肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質(zhì)體對大鼠肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響

張石蕾，由淑萍，馬曉婷，馬 龍，趙 軍，劉 濤，*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院基礎(chǔ)護(hù)理學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊830011；3.新疆維吾爾族自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004)

肝纖維化的發(fā)展和結(jié)局是一個復(fù)雜的過程，涉及實質(zhì)和非實質(zhì)肝細(xì)胞以及浸潤的免疫細(xì)胞。由于細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生、沉積增加而形成瘢痕的纖維反應(yīng)是肝臟結(jié)構(gòu)變化的關(guān)鍵步驟[1]?；罨母涡菭罴?xì)胞(hepaticstellatecells，HSCs)轉(zhuǎn)為靜止?fàn)顟B(tài)及其凋亡是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的關(guān)鍵因素[2]。肉蓯蓉是常見的補益類中藥，因其療效切實，藥性溫和，自古就被視為強身壯體、滋補的中藥，有“沙漠人參”之佳譽。化學(xué)及藥理作用研究顯示肉蓯蓉苯乙醇總苷(Cistanchephenylethanoid glycosides，CPhGs)具有抗氧化、抗抑郁、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗菌和免疫調(diào)節(jié)等多種生物功能，是肉蓯蓉發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一[3]。本課題組前期實驗研究證實，CPhGs對改善肝功能、抗肝纖維化有顯著療效，且隨CPhGs濃度的增加，HSCs的凋亡率逐漸增高，呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系[4]。目前許多已經(jīng)被批準(zhǔn)臨床應(yīng)用的抗肝纖維化作用藥物，對晚期肝纖維化和肝硬化的治療效果不佳，因此，研發(fā)靶向高效、高純度、高穩(wěn)定性、低免疫原性的抗肝纖維化藥物勢在必行。脂質(zhì)體作為新型藥物載體，可以增加藥物透過細(xì)胞膜的能力，能夠迅速到達(dá)病灶且主要分布于肝臟，從而降低藥物毒性，其緩釋性更能夠增強藥物的作用濃度，延長作用時間，減少藥物用量，提高藥物療效[5-6]。因此，本實驗以脂質(zhì)體為藥物載體包裹傳統(tǒng)中藥制成CPhGs脂質(zhì)體，研究CPhGs脂質(zhì)體對體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡、周期的作用，并初步探討其相關(guān)的分子機制，旨在研究可能為臨床所用的抗肝纖維化的靶向藥物治療途徑，為進(jìn)一步藥物開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

HSCs，購于上海中喬新舟生物科技有限公司；胎牛血清，購于美國Gibco公司，-20℃分裝保存；雙抗(青霉素、鏈霉素)、DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰酶(1×)，均購于美國Hyclone公司；AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑盒，均購于美國BD公司；四甲基偶氮唑鹽MTT、DMSO，均購于美國Sigma公司；兔抗β-actin多克隆抗體，購于北京博奧森生物科技有限公司。

1.2 實驗儀器

超凈工作臺，美國ThermoScientific公司；CK-40型熒光倒置顯微鏡，日本Olympus公司；AEL-200型電子天平；TGL-16G型臺式低溫高速離心機；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，英國NEWBRUNSWICKGalaxy?系列；全波長自動酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢驗測試儀，美國Thermo Scientific公司；低溫離心機，美國Sigma公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；脫色搖床，北京市六一儀器廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；Westernblot使用的電源、電泳裝置及轉(zhuǎn)膜裝置，美國Bio-Rad公司；移液器，美國ThermoScientific公司；FluorChemE化學(xué)發(fā)光高靈敏凝膠成像儀，美國ProteinSimple公司。

1.3 CPhGs脂質(zhì)體的制備

采用薄膜分散法制備CPhGs脂質(zhì)體。稱取卵磷脂、DPPC、膽固醇(質(zhì)量比 5mg∶10mg∶10mg)，溶于適量氯仿和甲醇混合溶劑中(V氯仿∶V甲醇=2∶1)，在49～50℃下旋轉(zhuǎn)使成膜狀，加入250μg/mL的苯乙醇總苷不斷旋轉(zhuǎn)水化，使磷脂膜轉(zhuǎn)入水中形成脂質(zhì)體，將所得脂質(zhì)體放入4℃冰箱中備用。所得脂質(zhì)體用0.45μm的微孔濾膜擠壓4～5次，0.22μm的微孔濾膜擠壓18～20次，即得粒徑均勻的苯乙醇總苷脂質(zhì)體。包封率(38.46±7.85)%；電位45mV；粒徑209 nm；載藥量(3.71±0.23)%。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

將復(fù)蘇的HSCs常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的厭氧培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞貼壁率約為80%時即可傳代，復(fù)蘇后傳2～3代，待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后即可用于實驗。將HSCs分為4組：空白對照組(未加入受試物，只加培養(yǎng)液)、CPhGs脂質(zhì)體低、中、高濃度(分別為7.36、14.72、29.45 μg/mL)處理組。

1.5 MTT法檢測CPhGs脂質(zhì)體對HSCs增殖的影響

選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞、棄去培養(yǎng)液，加入500 μL0.25%的胰酶進(jìn)行消化，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/mL后接種96孔板，每孔100μL，12h貼壁后，吸去上清液，加入含各濃度CPhGs脂質(zhì)體藥物的完全培養(yǎng)基，每孔100μL，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。CPhGs脂質(zhì)體藥物用完全培養(yǎng)基倍比稀釋成7.36、14.72、29.45μg/mL共3個濃度。分別于培養(yǎng)24、48、72h后加入5mg/mL的MTT20 μL，4h后吸去上清加入150μLDMSO，492nm處測定吸光度D(492)值，并計算其均值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測CPhGs脂質(zhì)體對HSCs凋亡的影響

HSCs按1×105個/mL的濃度接種至6孔板，分組情況同1.4，給予受試物24h后將細(xì)胞吸至15mL離心管，每孔加入500μL胰酶消化細(xì)胞，用對應(yīng)的完全培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打孔里的細(xì)胞混勻，每孔加入2mLPBS沖洗細(xì)胞，將孔里的PBS移至15mL離心管，盡可能多收集孔里的細(xì)胞，1000r/min離心5 min后棄上清，加5mLPBS至15mL離心管沖洗細(xì)胞，重復(fù)1次。每個樣品加入100μL1×Binding Buffer，重懸細(xì)胞，將細(xì)胞移至1.5mLEP管，各樣品加AnnexinV、PE雙染，混勻避光放置30min后，分別加入400μLBindingBuffer，1h內(nèi)上機檢測細(xì)胞凋亡率。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測CPhGs脂質(zhì)體對HSCs周期的影響

HSCs按1×105個/mL的濃度接種至6孔板，細(xì)胞分組及處理同1.4。完成后逐滴加入5mL或更多預(yù)冷的75%的乙醇，渦旋以混勻細(xì)胞，4℃避光過夜(＞18 h)。1000r/min離心10min后棄上清，清洗細(xì)胞2次以去除所有的乙醇。分析前4℃避光保存樣本，1h之內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.8 CPhGs脂質(zhì)體對HSCs中caspase-3和p27蛋白表達(dá)的影響

HSCs按1×105個/mL的濃度接種至6孔板，分組情況同1.4，給予受試物24h后收集細(xì)胞，提取各組細(xì)胞中的總蛋白，上樣于聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行還原性SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)(PVDF膜)，200mA恒流電轉(zhuǎn)90min。封閉液(5%脫脂奶粉)封閉PVDF膜過夜，用1×TBST緩沖液充分振蕩清洗，TBST稀釋抗體，一抗?jié)舛确謩e為 caspase-3(1∶1000)、p27(1∶1500)、β-actin(1∶5000)，ECL顯色。FluorChemE化學(xué)發(fā)光高靈敏凝膠成像儀上檢測條帶灰度值。

蛋白相對表達(dá)量=目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶β-actin灰度值×100%

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CPhGs脂質(zhì)體對HSCs增殖的影響

采用MTT比色法檢測CPhGs脂質(zhì)體對HSCs增殖的影響，結(jié)果見圖1。與空白對照組相比，CPhGs脂質(zhì)體低、中、高即7.36、14.72、29.45μg/mL劑量組的細(xì)胞生長速度均明顯減慢(P＜0.05)。同一時間點，與空白對照組相比較，隨著藥物濃度升高，抑制細(xì)胞增殖作用增加(P＜0.05)；同一濃度組，隨時間延長，細(xì)胞活力不斷降低；且隨著時間以及藥物濃度的增加，抑制HSCs增殖能力不斷上升。提示CPhGs脂質(zhì)體具有抑制HSCs增殖的作用。

2.2 CPhGs脂質(zhì)體對HSCs凋亡的影響

7.36 、14.72、29.45μg/mL的CPhGs脂質(zhì)體作用于HSCs24h后，早期凋亡與晚期凋亡的細(xì)胞總和分別為(18.5±2.7)%、(26.6±2.3)%、(31.6±1.9)%，與空白對照組的(5.0±0.9)%相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，結(jié)果見表1和圖2。分析表明CPhGs脂質(zhì)體3個劑量組均可明顯誘導(dǎo)HSCs的早、晚期凋亡(與空白對照組比較，P＜0.05)，提示CPhGs脂質(zhì)體可通過誘導(dǎo)HSCs凋亡，從而抑制HSCs的激活及肝纖維化的發(fā)生。

圖1 MTT法檢測CPhGs脂質(zhì)體對HSC增殖的影響

表1 CPhGs脂質(zhì)體各劑量組對HSCs細(xì)胞凋亡率的影響(n=3，)

表1 CPhGs脂質(zhì)體各劑量組對HSCs細(xì)胞凋亡率的影響(n=3，)

與空白對照組比較，*P＜0.05

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2.3 CPhGs脂質(zhì)體對HSCs細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期分析結(jié)果(表2和圖3)顯示，CPhGs脂質(zhì)體各劑量組處理的HSCs，與空白對照組相比，G0/G1期的細(xì)胞比例均明顯增多(P＜0.05)，而S期細(xì)胞比例明顯減少(P＜0.05)，G2/M期細(xì)胞比例明顯減少(P＜0.05)。提示CPhGs脂質(zhì)體可通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯抑制HSCs增殖，CPhGs脂質(zhì)體可引起細(xì)胞周期明顯阻滯。

表2 CPhGs脂質(zhì)體各個劑量組對HSC周期的影響(%，n=3，)

表2 CPhGs脂質(zhì)體各個劑量組對HSC周期的影響(%，n=3，)

與空白對照組比較，*P＜0.05.

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2.4 CPhGs脂質(zhì)體對大鼠肝星狀細(xì)胞caspase-3、p27蛋白表達(dá)水平的影響

Westernblot檢測結(jié)果見圖4。與正常對照組比較，CPhGs脂質(zhì)體(29.45、14.72μg/mL)組大鼠肝星狀細(xì)胞caspase-3蛋白的表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；其中CPhGs脂質(zhì)體29.45μg/mL濃度組上調(diào)作用最明顯(P＜0.05)；與空白對照組比較，CPhGs脂質(zhì)體各劑量組p27蛋白的表達(dá)水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；CPhGs脂質(zhì)體29.45 μg/mL濃度組上調(diào)作用最明顯(P＜0.05)。

圖2 AnnexinV-FITC/PE雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測CPhGs脂質(zhì)體對HSCs細(xì)胞凋亡的影響

圖3 PE單染流式細(xì)胞術(shù)檢測CPhGs脂質(zhì)體對HSCs細(xì)胞周期的影響

3 討論

肝纖維化是因ECM合成與降解失衡所致，是各種肝病發(fā)展為肝硬化的共同途徑。HSCs的激活是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)，在肝損傷修復(fù)過程中發(fā)揮作用。肝損傷后，HSCs受各種致病因子刺激，從靜態(tài)轉(zhuǎn)化為具增生性、纖維原性和可收縮性的肌成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生大量ECM沉積于肝臟，最終導(dǎo)致肝纖維化。近年來研究發(fā)現(xiàn)，隨著肝星狀細(xì)胞數(shù)量的減少，肝纖維化程度可得到明顯改善[7-8]。因此，抗肝纖維化的藥物研究多數(shù)以肝星狀細(xì)胞為作用點尋找突破，經(jīng)抑制炎癥反應(yīng)，減少肝損傷因素如酒精藥物等，干擾相關(guān)細(xì)胞因子的活性調(diào)節(jié)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的正常進(jìn)行，以達(dá)到抑制肝星狀細(xì)胞活化及增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，減少ECM生成，尋找能以HSCs為作用靶點，成為治療肝纖維化的重要策略[1]。

圖4 Westernblot檢測CPhGs脂質(zhì)體處理HSCs后caspase-3、p27蛋白的表達(dá)水平

迄今為止，國內(nèi)外的研究中，抑制HSCs活化并促進(jìn)其凋亡、調(diào)節(jié)ECM的合成和降解等方面已取得一些成果，對肝纖維化的臨床治療提供了一些藥物和方法，但總體療效仍不理想。目前多認(rèn)為，限制抗肝纖維化藥物效果的原因，可能與藥物無法達(dá)到靶細(xì)胞、或到達(dá)靶細(xì)胞但無法在其周圍形成有效的藥物濃度及半衰期短和藥物對其他組織細(xì)胞的副作用大過增加劑量帶來的療效等有關(guān)[9]。隨著肝臟疾病病死率的提高和中醫(yī)藥現(xiàn)代化進(jìn)程的深入，中藥防治肝纖維化的機制研究越來越被人們所關(guān)注，可用于肝纖維化防治藥物的分子靶點也與日俱增[10]。肉蓯蓉(CistanchesHerba)為列當(dāng)科植物肉蓯蓉(CistancheDeserticolaY.C.Ma)或管花肉蓯蓉[C.tubulosa(Schenk)Wight]的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖，作為滋補類傳統(tǒng)中藥在中國具有悠久的應(yīng)用歷史化學(xué)作用及藥理作用[11]。課題組前期研究結(jié)果顯示，CPhGs可明顯抑制HSC的增殖，誘導(dǎo)其凋亡。且隨CPhGs濃度的增加，HSCs的凋亡率逐漸增高，預(yù)示其在治療肝臟疾病中有著廣闊的應(yīng)用前景[12]。因此，研發(fā)靶向高效、高純度、高穩(wěn)定性、低免疫源性的CPhGs勢在必行，同時應(yīng)加強CPhGs抗肝纖維化機制的深入研究，為進(jìn)一步可能的臨床研究提供最扎實的理論基礎(chǔ)。本實驗在體外水平研究3種不同劑量的CPhGs脂質(zhì)體對HSCs增殖、凋亡、周期及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討CPhGs脂質(zhì)體的抗肝纖維化機制，以期為肝纖維化的防治奠定基礎(chǔ)。

MTT檢測結(jié)果顯示，高、中及低劑量組CPhGs脂質(zhì)體各濃度組24、48及72h均能抑制HSCs的增殖(P＜0.05)。

細(xì)胞凋亡，又稱程序性細(xì)胞死亡，細(xì)胞調(diào)亡是由基因調(diào)控的一種主動的細(xì)胞死亡過程，在某些生理或病理條件下，對維持機體正常的生理和功能活動具有重要的生物學(xué)意義[13]。Caspase蛋白家族成員組成凋亡通路的關(guān)鍵基因，細(xì)胞色素C是發(fā)現(xiàn)的第一種線粒體釋放促凋亡蛋白，是線粒體呼吸鏈的重要組成部分。細(xì)胞色素C使Apaf1寡聚化并能使caspase-9前體聚集，最終導(dǎo)致caspase-9前體水解形成活性酶。隨后caspase-9促使其他caspase酶(如caspase-7)的執(zhí)行者即caspase-3前體轉(zhuǎn)換為有活性的caspase-3。Caspase-3是細(xì)胞凋亡早期一種非常重要的物質(zhì)，被認(rèn)為是執(zhí)行酶中最為重要的一個，能夠被所有的起始凋亡蛋白酶活化，并降解細(xì)胞主要結(jié)構(gòu)，最終瓦解細(xì)胞[14]。本次細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示，CPhGs脂質(zhì)體3個劑量組均可明顯誘導(dǎo)大鼠肝星狀細(xì)胞的早、晚期凋亡(與空白對照組比較，P＜0.05)。蛋白水平檢測結(jié)果顯示，與正常對照組細(xì)胞相比，在CPhGs脂質(zhì)體(29.45、14.72μg/mL)處理的細(xì)胞中，caspase-3蛋白水平表達(dá)顯著上調(diào)。這與細(xì)胞凋亡分析結(jié)果顯示的CPhGs脂質(zhì)體處理的HSCs出現(xiàn)了明顯凋亡，證實CPhGs脂質(zhì)體可能是通過上調(diào)caspase-3基因的表達(dá)而抑制細(xì)胞的增殖能力，從而誘導(dǎo)HSCs發(fā)生凋亡。

細(xì)胞周期分為分裂間期和分裂期，其中分裂期又可分為：DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)和DNA合成后期(G2期)[15]。細(xì)胞周期的正常運行依賴于正、負(fù)調(diào)節(jié)因子的共同參與。正調(diào)節(jié)因子包括細(xì)胞周期蛋白(cyclin)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependentkinase，CDK)；負(fù)調(diào)節(jié)因子主要是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(cyclindependentkinase inhibitor，CKI)。以上3種調(diào)控因子在維持細(xì)胞有序的增殖、分裂活動中起重要作用，三者相互作用，共同參與細(xì)胞周期調(diào)控[16]。p27屬于CKI，可通過抑制cyclin/CDK形成異二聚體結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞停滯于G1期，從而實現(xiàn)對細(xì)胞周期的調(diào)控功能[17]。細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示，CPhGs脂質(zhì)體3個劑量組處理的HSCs，與空白對照組相比，G0/G1期的細(xì)胞比例均明顯增多(P＜0.05)，而S期細(xì)胞比例明顯減少(P＜0.05)，G2/M期細(xì)胞比例明顯減少(P＜0.05)，且呈一定的劑量依賴關(guān)系。與正常對照組細(xì)胞相比，在CPhGs脂質(zhì)體(7.36、14.72、29.45μg/mL)處理的細(xì)胞中，p27蛋白水平表達(dá)顯著上調(diào)。這與細(xì)胞凋亡分析結(jié)果顯示的CPhGs脂質(zhì)體處理的細(xì)胞出現(xiàn)明顯的G1期阻滯，S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著減少是一致的。說明p27在CPhGs脂質(zhì)體抑制HSCs增殖中可能具有重要作用。

本研究結(jié)果顯示，在細(xì)胞水平上，探討了CPhGs脂質(zhì)體對HSCs的影響。將不同劑量的CPhGs脂質(zhì)體藥物對HSC進(jìn)行處理，CPhGs脂質(zhì)體3個劑量組均可以抑制HSC的增殖，增加了HSC的凋亡，這一過程可能是通過激活以及caspase-3蛋白表達(dá)而引起細(xì)胞凋亡。此外，CPhGs脂質(zhì)體可使HSC細(xì)胞周期更多地停滯在S期，可能的作用機制是影響了細(xì)胞周期蛋白p27蛋白的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞周期的能力。提示細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)是CPhGs脂質(zhì)體防治肝纖維化的兩個靶點，根據(jù)這一結(jié)論，可對細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)的信號通道進(jìn)行更深入的研究，進(jìn)一步揭示CPhGs脂質(zhì)體的抗纖維化機制，以達(dá)到靶向或抑制肝纖維化的目的。

(本實驗主要在新疆醫(yī)科大學(xué)中心實驗室完成，在此特別感謝實驗室的負(fù)責(zé)老師及研究生同學(xué)的支持與幫助)