紫萼玉簪HvGASA、HvFAD基因的克隆及表達(dá)分析

莊倩倩　 陳少鵬　 劉洪章

摘要：利用RACE技術(shù)、Genome Walking技術(shù)及PCR技術(shù)，從紫萼玉簪中克隆得到長(zhǎng)度分別為336、1 320 bp的GASA基因HvGASA和脂肪酸去飽和酶基因HvFAD的cDNA全長(zhǎng)序列，分別編碼111、399個(gè)氨基酸，其中HvFAD基因所編碼的蛋白為跨膜蛋白。qRT-PCR分析結(jié)果表明，2條基因隨自然地溫的降低均上調(diào)表達(dá)，而且在地溫降至3 ℃時(shí)發(fā)生劇烈的表達(dá)量變化，說(shuō)明HvGASA、HvFAD基因與紫萼玉簪的抗寒性具有密切關(guān)系。

關(guān)鍵詞：紫萼玉簪;HvGASA基因;HvFAD基因;基因克隆;基因表達(dá);抗寒性

中圖分類號(hào)： S682.1+90.1? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）04-0055-06

紫萼玉簪（Hosta ventricosa）又稱紫花玉簪、紫玉簪，為百合科玉簪屬多年生宿根草本植物，在我國(guó)主要分布于東北、華東、西南、廣西等地[1]，自然生長(zhǎng)于林下、溪邊。紫萼玉簪花紫色、無(wú)香味，葉卵圓形，有較高的觀賞價(jià)值，作為重要的觀賞植物被廣泛應(yīng)用于園林地被、花境及盆栽。玉簪屬其他植物觀賞性狀豐富，如具有白色花朵、花朵具有香氣等，但這些玉簪屬植物多數(shù)不耐寒，無(wú)法在東北地區(qū)自然越冬，這嚴(yán)重阻礙了玉簪屬植物在東北地區(qū)的應(yīng)用推廣，然而紫萼玉簪具有極耐寒的特性，是唯數(shù)不多的能夠在東北地區(qū)自然越冬的玉簪屬植物之一，故推測(cè)紫萼玉簪具有其他玉簪屬植物所不具備的抗寒相關(guān)基因及抗寒機(jī)理。本研究通過(guò)探究紫萼玉簪中與抗寒功能相關(guān)的基因，為今后摸清紫萼玉簪的抗寒機(jī)理及利用分子育種方法進(jìn)行抗寒玉簪新品種培育提供參考。

GASA（gibberellic acid-stimulated Arabidopsis）基因家族最早在擬南芥中發(fā)現(xiàn)[2]，后來(lái)在很多其他植物中發(fā)現(xiàn)了與其相似的蛋白，如水稻（Oryza sativa）OsGASR1基因和OsGASR2基因[3]、草莓（Fragaria ananassa）GAST1-like基因、矮牽牛（Petunia hybrida）GIP基因[4]等。GASA編碼基因數(shù)量眾多，大多數(shù)成員受赤霉素（GA）調(diào)控[5]。GASA蛋白又稱Snakin蛋白，是一類CRP（cysteine-rich peptides）蛋白。CRP蛋白是植物中富含半胱氨酸的小分子多肽，其在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境反應(yīng)中具有重要的作用[6]。GASA蛋白中富含半胱氨酸，半胱氨酸是形成二硫鍵所必需的，而二硫鍵的形成對(duì)維持蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的穩(wěn)定具有非常重要的作用。GASA蛋白在低溫、高鹽等非生物脅迫應(yīng)答中具有重要作用，此外也參與多項(xiàng)生長(zhǎng)發(fā)育活動(dòng)，如種子萌發(fā)、根的形成、莖的生長(zhǎng)、花和果實(shí)發(fā)育及蟲害、病菌等生物脅迫，在激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程中亦發(fā)揮重要的調(diào)控作用[7]。

脂肪酸去飽和酶（fatty acid desaturase，F(xiàn)AD）是不飽和脂肪酸合成途徑中重要的酶物質(zhì)，F(xiàn)AD基因是油酸合成的關(guān)鍵酶基因。當(dāng)植物處于低溫環(huán)境時(shí)，F(xiàn)AD通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪酸不飽和度來(lái)調(diào)節(jié)膜的流動(dòng)性[8]，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)不受破壞，從而達(dá)到提高植物抗寒性的作用。目前FAD基因在許多植物中被發(fā)現(xiàn)及研究，其中有關(guān)抗寒性研究的植物種類也很多，包括馬齒莧、棉花、橄欖、白蕓豆、馬鈴薯等[9]。此外，不飽和脂肪酸與植物的抗旱[10]、耐鹽[11]、抗重金屬、抗病、細(xì)胞識(shí)別以及組織免疫等方面也密切相關(guān)[12-13]。

1 材料與方法

1.1 材料采集與處理

從2015年9月15日至11月24日，隨著長(zhǎng)春地區(qū)由秋季轉(zhuǎn)入冬季，氣溫及地溫逐漸降低，每隔7 d于當(dāng)日07：00進(jìn)行采樣，每次采集的樣品依次編號(hào)為A～K。每次采樣對(duì)校園內(nèi)同地點(diǎn)種植的紫萼玉簪根系進(jìn)行采集，并測(cè)定實(shí)時(shí)地溫（距離地表10 cm處），記錄當(dāng)天最高及最低氣溫，將根系泥土用去離子水沖洗干凈，吸干表面的水分，液氮速凍后置于 -80 ℃ 冰箱保存，具體采樣的氣候條件見表1。

1.2 DNA提取、總RNA提取、完整性檢驗(yàn)及反轉(zhuǎn)錄cDNA

紫萼玉簪根系總DNA提取采用改良CTAB法[14]，總RNA提取使用RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA、RNA的完整性、降解程度及是否存在污染，采用超微量紫外光分光光度計(jì)測(cè)定二者濃度。采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒（TaKaRa公司）將提取的紫萼玉簪根系RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA，制備好的cDNA置于-20 ℃冰箱保存。

1.3 HvGASA、HvFAD基因的克隆

筆者所在課題組前期進(jìn)行了紫萼玉簪轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作，建立了以抗寒性為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，測(cè)序材料為紫萼玉簪的根系。在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出2條功能注釋與GASA、FAD相關(guān)的差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG）進(jìn)行下一步分析，序列在測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中的ID分別為c18557.graph_c0、c60584.graph_c0。在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTp比對(duì)，發(fā)現(xiàn)c18557.graph_c0蛋白序列與石刁柏（Asparagus officinalis）的AoGASA基因（XP_02027448.1）及大蒜（Allium sativum）AsGASA基因（AEX55233.1）分別具有66%、59%的一致性，故命名為HvGASA基因;c60584.graph_c0蛋白序列與石刁柏的脂肪酸去飽和酶AoFAD（XP_0202441744.1）具有85%的一致性，故命名為HvFAD基因。

以紫萼玉簪根系cDNA為模板，采用3′RACE及5′ Genome Walking的方法進(jìn)行HvGASA、HvFAD基因ORF全長(zhǎng)克隆，試驗(yàn)具體操作方法詳見3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase（TaKaRa公司）使用說(shuō)明書及Genome Walking Kit（TaKaRa公司）使用說(shuō)明書。使用Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行引物合成及測(cè)序，引物信息見表2。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用Ex PASy-Prot Param和Ex PASy-Prot Scale在線分析氨基酸序列的疏水性和理化性質(zhì)。通過(guò)Expasy網(wǎng)站（http：//www.expasy.org/）將該cDNA序列翻譯為氨基酸序列。通過(guò)NCBI網(wǎng)站的在線BLAST分析工具（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中的BLASTp工具對(duì)核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)庫(kù)檢（比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)選擇NR，替換計(jì)分矩陣選擇BLOSUM62，其他采用默認(rèn)參數(shù)），檢索與該蛋白序列相似度較高的序列。然后選取比對(duì)結(jié)果中E-value較低且Querycover較高的序列，用CLUSTX2進(jìn)行多序列比對(duì)。采用Signal P4.1預(yù)測(cè)其是否具有信號(hào)肽。將多序列比對(duì)結(jié)果輸出為NEXUS格式，用PUAP 4.0和Modeltest 3.7檢驗(yàn)最優(yōu)的氨基酸替換模型，然后在GTR+I+G（廣義時(shí)間可逆）模型下用最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹。在NCBI網(wǎng)站使用BLASTp程序進(jìn)行庫(kù)檢，數(shù)據(jù)庫(kù)采用PDB，搜索結(jié)果與目的基因氨基酸序列相似性較高且已知蛋白晶體的序列，并選擇與目的基因相似度較高且分辨率較高的3個(gè)晶體結(jié)構(gòu)作為參考，然后用Modeller 9.1軟件，構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)。用PSORT Ⅱ在線分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析。

1.5 qRT-PCR表達(dá)量分析

qRT-PCR使用的引物序列見表2，以報(bào)道的Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因[15]，設(shè)置3次重復(fù)試驗(yàn)。試驗(yàn)試劑采用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa公司），儀器使用7300 Fast Real Time PCR System（ABI公司）。

2 結(jié)果與分析

2.1 總DNA提取、總RNA提取及檢驗(yàn)

紫萼玉簪根系總DNA提取凝膠電泳結(jié)果見圖1，D260 nm/D280 nm為1.925，DNA濃度為486 μg/μL。根系總RNA的凝膠電泳結(jié)果見圖2，D260 nm/D280 nm為2.031，RNA濃度為 209 μg/μL。

2.2 HvGASA、HvFAD基因的克隆

用3′RACE和5′Genome Walking的方法進(jìn)行HvGASA、HvFAD基因3′末端和5′末端的克隆，PCR凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖3，切膠回收測(cè)序后，利用DNAMAN進(jìn)行全長(zhǎng)序列拼接后，再進(jìn)行Blast序列比對(duì)，獲得具有完整ORF框的2條基因序列：HvGASA（336 bp，圖3-a）、HvFAD（1 320 bp，圖3-b）。

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 HvGASA基因

2.3.1.1 理化性質(zhì)分析、多序列比對(duì) HvGASA基因的序列全長(zhǎng)為336 bp，編碼的蛋白質(zhì)全長(zhǎng)111個(gè)氨基酸，分子量為27.95 ku，等電點(diǎn)（pI）為5.24。利用推測(cè)的HvGASA氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTp搜索，并從其序列比對(duì)結(jié)果中挑選相似性較高的12條GASA蛋白序列，進(jìn)一步與HvGASA進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果如圖4所示。通過(guò)SMART網(wǎng)站及ExPASy-ProtScale網(wǎng)站對(duì)氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GASA蛋白N端1～23個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列（圖4中方框區(qū)域），C末端具有由12個(gè)半胱氨酸殘基組成的高度保守的GASA結(jié)構(gòu)域（圖4中箭頭所指部位），兩者之間是極性氨基酸殘基組成的可變親水區(qū)域，黑色背景區(qū)域?yàn)楸Ｊ匦暂^高區(qū)域。

2.3.1.2 構(gòu)建進(jìn)化樹 利用PUAP 4.0對(duì)13條GASA蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)GASA蛋白可被分為2大類（圖5），其中桐油樹（Jatropha curcas，NP_001295614.1 ）、毛果楊（Populus trichocarpa，XP_002307720.1）、蕪菁（Brassica rapa，XP_009112561.1）、巨桉（Eucalyptus grandis，XP_010060208.1）、芝麻（Sesamum indicum，XP_011092868.1）等8條序列聚為一類;HvGASA與石刁柏（Asparagus officinalis，XP_020274408.1）、大蒜（Allium sativum，AEX55233.1）關(guān)系較近，與鐵皮石斛（Dendrobium catenatum，XP_010688394.1）、甜菜（Beta vulgarias，XP_010690459.1）聚為一類。

2.3.1.3 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 用Modeller 9.1軟件構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)，構(gòu)建出的HvGASA蛋白三維結(jié)構(gòu)如圖6所示。

2.3.1.4 亞細(xì)胞定位分析 用PSORTⅡ在線分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析，得到HvGASA蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果為39.1%的可能性在線粒體，30.4%的可能性在細(xì)胞外，17.4%的可能性在細(xì)胞核內(nèi)，8.7%的可能性在細(xì)胞漿，4.3%的可能性在囊泡中。

2.3.2 HvFAD基因

2.3.2.1 理化性質(zhì)分析、多序列比對(duì) HvFAD基因的序列全長(zhǎng)為1 320 bp，編碼399個(gè)氨基酸，具有3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，說(shuō)明FAD是跨膜蛋白，分子量50.98 ku，等電點(diǎn)（pI）為8.85。利用推測(cè)的HvFAD基因編碼的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTp搜索，并從其序列比對(duì)結(jié)果中挑選相似性較高的12條FAD蛋白序列，進(jìn)一步與HvFAD的編碼氨基酸進(jìn)行多序列比對(duì)。多序列比對(duì)結(jié)果如圖7所示，圖中方框標(biāo)識(shí)區(qū)域?yàn)樵摶虻?個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，黑色背景區(qū)域?yàn)楸Ｊ匦暂^高區(qū)域。

2.3.2.2 構(gòu)建進(jìn)化樹 HvFAD基因與石刁柏（Asparagus officinalis，XP_020241744.1）100%同源，與菠蘿（Ananas comosus，XP_020082614.1）、小果野蕉（Musa acuminata，XP_00938546.1）、油棕（Elaeis guineensis，XP_010942103.1）、海棗（Phoenix dactylifera，XP_008799646.1）聚為一類，詳見圖8。

2.3.2.3 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 用Modeller 9.1軟件構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)，構(gòu)建出的HvFAD蛋白三維結(jié)構(gòu)如圖9所示。

2.3.2.4 亞細(xì)胞定位分析 用PSORTⅡ在線分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析，得到該蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果為55.6%可能性定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，44.4%可能性定位于線粒體。這與報(bào)道中EuFAD3-1（杜仲，Eucommia ulmoides）基因通過(guò)亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白質(zhì)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)果[16]相似。

2.4 qRT-PCR分析表達(dá)量

通過(guò)qRT-PCR試驗(yàn)，獲得HvGASA、HvFAD基因在紫萼玉簪入冬自然降溫過(guò)程中的表達(dá)量變化，結(jié)果見圖10。

2.4.1 HvGASA基因qRT-PCR分析 通過(guò)qRT-PCR試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，紫萼玉簪中GASA基因的表達(dá)量在入秋降溫過(guò)程中有3個(gè)明顯的降溫階段（17.2～11.5、11.5～3、3～-1.0 ℃），HvGASA基因表達(dá)量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而最后一次降溫中HvGASA基因上調(diào)表達(dá)的幅度明顯大于前2個(gè)階段降溫，說(shuō)明3 ℃低溫對(duì)紫萼玉簪產(chǎn)生了較明顯的脅迫作用，致使HvGASA基因大量表達(dá)以抵御逆境脅迫，而當(dāng)降溫程度減弱甚至稍有回升時(shí)，HvGASA基因表達(dá)量又表現(xiàn)出下調(diào)趨勢(shì)。

2.4.2 HvFAD基因qRT-PCR分析 紫萼玉簪FAD基因在入秋降溫過(guò)程中有3個(gè)明顯的降溫階段（17.2～11.5、11.5～3、3～-1.0 ℃），HvFAD基因表達(dá)量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且 11.5～3 ℃的降溫幅度中，HvFAD基因上調(diào)表達(dá)幅度最明顯。

3 討論

GASA編碼基因數(shù)量眾多，不同的GASA基因家族成員可以具有相同或相反的功能，甚至同一GASA基因家族成員具有多種生物學(xué)功能。本研究通過(guò)低溫差異背景下進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，經(jīng)Unigene組裝及差異表達(dá)基因分析、基因功能注釋等工作，從測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到HvGASA基因。曾有文獻(xiàn)報(bào)道GASA基因與環(huán)境溫度相關(guān)，Ko等研究表明，擬南芥GASA4基因的表達(dá)與溫度有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)該基因與玉米（Zea mays）的耐熱基因TTO 6（Thermo-tolerance 6）存在69%的相似性;GASA4基因過(guò)表達(dá)下，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的抗熱性顯著增強(qiáng)，認(rèn)為可能是GASA4蛋白作為胞外熱擊信號(hào)分子或者作為分子伴侶通過(guò)穩(wěn)定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的與熱擊因子HSE（heat shock element）有關(guān)的BiP蛋白（binding protein），從而提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐熱性[17]。張強(qiáng)等研究發(fā)現(xiàn)，大馬士革玫瑰（Rosa damascena）的GASA4-like基因與擬南芥（Arabidopsis thaliana）GASA4氨基酸及玉米耐熱基因TTO6氨基酸均有較高的相似性。通過(guò)對(duì)GenBank的Blast分析及基因序列分析發(fā)現(xiàn)，大馬士革玫瑰GASA4-like基因與高溫和鹽脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)的基因高度同源，其序列中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)MYB、MYC轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)和誘導(dǎo)抗性響應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄的W-box，表明GASA4-like的蛋白可能也參與了植物的抗性調(diào)節(jié)過(guò)程[18]。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，自然降溫過(guò)程中HvGASA基因會(huì)隨著降溫而發(fā)生上調(diào)表達(dá)，且降溫幅度大，表達(dá)量上調(diào)幅度也增加，而當(dāng)溫度略有回升時(shí)，HvGASA基因發(fā)生下調(diào)表達(dá)，說(shuō)明紫萼玉簪GASA基因與植物抗寒性具有密切的關(guān)系，并成正向相關(guān)，而玉簪的GASA基因是否還參與系統(tǒng)發(fā)育等方面的建成，還有待于進(jìn)一步研究。

植物受低溫脅迫時(shí)引起的受害反應(yīng)主要是由于低溫破壞了細(xì)胞膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和流動(dòng)性，而脂肪酸是細(xì)胞膜脂的主要成分，適當(dāng)?shù)脑黾又参矬w內(nèi)不飽和脂肪酸的比例，可明顯提高植物的抗寒性。根據(jù)雙鍵的位置和功能等可將不飽和脂肪酸分為ω-3和ω-6 2種類型[19]，目前對(duì)ω-3脂肪酸去飽和酶基因研究多集中在FAD3基因，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道該基因已從紫蘇（Perilla frutescens）等植物中成功分離克隆出來(lái)，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證該基因的過(guò)量表達(dá)可顯著提高植物體內(nèi)不飽和脂肪酸的比例，而提高植物的抗寒性[20]。ω-3脂肪去飽和酶屬于膜結(jié)合脫氫酶，有研究表明，擬南芥的脂肪酸脫氫酶基因FAD3和FAD7基因在常溫下可正常表達(dá)，而FAD8基因只有在溫度≤20 ℃ 時(shí)才表達(dá)[19]。本試驗(yàn)中HvFAD基因隨自然降溫而發(fā)生上調(diào)表達(dá)，原因是FAD基因上調(diào)表達(dá)的結(jié)果是增加了不飽和脂肪酸的含量，從而提高膜脂的流動(dòng)性，最終使得植物的耐凍性得到提高。有研究證明，脂肪酸的代謝和修飾在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或胞質(zhì)中進(jìn)行[21]，本研究中對(duì)紫萼玉簪的FAD基因的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果與之相符合。

通過(guò)上述2條與抗寒相關(guān)基因在不同地溫環(huán)境中表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，2條基因均在3 ℃附近表現(xiàn)出明顯的表達(dá)量變化，由此可推測(cè)紫萼玉簪根系對(duì)于3 ℃以上低溫環(huán)境不敏感，3 ℃ 以上低溫對(duì)紫萼玉簪根系組織的影響相對(duì)較小，而3 ℃以下的低溫會(huì)明顯影響其正常生理活動(dòng)，致使大量抗寒相關(guān)基因迅速發(fā)生表達(dá)量變化，以達(dá)到抵御低溫所帶來(lái)的危害。

4 結(jié)論

從紫萼玉簪中克隆得到HvGASA、HvFAD基因的cDNA全長(zhǎng)序列，長(zhǎng)度分別為336、1 320 bp，分別編碼111、399個(gè)氨基酸，其中HvFAD基因所編碼的蛋白為跨膜蛋白。qRT-PCR分析結(jié)果表明，2條基因隨自然地溫的降低均發(fā)生上調(diào)表達(dá)，而且在地溫降至3 ℃時(shí)發(fā)生劇烈的表達(dá)量變化，說(shuō)明HvGASA和HvFAD與紫萼玉簪的抗寒性具有密切的關(guān)系。

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