穿心蓮內酯對鎘致小鼠急性肝損傷的改善作用

何亞蘭， 朱耀輝， 陳 超， 洪敏影， 張 晨， 王 楠， 劉 暢， 李 磊

(安徽科技學院 動物科學學院，安徽 鳳陽 233100)

重金屬鎘(Cd)是一種對人體危害極大的毒物，其移動性大，毒性強，半衰期長達10～30年，被美國毒物管理委員會列為第6位危及人類健康的有毒環(huán)境污染物質[1]。環(huán)境鎘污染主要來源于鋅礦、鉛礦等的開采與冶煉，化石燃料的應用以及機械制造等生產領域。進入環(huán)境中的鎘可通過食物鏈富集進入人體，對人體腎臟、肝臟、肺臟、骨骼、大腦以及生殖、免疫系統(tǒng)等均可造成損傷[2]，并具有致畸、致癌、致突變的作用，其中肝臟是鎘急性毒性的主要靶器官[3]。目前針對鎘中毒的治療常采用鰲合劑、營養(yǎng)元素、維生素類藥物，雖能起到一定治療作用，但也都存在著不同程度的不良反應[4]。所以,尋求一種更為有效的、副作用小的藥物預防或治療鎘中毒日趨成為研究熱點。

穿心蓮內酯(andrographolide，Andro)為天然藥物穿心蓮的有效成分，具有抗菌、抗炎、免疫調節(jié)、保肝利膽等作用[5]，并且毒性小、價格低[6]。相關研究表明Andro可通過抗炎及抗氧化作用緩解乙醇、四氯化碳導致的肝毒性[7-8]，然而,目前有關于Andro緩解鎘誘導肝損傷的研究尚未見報道。為此，本研究觀察Andro對鎘致急性肝損傷的緩解作用，以期為Andro臨床應用于治療鎘誘導的急性肝毒性提供理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 體重18～22 g清潔級ICR小鼠30只，由安徽科技學院實驗動物中心提供。試驗期間自由采食、飲水。

1.1.2 藥品與試劑 Andro(批號：C10064882)購于上海麥克林生化科技有限公司；CdCl2(批號：E1724020)購自于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；羧甲基纖維素鈉(批號：F20050621)購于國藥集團化學試劑有限公司；天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)試劑盒(批號：20180511),谷氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)試劑盒(生產批號：20180511),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒(批號：20180512)和還原性谷胱甘肽(glutathione，GSH)測定試劑盒(批號：20180512)均購于南京建成生物工程研究所；小鼠腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β ELISA試劑盒購于深圳欣博盛生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自于美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.1.3 儀器設備 電熱恒溫培育箱(上海一恒科學儀器有限公司)；全波長酶標儀(賽默飛世爾科技有限公司)；高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；IMS-70全自動雪花制冰機(常熟市雪科電器有限公司)；第三代高速組織研磨器套裝(天根生化科技有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 分組及給藥 取30只清潔級ICR小鼠適應性喂養(yǎng)一周后，隨機分為空白對照組、模型組、Andro低劑量組(30 mg/kg)、Andro高劑量組(60 mg/kg)?？瞻讓φ战M和模型組每日按0.1 mL/10 g給予0.5%羧甲基纖維素鈉，給藥組分別給予相應劑量的Andro，連續(xù)灌胃7 d，期間小鼠自由采食和飲水。第7天灌胃2 h后，對模型組和Andro給藥組腹腔注射4 mg/kg CdCl2，18 h后處死小鼠。

1.2.2 樣品采集 摘眼球取血，于室溫靜置1～2 h后4 ℃條件下4 000 r/min離心15 min分離血清，收集肝臟，-80 ℃超低溫冷凍儲存用于后續(xù)試驗。

1.3 指標檢測

1.3.1 血清生化指標的檢測 將分離的血清,按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書測定小鼠血清ALT與AST的活力。

1.3.2 肝臟組織病理學檢查 摘取小鼠左肝葉片，經4%甲醛固定，用乙醇脫水，石蠟包埋，冷卻并切片，伊紅-蘇木精(H&E)染色，光鏡下觀察肝細胞病理學變化。

1.3.3 肝臟抗氧化指標的檢測 準確稱取肝臟100 mg，加入9倍體積的生理鹽水，置于冰上研磨粉碎，制成10%肝臟勻漿液，2 500～3 000 r/min離心10 min，取上清，按照說明書操作檢測小鼠肝臟GSH含量與SOD的活力，以樣本蛋白濃度進行校正。

1.3.4 血清炎癥因子的檢測 按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。首先樣品加入反應孔，于37 ℃反應90 min。洗板5次，加入生物素化抗體工作液，37 ℃反應30 min。洗滌后再加酶結合物工作液，混勻，37 ℃反應30 min。然后加入顯色劑避光顯色15 min，最后添加終止液終止反應，450 nm處測定吸光值，以同次試驗標準品所繪標準曲線計算其含量。

1.4 數據統(tǒng)計

使用SPSS statistics 23.0軟件處理數據，采取單因素ANOVA分析，多重比較采用LSD檢驗，數據結果均以“平均值±標準誤”表示；P<0.05表示顯著差異，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 小鼠血清生化指標

Andro對鎘致肝組織損傷小鼠血清轉氨酶水平的影響(表1)。與空白對照組相比，CdCl2模型組小鼠ALT、AST活力明顯上升(P<0.01)，提示小鼠肝損傷模型建立成功。Andro低劑量組(30 mg/kg)和高劑量組(60 mg/kg)均可使ALT、AST活力顯著降低(P<0.01)。

表1 Andro對鎘致肝損傷小鼠血清轉氨酶活力的影響

注：**表示與空白組比較P<0.01；#表示與模型組比較P<0.05;##表示與模型組比較P<0.01。下同。

2.2 對小鼠肝組織病理學影響

空白對照組小鼠肝細胞排列整齊，肝小葉結構完整，肝竇正常，細胞核結構清晰，無病理變化(圖1A)；CdCl2模型組小鼠肝竇分散，肝索邊界模糊，肝細胞出現(xiàn)空泡和壞死(圖1B)；使用Andro可改善CdCl2引起的小鼠肝組織細胞形態(tài)變化(圖1C，圖1D)。

圖1 Andro對鎘致急性肝損傷小鼠肝組織病理學影響(HE×200)

2.3 對肝臟抗氧化指標的影響

Andro對鎘致急性肝損傷小鼠抗氧化指標的影響(表2)。與空白對照組相比，模型組可顯著提高肝組織SOD活力和GSH含量(P<0.01)。不同劑量Andro均可使SOD活力和GSH含量有所升高。

表2 Andro對鎘致急性肝損傷小鼠抗氧化指標的影響

2.4 對血清炎性細胞因子表達的影響

Andro對鎘致急性肝損傷小鼠血清炎性細胞因子表達的影響(表3)。與空白對照組相比，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明顯上升(P<0.01)。各給藥組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均極顯著低于模型組(P<0.01)。

表3 Andro對鎘致急性肝損傷小鼠血清炎性細胞因子表達的影響

3 結論與討論

肝臟是鎘蓄積的主要器官，鎘的蓄積可導致肝細胞壞死、凋亡、自噬和惡變等[9]。越來越多的證據表明，炎癥反應和氧化應激在鎘誘導的肝毒性中發(fā)揮著重要的作用[10]。當肝臟損傷時，其細胞膜結構和通透性發(fā)生改變，肝臟細胞中的ALT、AST進入血液，使得血清轉氨酶水平升高。本研究中，ICR小鼠腹腔注射4 mg/kg的CdCl218 h后其血清中ALT和AST的活性顯著升高(P<0.01)，實驗結果與吳永琴等的文獻報道相一致[11]。提示CdCl2誘導的急性肝損傷模型造模成功。而Andro處理組(30、60 mg/kg)可顯著降低模型組的ALT、AST活性；此外，肝組織病理學結果顯示，Andro處理組肝組織損傷程度較模型組有所減輕，表明Andro對CdCl2誘導的小鼠急性肝損傷具有改善作用。

研究表明，急性鎘中毒時，機體的抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，對脂質過氧化物的代謝能力被削弱，導致膜脂質的過氧化作用增強，進而造成了肝臟的氧化損傷[12-13]。SOD作為體內主要的抗氧化酶之一，能夠消除機體在代謝過程中產生的O2-自由基，抑制脂質過氧化作用，減少細胞損傷[14]。因此，SOD活力的檢測可以直接反映機體的抗氧化能力。GSH是肝臟中重要的抗氧化劑，能清除自由基，對肝臟起到保護作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，Andro能增加GSH含量和SOD活力，表明Andro具有調節(jié)機體抗氧化功能起到改善CdCl2誘導的小鼠急性肝損傷的作用。

炎性細胞因子參與機體免疫應答、免疫調節(jié)及細胞的調亡等過程，在機體的各種生理和病理過程扮演著重要的角色。研究表明，在鎘誘導急性肝損傷過程中，肝非實質細胞，尤其是枯否氏細胞表達和分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6是鎘介導肝毒性的重要因素之一。研究表明，染鎘小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6均顯著升高。本研究結果發(fā)現(xiàn)，Andro可顯著降低染鎘小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平，說明Andro可能通過影響炎性細胞因子的表達改善CdCl2誘導的小鼠急性肝損傷。

綜上所述，Andro的應用能夠有效改善鎘誘導的小鼠肝損傷，這與其緩解肝臟氧化損傷與炎癥反應有關，但Andro改善鎘致急性肝損傷的確切作用機制還需要進一步研究。