血紅素加氧酶1在頸動(dòng)脈重度狹窄支架植入術(shù)后的變化及意義

邱文娟，王建紅，王多姿，楊 樹，何 邦，袁曉帆，郭 蕾，郭富強(qiáng)，

(1.西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610072)

頸動(dòng)脈重度狹窄是臨床常見(jiàn)疾病，也是引起卒中的重要原因。神經(jīng)介入被認(rèn)為是最有效直接改善腦血流的手段廣泛用于臨床[1]。對(duì)于長(zhǎng)期慢性形成的血管重度狹窄，突然的灌注增加也會(huì)有不利的一面，氧化應(yīng)激、血管內(nèi)皮損傷、炎性反應(yīng)、過(guò)度灌注[2]。許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明血紅素加氧酶1(HO-1)在缺血再灌注后可以被誘導(dǎo)表達(dá)增加，發(fā)揮抗炎、抗氧化及抗凋亡作用[3]。本文通過(guò)測(cè)定健康人群和頸動(dòng)脈重度狹窄患者支架治療術(shù)前后HO-1、中性粒細(xì)胞-淋巴細(xì)胞比值的水平，分析HO-1在支架植入前后的變化情況，進(jìn)一步探討其與缺血再灌注的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料2017年12月至2018年4月四川省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的頸動(dòng)脈重度狹窄患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)過(guò)全腦血管造影(DSA)確診為頸動(dòng)脈重度狹窄(狹窄大于70%)。②符合頸動(dòng)脈狹窄介入治療操作規(guī)范(專家共識(shí))[4]：頸內(nèi)動(dòng)脈：> 70%且有癥狀；無(wú)癥狀的單側(cè)狹窄> 80%，雙側(cè)均狹窄> 70%；鎖骨下動(dòng)脈：鎖骨下動(dòng)脈狹窄(單側(cè)或雙側(cè))>70%；椎動(dòng)脈：椎動(dòng)脈狹窄(單側(cè)或者雙側(cè))≥70%。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾??；頸動(dòng)脈閉塞長(zhǎng)度> 10 mm或者多處狹窄；狹窄血管合并血管畸形、動(dòng)脈瘤；近期內(nèi)出現(xiàn)顱內(nèi)出血(3月內(nèi))或者大面積腦梗死(1月內(nèi))；造影劑過(guò)敏；合并嚴(yán)重心、肝、腎疾病。選取同時(shí)間段我院神經(jīng)內(nèi)科收治的無(wú)頸動(dòng)脈狹窄的患者為對(duì)照組。所有患者均簽署知情同意，并經(jīng)院倫理委員會(huì)通過(guò)。兩組基線資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組基線資料比較

1.2 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法①記錄研究對(duì)象的各種基線資料，包括性別、年齡、血管危險(xiǎn)因素(高血壓、糖尿病、冠心病、高血脂、吸煙、腦梗死病史)，所有病人均入院次日清晨空腹抽取肘靜脈血，常規(guī)檢查白細(xì)胞(WBC)、中性粒細(xì)胞(NEU)、淋巴細(xì)胞(LYM)、中性粒細(xì)胞-淋巴細(xì)胞比值(NLR)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、同型半胱氨酸、直接膽紅素(DBIL)、間接膽紅素(IBIL)、總膽紅素(TBIL)。②HO-1檢測(cè)方法：血液采集：采集觀察組患者術(shù)前、術(shù)后1天、術(shù)后3天空腹靜脈血4 ml，分離血清，-80 ℃低溫保存。對(duì)照組采用同樣方法制備標(biāo)本。將樣本和標(biāo)準(zhǔn)物分別加入含有HO-1抗體的試劑(Human HO-1 ELISA KIT(茁彩生產(chǎn)))微孔中，徹底洗滌，然后加入顯色物質(zhì)TMB，在此過(guò)程中顏色將由藍(lán)色變?yōu)樽詈蟮狞S色，樣品中HO-1含量越多，顏色越深。用酶標(biāo)儀(型號(hào)，Multlskan Mk3，賽默飛世爾儀器有限公司)在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，計(jì)算樣品濃度。③ HO-1計(jì)算：先繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本的OD值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中找出相應(yīng)的濃度×稀釋倍數(shù)=樣本的實(shí)際濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料：正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，偏態(tài)分布以M(Qu-QL)表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)比較采用方差分析及LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察組術(shù)前和對(duì)照組HO-1的比較觀察組術(shù)前HO-1水平(52.75±26.78)ng/ml與對(duì)照組(56.27±15.72)ng/ml比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.58，P= 0.566)。

2.2 觀察組術(shù)前術(shù)后血清HO-1濃度比較觀察組術(shù)前、術(shù)后第1天、術(shù)后第3天血清中HO-1水平分別為(52.75±26.78)、(80.18±43.01)、(100.36±45.23)ng/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=30.952，P<0.001)；術(shù)后第1天和第3天HO-1均較術(shù)前升高(P< 0.001)，術(shù)后第3天較術(shù)后第1天升高(P< 0.05)。

2.3 觀察組術(shù)前術(shù)后外周血血炎性細(xì)胞水平比較

術(shù)后NEU和NLR較術(shù)前升高(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 觀察組術(shù)前術(shù)后外周血炎性細(xì)胞水平比較

3 討論

頸動(dòng)脈重度狹窄是臨床常見(jiàn)疾病，也是引起腦卒中的重要原因。它可以導(dǎo)致認(rèn)知、情緒障礙以及頭暈、頭昏等癥狀，并伴有腦血流量的下降、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)損害以及雙側(cè)大腦半球之間的聯(lián)系性下降[5，6]，頸動(dòng)脈重度狹窄對(duì)腦血流的影響更大，單側(cè)頸動(dòng)脈重度狹窄CT灌注成像顯示，患側(cè)腦血流量、腦血容量較健側(cè)減少，患側(cè)腦組織血供不足，自身調(diào)節(jié)已不能完全代償[7]，而經(jīng)皮血管成形支架植入治療能夠直接緩解血管狹窄，改善腦部的血液供應(yīng)，創(chuàng)傷小，安全性可靠，因而被廣泛應(yīng)用于臨床[8]，本研究觀察組的44例頸動(dòng)脈重度狹窄患者均為出現(xiàn)臨床癥狀及疾病(頭暈、腦梗死)就診，經(jīng)過(guò)支架植入術(shù)治療，術(shù)后嚴(yán)格控制血壓及監(jiān)測(cè)生命體征，癥狀有所改善，術(shù)后無(wú)腦梗死、腦出血、再狹窄病例。

本研究對(duì)照組和觀察組術(shù)前HO-1水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，引起這種結(jié)果的原因可能與頸動(dòng)脈重度狹窄患者對(duì)慢性缺血的耐受及部分側(cè)支循環(huán)循環(huán)的建立有關(guān)，頸動(dòng)脈重度狹窄多為長(zhǎng)期慢性過(guò)程，目前關(guān)于HO-1在腦缺血方面的研究多見(jiàn)于動(dòng)物模型中的急性大腦中動(dòng)脈及頸總動(dòng)脈血管閉塞及再通[9～11]，目前尚缺乏其在頸動(dòng)脈重度狹窄及類似的慢性過(guò)程的變化依據(jù)，本研究結(jié)果顯示，HO-1在頸動(dòng)脈重度狹窄患者中水平和正常人差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示HO-1在慢性過(guò)程中無(wú)明顯變化，更多在于急性應(yīng)激，且與血壓、血糖、血脂、膽紅素?zé)o差異。

本研究發(fā)現(xiàn)，頸動(dòng)脈支架植入術(shù)后HO-1水平在第1天和第3天血清中含量均較術(shù)前明顯增加，提示支架植入術(shù)能改善大腦血流，再灌注的同時(shí)還能引起HO-1升高。慢性頸動(dòng)脈重度狹窄患者的血運(yùn)重建，血管內(nèi)皮損傷、血流量增加，可引起炎癥因子TNF-α，IL-6和IL-1β增加，它們相互作用[12]，產(chǎn)生細(xì)胞因子和粘附分子等炎癥介質(zhì)，損傷血管、神經(jīng)細(xì)胞[13]，除此以外，可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，導(dǎo)致進(jìn)一步的細(xì)胞功能障礙，細(xì)胞凋亡，甚至死亡。各種因素如術(shù)后高血壓，手術(shù)時(shí)間延長(zhǎng)，側(cè)支血流量減弱，狹窄的嚴(yán)重程度可能導(dǎo)致炎癥及應(yīng)激增加。而HO-1是誘導(dǎo)型酶，被證明在腦組織炎癥及氧化應(yīng)激時(shí)可升高[14]，發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用[15，16]，本研究支架植入術(shù)后HO-1水平升高，提示HO-1在頸動(dòng)脈重度狹窄支架植入術(shù)后的急性應(yīng)激中可能發(fā)揮了保護(hù)性的作用，這國(guó)外動(dòng)物及體外研究一致[17，18]。

本研究探討了支架植入術(shù)后不同時(shí)間的HO-1水平，結(jié)果顯示術(shù)后第3天HO-1較術(shù)前第1天升高，提示術(shù)后第3天HO-1水平發(fā)生了改變，有研究顯示在動(dòng)物缺血再灌注2 h，6 h和24 hHO-1的表達(dá)均增加，HO-1 mRNA水平和蛋白質(zhì)表達(dá)也增加[19]，本研究在人體頸動(dòng)脈重度狹窄支架植入術(shù)后第3天血清中測(cè)得HO-1水平較術(shù)后第1天增加，與國(guó)外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)X組織測(cè)得的HO-1水平增加相似[20]，由于本研究中無(wú)再灌注損傷患者，HO-1水平與再灌注損傷的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。

研究中還檢測(cè)了NLR，NLR作為一種新的炎性標(biāo)記物，正被越來(lái)越多的應(yīng)用于臨床研究中[21]，炎性反應(yīng)是缺血再灌注損傷的重要過(guò)程，而中性粒細(xì)胞在其中發(fā)揮著核心作用，內(nèi)皮損傷、氧化應(yīng)激可引起中性粒細(xì)胞的聚集、活化，釋放炎癥介質(zhì)、炎癥因子以及蛋白水解酶，從而引起內(nèi)皮損傷、血腦屏障破壞、神經(jīng)損害[22，23]，因此中性粒細(xì)胞可作為炎性反應(yīng)的指標(biāo)。研究顯示，在炎性反應(yīng)過(guò)程中，淋巴細(xì)胞的變化與中性粒細(xì)胞變化相反，淋巴細(xì)胞相對(duì)減少，為機(jī)體的保護(hù)性及調(diào)節(jié)指標(biāo)[24]，相比前兩者，NLR更能反映炎癥情況，具有更好的代表性。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得術(shù)后NLR較術(shù)前增加，顯示支架術(shù)后存在一定程度的炎性反應(yīng)，可能與術(shù)后血流量的突然改變及內(nèi)皮損傷有關(guān)，而炎性反應(yīng)可能作為誘導(dǎo)刺激引起具有保護(hù)作用的HO-1的增加，進(jìn)而發(fā)揮抗炎的作用。

本研究得出支架植入術(shù)能改善頸動(dòng)脈重度狹窄，血流再灌注后HO-1水平升高，但血清中HO-1增加可被其他系統(tǒng)性疾病及手術(shù)時(shí)間、術(shù)后血壓水平、感染、支架本身等影響，為減少干擾因素，本研究排除了一些常見(jiàn)其他慢性病及慢性血管重度狹窄對(duì)HO-1水平的影響，在篩選觀察組病例時(shí)排除了合并系統(tǒng)性疾病的病例(慢性阻塞性肺疾病、心肌梗死、不穩(wěn)定心絞痛、腦出血、自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病)，入組病例手術(shù)均順利，手術(shù)時(shí)間控制在40～60 min，術(shù)后均嚴(yán)格控制收縮壓120～140 mmHg，術(shù)前術(shù)后無(wú)明顯感染(肺部、顱內(nèi)、腹部、泌尿系統(tǒng)、皮膚等)，因此在一定程度上可反應(yīng)血流改善后的HO-1變化趨勢(shì)。

本研究中以頸動(dòng)脈重度狹窄患者為研究對(duì)象，通過(guò)支架植入術(shù)實(shí)現(xiàn)大腦缺血再灌注，并測(cè)定術(shù)前和術(shù)后血清HO-1水平，較國(guó)外利用動(dòng)物大腦中動(dòng)脈完全閉塞再通的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵约皬哪X組織中檢測(cè)HO-1水平的研究有所不同[25]，但研究結(jié)果與之相似，均測(cè)得HO-1水平較再灌注前升高，且有增高趨勢(shì)，可能存在時(shí)間依耐性。本研究不足之處在于，樣本量較少，無(wú)法排除支架本身的影響，未同步檢測(cè)涉及HO-1上游表達(dá)相關(guān)基因和蛋白及炎癥因子和氧化物質(zhì)變化情況，對(duì)于引起HO-1變化的分子機(jī)制未做研究。

綜上，通過(guò)頸動(dòng)脈重度狹窄患者動(dòng)脈介入治療可改善顱內(nèi)動(dòng)脈供血，從而升高患者保護(hù)性因子HO-1水平，可能是反映缺血再灌注損傷的指標(biāo)之一，其再灌注損傷的閾值有待進(jìn)一步研究。