出率［6-7］。本文通過(guò)一個(gè)前瞻性隊(duì)列研究，采用SE-iFISH檢測(cè)技術(shù)動(dòng)態(tài)檢測(cè)早中期結(jié)直腸癌患者手術(shù)前后的CTC，分析CTC與臨床特征的關(guān)系，評(píng)價(jià)CTC作為生物標(biāo)記物在早中期結(jié)直腸癌治療后的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集自2014年7月至2016年7月期間陜西省漢中市3201醫(yī)院腫瘤科收治的結(jié)直腸癌患者作為研究對(duì)象，符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者共67人，其中男性44例，女性23例，平均年齡（56.9±12.1）歲。收集同期20例健康志愿者，作為空白對(duì)照組，其中男性14例，女性6例，平均年齡（57.3±6.6）歲。本研究獲患者知情同意和醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施。

研究組納入標(biāo)準(zhǔn)為：①經(jīng)病理新確診的結(jié)直腸癌，不伴有腸梗阻、穿孔或出血等需要急診處理的患者；②根據(jù)2017版AJCC/UICC結(jié)直腸癌分期系統(tǒng)，分期為Ⅰ～Ⅲ期；③未接受過(guò)任何術(shù)前抗癌治療；④無(wú)其他惡性腫瘤史；⑤結(jié)直腸癌患者手術(shù)方式均按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行根治性切除術(shù)；⑥自愿參加研究并簽署知情同意書的患者。

研究組排除標(biāo)準(zhǔn)為：①不能按照標(biāo)準(zhǔn)接受結(jié)直腸癌標(biāo)準(zhǔn)根治術(shù)的患者，如病理提示切緣陽(yáng)性的患者；②有結(jié)直腸癌，行手術(shù)治療后復(fù)發(fā)，再次手術(shù)的患者；③既往或現(xiàn)在患有其他腫瘤性疾病的患者；④合并感染的患者；⑤依從性差，不能按期隨訪的患者。

1.2 樣本收集方法

67例患者分別在結(jié)直腸癌根治性手術(shù)前24 h和術(shù)后3個(gè)月，同時(shí)抽取外周血7.5 mL行CTC檢測(cè)，以及外周血4 mL行CEA、CA199檢測(cè)。同期抽取20例健康志愿者外周血7.5 mL行CTC檢測(cè)，以及外周血4 mL行CEA、CA199檢測(cè)。

1.3 循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)方法

1.3.1 CTC試劑盒及儀器 人外周血循環(huán)稀有細(xì)胞差相富集試劑盒（貨號(hào)SHE-003B），CK-iFISH人腫瘤細(xì)胞檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)FSH-002B）；TDL-5M型臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湘儀，最大離心力4390×g），S500-24型原位雜交儀（ThermoBrite），尼康Ni-U型熒光顯微鏡等。

1.3.2 CTC陰性分離富集 7.5 mL外周靜脈血采集到ACD抗凝血管中。去除血清：常溫800×g離心8 min，去除上層血清，保留下層血細(xì)胞。去除紅細(xì)胞：50 mL離心管中加入3 mL樣本密度分離液，在樣本密度分離液上層疊加血細(xì)胞，450×g離心8 min后，將含有白細(xì)胞和CTC的白膜層吸到新的50 mL離心管中。去除白細(xì)胞：在放有白細(xì)胞混液的離心管中加入處理好的200 μL磁珠，將離心管傾斜（約30℃）置于搖床上，130 r/min，搖動(dòng)20 min，450×g離心8 min，然后去除白細(xì)胞和磁珠混合物，吸取上清至新的15 mL離心管中，加入清洗液清洗后棄上清至50 μL。液染抗體：加入2 μL抗原修復(fù)液修復(fù)10 min后加入anti-CD45抗體、anti-PanCK抗體和抗體稀釋液的混合液室溫避光孵育20 min，650×g離心5 min，棄上清至100 μL。固定和涂片：混勻細(xì)胞沉淀后加入100 μL固定液混勻、涂片，過(guò)夜烘干玻片。

1.3.3 CTC免疫熒光原位雜交（iFISH）和分析烘干的玻片 經(jīng)過(guò)晾置、雜交洗液清洗和無(wú)水乙醇洗滌、脫水后，進(jìn)行CEP8（8號(hào)染色體著絲粒探針）雜交。雜交條件為76℃變性10 min，37℃雜交4 h。雜交結(jié)束清洗液清洗后滴加5 μL DAPI染液封片并于熒光顯微鏡下觀察。

1.3.4 CTC判斷標(biāo)準(zhǔn) 采用細(xì)胞角蛋白（CK）、白細(xì)胞分化抗原（CD45）、DNA強(qiáng)力結(jié)合熒光染料4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）及8號(hào)染色體著絲粒探針（CEP-8）共同識(shí)別結(jié)直腸癌患者血液中的CTC。因此CTC具體定義為：CK+/CD45-/DAPI+/CEP=2；CK+/CD45-/DAPI+/CEP8＞2；CK-/CD45-/DAPI+/CEP8＞2［8］。白細(xì)胞具體定義：CK-/CD45+/DAPI-/CEP8=2［9］（圖 1A）。

1.4 治療及隨訪

患者均采用開(kāi)腹結(jié)直腸癌根治術(shù)，根據(jù)中國(guó)臨床學(xué)會(huì)（CSCO）結(jié)直腸癌診療指南進(jìn)行術(shù)后輔助放化療。治療結(jié)束后患者每3個(gè)月行體格檢查、肝臟超聲、腫瘤標(biāo)志物等檢查；每6個(gè)月至1年行胸腹壁CT、結(jié)腸鏡和骨掃描檢查。通過(guò)電話詢問(wèn)和隨診的方式對(duì)所有患者進(jìn)行規(guī)律隨訪，并收集患者術(shù)后復(fù)查結(jié)果?；颊咚劳龌蛘呤гL作為隨訪終點(diǎn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)圖采用GraphPad Prism 7.0軟件繪制?；颊咂骄挲g采用X±S表示，CTC陽(yáng)性率的比較采用卡方檢驗(yàn)。使用受試者工作特征（ROC）曲線判定CTC診斷結(jié)直腸癌的臨界值并計(jì)算該方法的靈敏度、特異度。CTC的數(shù)值采用中位數(shù)/四分位數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，并采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本研究的主要觀察終點(diǎn)為無(wú)病生存時(shí)間（disease free survival，DFS）和總生存時(shí)間（overall survival，OS）。DFS自根治性手術(shù)日期開(kāi)始至疾病復(fù)發(fā)或由于疾病進(jìn)展導(dǎo)致患者死亡等任一個(gè)首次出現(xiàn)的時(shí)間或最后隨訪日期。OS自根治性手術(shù)開(kāi)始計(jì)算至患者出現(xiàn)死亡或最后隨訪日期。采用Kaplan-Meier法計(jì)算生存率，并用Log-rank法比較各組的生存差異。通過(guò)單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析臨床病理參數(shù)及各組CTC數(shù)與DFS和OS的預(yù)測(cè)價(jià)值；對(duì)于單因素分析有意義的參數(shù)（P＜0.05）進(jìn)一步納入多因素Cox回歸分析。雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)前患者CTC及健康組CTC的鑒定

手術(shù)前67例結(jié)直腸癌患者中有61例患者檢出CTC，共253個(gè)單個(gè)CTC。其中232個(gè)CTC的特點(diǎn)是CK-/CD45-/DAPI+/CEP8＞2（圖1B ～ D）；21個(gè)CTC的特點(diǎn)CK+/CD45-/DAPI+/CEP8＞2（圖1E），分布在15個(gè)患者中。全組未發(fā)現(xiàn)CK+/CD45-/DAPI+/CEP8=2或者CK-/CD45-/DAPI+/CEP8=2的二倍體細(xì)胞。在253個(gè)CTC中，三倍體（CEP8=3）123個(gè)，分布在48例患者中（圖1B）；四倍體（CEP8=4）39個(gè)，分布在24例患者中（圖1C）；多倍體（CEP8≥5）占91個(gè)，分布在18例患者中（圖1D）。在20例健康對(duì)照組中只發(fā)現(xiàn)了1個(gè)CTC，其細(xì)胞特點(diǎn)：CK-/CD45-/DAPI+/CEP8=3。

圖1 SE-iFISH對(duì)術(shù)前患者CTC及健康組CTC的鑒定Fig.1 Identification of CTC in colorectal cancer using the SE-iFISH platform

2.2 結(jié)直腸癌術(shù)前CTC、CEA及CA199在結(jié)直腸癌診斷中的作用

術(shù)前患者CTC陽(yáng)性率（CTC≥1個(gè)/7.5 mL）為91.0%，健康組CTC陽(yáng)性率5.0%，兩組有顯著性差異（P＜0.01）。使用受試者工作特征（ROC）曲線判斷區(qū)分結(jié)直腸癌患者與健康對(duì)照組的臨界值。分別設(shè)定臨界值（cutoff value）為 1個(gè) CTC，2個(gè)CTC和3個(gè)CTC，AUC面積分別為0.950、0.866、0.761；約登指數(shù)分別為0.86、0.70、0.47；靈敏度分別為91.0%、69.8%和46.5%；特異度分別為95.3%、100%和100%。當(dāng)CTC=1個(gè)/7.5mL時(shí)，AUC面積和約登指數(shù)最大（AUC=0.950；Youden index=0.86）。所以將CTC=1個(gè)/7.5 mL定為結(jié)直腸癌的診斷臨界值，相應(yīng)的靈敏度為91.0%，特異度為95.3%，假陽(yáng)性率為4.7%，假陰性率為9.0%，準(zhǔn)確性92.0%（圖2A）。

術(shù)前CEA＞5 ng/mL的28例（41.8%）；術(shù)前CA-199＞37 U/mL的18例（26.7%）。將CEA的臨界值設(shè)定為5 ng/mL，CA-199為37 U/mL時(shí)，進(jìn)一步使用受試者工作特征曲線（ROC）分析，CEA和CA-199曲線下面積分別為0.63和0.63，其靈敏度分別為51.0%和49.0%，其特異度均為85.0%（圖2A）。進(jìn)一步分析CTC與CEA、CA-199之間的關(guān)系，CEA和CTC之間的相關(guān)性系數(shù)為-0.012（P=0.734），表明CEA和CTC是相對(duì)獨(dú)立的參數(shù)（圖2B）。CA-199與CTC的相關(guān)性系數(shù)-0.000 45（P=0.923），因此CA-199和CTC也是相對(duì)獨(dú)立的參數(shù)（圖2C）。

圖2 結(jié)直腸癌患者CTC與血清CEA和CA-199水平的關(guān)系Fig.2 Association of CTC number with serum CEA and CA-199 levels from colorectal cancer patients

2.3 結(jié)直腸癌CTC數(shù)值與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

術(shù)前CTC的陽(yáng)性率在Ⅰ期88.9%，Ⅱ期為89.2%，Ⅲ期為90.4%（P=0.592）；術(shù)前CTC中位值Ⅰ期3個(gè)（IQR 1，3），Ⅱ期為3個(gè)（IQR 1，4.5），Ⅲ期為2（IQR 1.5，4；P=0.529）。術(shù)后CTC的陽(yáng)性率Ⅰ期88.9%，Ⅱ期100%，Ⅲ期95.2%（P=0.102）；術(shù)后CTC中位值Ⅰ期2個(gè)（IQR 2，3.5），Ⅱ期為 2個(gè)（IQR 2，3），Ⅲ期為 3（IQR 2.5，4；P=0.138）。術(shù)后CTC數(shù)值與侵襲深度和腫瘤部位有關(guān)（P=0.001；P=0.044），與性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CEA水平以及CA-199水平?jīng)]有相關(guān)性。術(shù)前CTC數(shù)值與上述臨床病理參數(shù)均不相關(guān)（表1）。

表1 術(shù)前、術(shù)后CTC數(shù)值和臨床參數(shù)的相關(guān)性Table 1 Association of preoperative and postoperative CTC with clinicopathological parameters

2.4 結(jié)直腸癌CTC數(shù)值與DFS和OS的相關(guān)性研究

2.4.1 術(shù)前CTC數(shù)值不能預(yù)測(cè)無(wú)病生存期（DFS）和中位總生存期（OS） 全組病例均獲完整的隨訪資料，失訪0例，隨訪率100%。末次隨訪日2018年12月31日，隨訪時(shí)間53.0個(gè)月。隨訪期間出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移15例，局部復(fù)發(fā)5例，其中死亡13例（遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移10例，局部復(fù)發(fā)3例）。中位DFS為32.3個(gè)月（IQR 20.7～48.5），中位OS為43.9個(gè)月（IQR 33.0～49.00）。

使用ROC曲線分析CTC與無(wú)病生存期（DFS）和總生存期（OS）的關(guān)系。術(shù)前CTC對(duì)DFS和OS預(yù)測(cè)意義不大（AUC=0.359，P=0.068；AUC=0.428，P=0.423）；術(shù)后以CTC=3個(gè)/7.5 mL為臨界點(diǎn)對(duì)DFS和OS預(yù)測(cè)意義顯著，AUC值最大（AUC=0.936，P ＜ 0.001；AUC=0.863，P ＜ 0.001；圖3）。

圖3 ROC曲線分析CTC與無(wú)病生存期和總生存期的關(guān)系Fig.3 Prediction effect of CTC on disease free survival and overall survival by ROC curve

使用Kaplan-Meier和Log-rank方法進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)術(shù)前CTC各組數(shù)值與DFS和OS無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.155，P=0.729；圖4）。

圖4 術(shù)前CTC各組數(shù)值與無(wú)病生存期和總生存期的關(guān)系Fig.4 Relationship between preoperative CTC values and disease free survival and overall survival

2.4.2 術(shù)后CTC數(shù)值可以預(yù)測(cè)DFS和OS 術(shù)后CTC＜3的48例（71.6%），術(shù)后CTC≥ 3的19例（28.4%）。術(shù)后CTC＜3組的DFS和OS均較CTC≥3組顯著延長(zhǎng)（DFS：43.7月 vs 20.4月，P ＜ 0.001；OS：54.4月 vs 43.3月，P ＜0.001；圖5）。

圖5 術(shù)后CTC數(shù)值與無(wú)病生存期和總生存期的關(guān)系Fig.5 The relationship between postoperative CTC value and disease free survival and overall survival

術(shù)后CTC升高的25例（37.3%），持平或降低的42例（62.7%）。CTC持平或降低組的DFS和OS均較術(shù)后CTC增高組顯著延長(zhǎng)（DFS：48.7月vs 26.8月，P ＜ 0.001；OS：54.8月 vs 45.1月，P ＜ 0.001；圖6）。

圖6 手術(shù)前后CTC數(shù)值變化與無(wú)病生存期和總生存期的關(guān)系Fig.6 The relationship between CTC value before and after surgery and disease free survivaland overall survival

2.5 結(jié)直腸癌預(yù)后的單因素和多因素分析

利用單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型對(duì)性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CEA水平、CA199水平以及CTC數(shù)值進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)術(shù)后TNM分期、術(shù)后CEA＞5 ng/mL、術(shù)后CTC≥3個(gè)/7.5 mL、術(shù)后CTC數(shù)值增加與DFS不良預(yù)后有關(guān)。然后將上述4個(gè)變量納入多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)后CEA＞5 ng/mL和術(shù)后CTC≥3個(gè)/7.5 mL是早中期結(jié)直腸癌DFS不良預(yù)后的獨(dú)立判斷因素（表2）。其次術(shù)后TNM分期、淋巴結(jié)分期、術(shù)后CEA＞5 ng/mL、術(shù)后CTC≥3個(gè)/7.5 mL及術(shù)后CTC數(shù)值增加（與術(shù)前比較）與OS不良預(yù)后有關(guān)。然后將上述5個(gè)變量納入多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)臨床TNM分期、淋巴結(jié)分期及術(shù)后是早中期結(jié)直腸癌OS不良預(yù)后的獨(dú)立判斷因素（表2，3）。

表2 早中期結(jié)直腸癌單因素和多因素回歸分析賦值表Table 2 Univariate and multivariate Cox regression assignment table

表3 早中期結(jié)直腸癌無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期的單因素和多因素回歸分析Table 3 Univariate and multivariate Cox regression for disease free survival and overall survival

3 討論

隨著腫瘤醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展，結(jié)直腸癌的治療進(jìn)入全程精確管理模式。尤其對(duì)早中期結(jié)直腸癌患者，如何早期發(fā)現(xiàn)、有效治療以減少腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，同時(shí)避免不必要的治療以及相應(yīng)的副作用是目前臨床研究的重點(diǎn)。CTC檢測(cè)作為一種相對(duì)無(wú)創(chuàng)且可以重復(fù)進(jìn)行的液體活檢技術(shù)對(duì)結(jié)直腸癌的診斷具有潛在的應(yīng)用價(jià)值［10-11］。

外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的鑒定主要經(jīng)過(guò)CTC細(xì)胞的富集和識(shí)別兩個(gè)過(guò)程，但不同實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)并未完全統(tǒng)一。目前CellSearch系統(tǒng)是檢測(cè)CTC最常用的平臺(tái)，通過(guò)藕聯(lián)了抗EpCAM抗體的磁珠捕獲上皮細(xì)胞，使用CK（8、18、19）識(shí)別CTC。本研究使用廣譜細(xì)胞角蛋白抗體（pan-CK antibody）識(shí)別CK家族成員（CK4、5、6、8、10、13和18），但結(jié)果顯示CK陽(yáng)性的結(jié)直腸癌患者只有22.4%（15/67）。這一結(jié)果也在一定程度上證明循環(huán)腫瘤細(xì)胞EMT過(guò)程中CK的表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)甚至缺失。先前多項(xiàng)研究證明，CellSearch系統(tǒng)陽(yáng)性檢出率在4.9%～47.5%之間，不適合早期非轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的監(jiān)測(cè)［12-13］。

本研究采用的差減富集技術(shù)（subtraction enrichment technology，SET）可以有效去除紅細(xì)胞、白細(xì)胞，而最大程度的留取CTC用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。免疫熒光原位雜交技術(shù)（iFISH）是將免疫熒光染色方法與原位熒光雜交方法相整合。在本研究中使用CK、CD45、DAPI分析細(xì)胞表面蛋白表型的同時(shí)，使用CEP-8檢測(cè)染色體核型，共同識(shí)別CTC。多倍體是腫瘤細(xì)胞主要的染色體異常，細(xì)胞核不穩(wěn)定的表現(xiàn)，極易發(fā)生基因突變，驅(qū)動(dòng)癌癥的發(fā)展［14-15］。使用CEP8檢測(cè)CTC染色體數(shù)目的變化，根據(jù)染色體拷貝數(shù)的不同，CTC可以分為單倍體、二倍體、三倍體、四倍體和≥5倍體等不同亞型［16］。本組研究中有123個(gè)三倍體細(xì)胞（占48.6%）；39個(gè)四倍體細(xì)胞（占15.4%）；91個(gè)≥5倍體細(xì)胞（占36.0%）。由此我們可以認(rèn)為，iFISH與單純的免疫熒光染色方法或者單純?nèi)旧w的原位熒光雜交方法相比，其生物信息量更大。利用SE-iFISH可以檢測(cè)肺癌、肝癌、鼻咽癌及骨肉瘤等多種實(shí)體腫瘤的CTC，CTC的陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)結(jié)果在75%～100%［17-18］。本研究中的結(jié)直腸癌患者CTC陽(yáng)性率91.04%，與CEA和CA199相比，在早期結(jié)直腸癌檢測(cè)上具有更高的靈敏性與特異性，而且是相對(duì)獨(dú)立的血清標(biāo)志物，因此CTC有望成為早期結(jié)直腸癌篩查與診斷的有效指標(biāo)。

目前，結(jié)直腸癌患者CTC和臨床病理各參數(shù)之間的關(guān)系仍無(wú)統(tǒng)一認(rèn)識(shí)。Hinz等［19-20］采用CK20 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)分別對(duì)術(shù)前輔助放化療后的267例直腸癌和299例結(jié)腸癌進(jìn)行CTC檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌中CTC的檢出率與腫瘤分期、淋巴結(jié)分期、肝臟轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，但在直腸癌中卻沒(méi)有相關(guān)性。有趣的是，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)術(shù)前CTC計(jì)數(shù)與各臨床病理參數(shù)無(wú)顯著差異，但是術(shù)后結(jié)腸癌的CTC計(jì)數(shù)比直腸癌顯著升高，其次T3-T4的CTC計(jì)數(shù)比T1-T2顯著升高。這一結(jié)果可能與直腸癌和結(jié)腸癌在解剖、功能和胚胎起源方面存在差異，以及結(jié)腸癌與直腸癌的治療存在差異有關(guān)。

外周血CTC在晚期結(jié)直腸癌的預(yù)測(cè)作用已經(jīng)得到了肯定，但對(duì)于早中期結(jié)直腸癌，尤其是圍手術(shù)期的結(jié)直腸癌，是否同樣可以預(yù)測(cè)預(yù)后仍存在爭(zhēng)議。Rahbari等［21］雖然證明外周血CTC對(duì)早期結(jié)直腸癌的預(yù)后具有預(yù)測(cè)意義，但認(rèn)為在這項(xiàng)分析中只有2項(xiàng)研究是根據(jù)手術(shù)前后循環(huán)腫瘤細(xì)胞提供獨(dú)立預(yù)后數(shù)據(jù)，因此提出需要對(duì)同一患者群體的術(shù)前和術(shù)后樣本進(jìn)一步研究，以評(píng)估術(shù)后腫瘤細(xì)胞檢測(cè)是否為預(yù)測(cè)預(yù)后最準(zhǔn)確的指標(biāo)。在我們的研究中，分別在術(shù)前24 h和術(shù)后3月檢測(cè)CTC，發(fā)現(xiàn)術(shù)前CTC的預(yù)后預(yù)測(cè)意義較小，但術(shù)后CTC臨界值3個(gè)/7.5 mL對(duì)預(yù)后預(yù)測(cè)意義顯著。研究發(fā)現(xiàn)早中期結(jié)直腸癌術(shù)后分為良好預(yù)后組（術(shù)后CTC＜3或者術(shù)后CTC數(shù)目持平或減少）和不良預(yù)后組（術(shù)后CTC≥3或者術(shù)后CTC數(shù)目增加），良好預(yù)后組的DFS和OS均較不良預(yù)后組顯著延長(zhǎng)。多項(xiàng)研究表CTC可以反映結(jié)直腸癌患者的化療敏感性［22-23］，并與接受化療的結(jié)直腸癌患者的放射影像進(jìn)展相關(guān)［24］。但Chu等［25］研究提示CTC與結(jié)直腸癌新輔助化療療效無(wú)相關(guān)性。本研究中術(shù)后輔助放化療在術(shù)后一個(gè)月開(kāi)始，所以術(shù)后3個(gè)月的CTC值可能反應(yīng)輔助放化療的療效，有望成為判斷輔助放化療敏感性的指標(biāo)；其次術(shù)前與術(shù)后CTC預(yù)測(cè)意義不同，也可能與術(shù)后進(jìn)行了輔助放化療有關(guān)，但仍需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步研究。

影響早中期結(jié)直腸癌的預(yù)后有多種因素，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)術(shù)前CTC數(shù)值與預(yù)后不相關(guān)，但是術(shù)后CEA＞5 ng/mL和術(shù)后CTC≥3個(gè)/7.5 mL是PFS獨(dú)立不良預(yù)后因素，TNM分期、淋巴結(jié)分期及術(shù)后CTC≥3個(gè)/7.5 mL是OS獨(dú)立不良預(yù)后因素。這個(gè)結(jié)果與之前Yang等［26］在211例Ⅰ-Ⅲ期結(jié)直腸癌的發(fā)現(xiàn)類似，術(shù)后CTC陽(yáng)性是不良預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)，而術(shù)前CTC陽(yáng)性與預(yù)后無(wú)關(guān)；術(shù)后CTC陽(yáng)性的患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高于術(shù)前CTC陽(yáng)性的患者數(shù)量。因此術(shù)后進(jìn)行CTC檢測(cè)具有重要臨床意義，可以獨(dú)立預(yù)測(cè)早期結(jié)直腸癌的進(jìn)展和生存，從而確定治療方案；還可以在治療過(guò)程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)治療進(jìn)程和效果，對(duì)治療方案加以修正，為個(gè)體化治療提供有用參考。

綜上所述，本研究通過(guò)前瞻性隊(duì)列研究，利用SE-iFISH技術(shù)檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目，并證實(shí)SE-iFISH技術(shù)檢測(cè)早中期結(jié)直腸癌患者外周血的CTC具有高靈敏性與高特異性的優(yōu)勢(shì)。本研究還發(fā)現(xiàn)，術(shù)前CTC不能預(yù)測(cè)早中期結(jié)直腸癌的預(yù)后，但術(shù)后CTC可以獨(dú)立預(yù)測(cè)早中期結(jié)直腸癌的預(yù)后；其次動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)手術(shù)前后CTC的變化也可以預(yù)測(cè)早中期結(jié)直腸癌的預(yù)后。