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    乙型肝炎病毒對(duì)NK細(xì)胞免疫活性的影響作用分析

    2019-07-31 08:06:54黃紅連
    關(guān)鍵詞:靶細(xì)胞病毒感染乙型肝炎

    黃紅連

    (深圳市南山區(qū)西麗人民醫(yī)院,廣東 深圳 518055)

    眾所周知,乙型肝炎病毒所引發(fā)的肝炎是全世界范圍內(nèi)所重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題之一,且有相關(guān)研究報(bào)道顯示,截止2008年,全球慢性乙型肝炎病毒感染患者約有4億人,其中約有25%的患者會(huì)進(jìn)展成為肝硬化或肝細(xì)胞癌[1]。迄今為止,臨床上主要采用核苷酸類(lèi)似物以及干擾素等藥物進(jìn)行抗乙型肝炎病毒治療[2,3]。且近年來(lái)恩替卡韋以及阿德福韋酯等新型藥物開(kāi)始被廣泛應(yīng)用于臨床治療中,具有抗乙型肝炎病毒效果更明顯,耐藥率更低的優(yōu)勢(shì)。然而,上述藥物無(wú)法清除肝細(xì)胞核中的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA,因此無(wú)法徹底治愈乙型肝炎病毒感染[4]。由此,對(duì)乙型肝炎病毒感染的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入的研究,從而尋找治療乙型肝炎病毒感染的新手段是臨床肝病專(zhuān)家們關(guān)注的重點(diǎn)。其中,NK細(xì)胞屬于天然免疫系統(tǒng)中重要細(xì)胞之一,主要是通過(guò)分泌細(xì)胞因子以及特異性殺傷病毒感染的細(xì)胞,從而起到抗病毒作用[5]。鑒于此,本文通過(guò)研究乙型肝炎病毒對(duì)NK細(xì)胞免疫活性的影響作用,旨在為臨床乙型肝炎病毒感染的治療提供指導(dǎo)作用,現(xiàn)報(bào)告如下。

    1 資料與方法

    1.1 研究材料 HepG2.2.15細(xì)胞來(lái)自荷蘭鹿特丹伊拉斯慕斯醫(yī)學(xué)院胃腸病肝病部實(shí)驗(yàn)室;流式細(xì)胞儀FACS CantoⅡ以及細(xì)胞分選儀FACS-Aria均購(gòu)自美國(guó)BD公司;IFNγ特異性酶聯(lián)免疫吸附法定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司;NK細(xì)胞分離試劑盒購(gòu)自德國(guó)Miltenyi公司;過(guò)濾儀Centricon Plus-70購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

    1.2 研究方法 ⑴乙型肝炎病毒獲取:采用10%胎牛血清以及1%請(qǐng)鏈霉素的培養(yǎng)液對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。采集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞上清液,采用過(guò)濾器進(jìn)行分離純化乙型肝炎病毒,并通過(guò)PCR技術(shù)定量測(cè)定病毒量。⑵外周血pDC與NK細(xì)胞的提?。菏紫韧ㄟ^(guò)淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法對(duì)研究對(duì)象的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)行提取,同時(shí)以藻紅蛋白抗血液樹(shù)突狀細(xì)胞抗原4單克隆抗體對(duì)PBMC進(jìn)行標(biāo)記,洗滌后進(jìn)行抗PE磁株標(biāo)記。隨后采用磁株陽(yáng)性分選法對(duì)PBMC中的抗血液樹(shù)突狀細(xì)胞抗原4陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行分離,以FACS-Aria分選儀獲取高純度的抗血液樹(shù)突狀細(xì)胞抗原4陽(yáng)性細(xì)胞,即純度>99%的外周血pDC。NK細(xì)胞分離時(shí)機(jī)和通過(guò)陰性選擇的方式提取外周血NK細(xì)胞,并采用流式雙染色法測(cè)定NK細(xì)胞純度。⑶NK細(xì)胞分泌的IFNγ量測(cè)量:對(duì)健康對(duì)照組的外周血NK細(xì)胞進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng),同時(shí)加入10ng/ml的白細(xì)胞介素12(IL-12)以及IL-18進(jìn)行刺激。將外周血來(lái)源的NK細(xì)胞和來(lái)自同一研究對(duì)象的外周血pDC按照5:1的比例共同放置于96孔板中,以含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。時(shí)候分別加入4×106/ml的乙型肝炎病毒、10μg/ml的CpG寡脫氧核酸以及皰疹病毒進(jìn)行刺激。分別采用酶聯(lián)免疫吸附法定量試劑盒與Model 680微板讀數(shù)儀,測(cè)量450nm處的吸光度,計(jì)算IFNγ的含量。⑷NK細(xì)胞內(nèi)IFNγ的測(cè)量:采用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法進(jìn)行測(cè)定,即在培養(yǎng)結(jié)束后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌,標(biāo)記細(xì)胞表面抗體,經(jīng)由2%的中性加權(quán)固定20min后標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的抗體,再次對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌后采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。⑸NK細(xì)胞殺傷毒性檢測(cè):將NK細(xì)胞與熒光標(biāo)記的K562細(xì)胞共同溫育4h,待細(xì)胞洗滌后,加入7-氨基放線菌素D進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè),并根據(jù)7-氨基放線菌素D以及細(xì)胞熒光雙養(yǎng)性進(jìn)行K562細(xì)胞死亡情況的評(píng)估。

    1.3 觀察指標(biāo) 分析乙型肝炎病毒對(duì)NK細(xì)胞分泌IFNγ的影響、乙型肝炎病毒對(duì)pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞分泌IFNγ的影響、乙型肝炎病毒對(duì)pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞K562的影響。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行檢測(cè)分析,采用“χ2”檢驗(yàn)、t檢驗(yàn),用“[n(%)]”表示計(jì)數(shù)資料,用“(x±s)”表示計(jì)量資料均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差。P值<0.05為兩組數(shù)據(jù)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 乙型肝炎病毒對(duì)NK細(xì)胞分泌IFNγ的影響純化NK細(xì)胞、IL-12與IL-18刺激后的NK細(xì)胞分泌IFNγ量比較不明顯,組間對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表 1。

    表1 乙型肝炎病毒對(duì)NK細(xì)胞分泌IFNγ的影響

    表1 乙型肝炎病毒對(duì)NK細(xì)胞分泌IFNγ的影響

    組別純化NK細(xì)胞IL-12與IL-18刺激后的NK細(xì)胞t值P值例數(shù) IFNγ 水平(ng/ml)120 120--9.92±1.35 10.15±1.38 1.305 0.193

    2.2 乙型肝炎病毒對(duì)pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞分泌IFNγ的影響 CpG寡脫氧核酸刺激、皰疹病毒刺激后的pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞分泌IFNγ量均明顯高于單純pDC誘導(dǎo)NK細(xì)胞分泌IFNγ量,而單純pDC誘導(dǎo)NK細(xì)胞分泌IFNγ量又明顯高于乙型肝炎病毒刺激后的pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞分泌IFNγ量,組間對(duì)比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。 見(jiàn)表2。

    表2 乙型肝炎病毒對(duì)pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞分泌IFNγ的影響

    表2 乙型肝炎病毒對(duì)pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞分泌IFNγ的影響

    注:與乙型肝炎病毒刺激相比,#P<0.05;與單純pDC誘導(dǎo)NK細(xì)胞相比,*P<0.05。

    組別單純pDC誘導(dǎo)NK細(xì)胞CpG寡脫氧核酸刺激皰疹病毒刺激乙型肝炎病毒刺激例數(shù) IFNγ 水平(ng/ml)120 120 120 120 0.43±0.04#1.22±0.42#*1.34±0.41#*0.21±0.01

    2.3 乙型肝炎病毒對(duì)pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞K562的影響 pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞以及乙型肝炎病毒刺激+pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞組的靶細(xì)胞K562死亡率均明顯高于純化NK細(xì)胞,組間對(duì)比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均 P<0.05);而 pDC 誘導(dǎo)的NK細(xì)胞與乙型肝炎病毒刺激+pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞組的靶細(xì)胞K562死亡率相比不明顯,組間對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 見(jiàn)表 3。

    表3 乙型肝炎病毒對(duì)pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞K562的影響

    表3 乙型肝炎病毒對(duì)pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞K562的影響

    注:與純化 NK 細(xì)胞相比,*P<0.05。

    組別純化NK細(xì)胞pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞乙型肝炎病毒刺激+pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞例數(shù) 靶細(xì)胞K562死亡率(%)120 120 120 38.54±3.25 71.52±4.31*70.87±4.28*

    3 討論

    近年來(lái),隨著相關(guān)研究的逐漸深入,越來(lái)越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒的發(fā)展與臨床轉(zhuǎn)歸均和機(jī)體內(nèi)的抗病毒免疫應(yīng)答存在密切相關(guān)[6-8]。其中NK細(xì)胞是有異于T淋巴細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞的一種具有直接殺傷靶細(xì)胞效應(yīng)的特殊淋巴細(xì)胞系,具有明顯的抗感染、免疫調(diào)節(jié)以及抗腫瘤等作用[9-11]。其主要來(lái)源于骨髓,并在體內(nèi)所有淋巴細(xì)胞中占比約為5%~10%。有研究報(bào)道顯示[12-14],NK細(xì)胞發(fā)揮抗病毒作用并不需要特異性抗原的刺激,其中靶細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)、免疫復(fù)合物以及其他細(xì)胞因子均可直接誘發(fā)NK細(xì)胞的免疫反應(yīng),并在短時(shí)間內(nèi)達(dá)至高峰。NK細(xì)胞分泌的最重要細(xì)胞因子為IFNγ,其對(duì)病毒的復(fù)制具有明顯的抑制作用,且在Th1細(xì)胞應(yīng)答和T淋巴細(xì)胞毒性反應(yīng)中發(fā)揮著至關(guān)重要作用[15-17]。由此,本文通過(guò)研究乙型肝炎病毒對(duì)NK細(xì)胞免疫活性的影響作用,以期為臨床乙型肝炎病毒感染的防治提供理論依據(jù)。

    本文結(jié)果顯示:純化NK細(xì)胞、IL-12與IL-18刺激后的NK細(xì)胞分泌IFNγ量比較不明顯,這表明了乙型肝炎病毒對(duì)NK細(xì)胞分泌IFNγ量無(wú)明顯影響。然而,CpG寡脫氧核酸刺激、皰疹病毒刺激后的pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞分泌IFNγ量均明顯高于單純pDC誘導(dǎo)NK細(xì)胞分泌IFNγ量,而單純pDC誘導(dǎo)NK細(xì)胞分泌IFNγ量又明顯高于乙型肝炎病毒刺激后的pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞分泌IFNγ量,這又提示了乙型肝炎病毒對(duì)pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞分泌IFNγ量具有明顯的抑制作用。分析原因,筆者認(rèn)為可能是乙型肝炎病毒通過(guò)和細(xì)胞接觸或分泌可溶性因子的途徑,進(jìn)一步發(fā)揮干擾NK細(xì)胞功能的作用,而不是通過(guò)進(jìn)入NK細(xì)胞內(nèi)的途徑影響其功能。此外,pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞以及乙型肝炎病毒刺激+pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞組的靶細(xì)胞K562死亡率均明顯高于純化NK細(xì)胞,而pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞與乙型肝炎病毒刺激+pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞組的靶細(xì)胞K562死亡率相比不明顯,這表明了純化的NK細(xì)胞對(duì)562靶細(xì)胞的殺傷活性較低,而在與pDC共同培養(yǎng)時(shí),其對(duì)562靶細(xì)胞的殺傷活性顯著增強(qiáng),且乙型肝炎病毒對(duì)NK細(xì)胞的殺傷毒性無(wú)明顯影響作用。另外,除了乙型肝炎病毒以外,還有一些病毒同樣具有抑制pDC對(duì)NK細(xì)胞的免疫誘導(dǎo)作用。其中HIV病毒可通過(guò)抑制pDC活化的NK細(xì)胞IFNγ分泌水平,而這一機(jī)制可能在其感染后的致病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[18,19]。另有研究報(bào)道顯示,人巨細(xì)胞病毒感染的pDC對(duì)NK細(xì)胞的殺傷活性無(wú)誘導(dǎo)作用[20,21]。

    綜上所述,乙型肝炎病毒對(duì)NK細(xì)胞的活性無(wú)激活作用,且會(huì)對(duì)pDC誘導(dǎo)活化NK細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用,從而促進(jìn)乙型肝炎病毒在機(jī)體內(nèi)的持續(xù)復(fù)制,提高患者發(fā)生持續(xù)感染的風(fēng)險(xiǎn)。值得臨床重點(diǎn)關(guān)注。

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