露地和大棚條件下魚(yú)藤酮和印楝素在黃瓜和土壤中的殘留及消解動(dòng)態(tài)

陳 妍,劉新社

(商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 商丘 476000)

近年來(lái)，大棚蔬菜種植規(guī)模越來(lái)越大。黃瓜是大棚蔬菜主栽品種之一，由于其生長(zhǎng)速度快，采收間隔期短，致使農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)增大[1]。有研究表明，農(nóng)藥在大棚作物中的殘留量均高于露地，而我國(guó)農(nóng)藥殘留登記試驗(yàn)大多在露地條件下完成，得出的殘留數(shù)據(jù)和安全間隔期主要適用于露地環(huán)境[2-5]。因此，對(duì)比研究常用農(nóng)藥在露地和大棚條件下的消解殘留對(duì)保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全具有重要意義。

魚(yú)藤酮是用于蔬菜、果樹(shù)和茶葉的新型植物源殺蟲(chóng)劑，廣泛存在于魚(yú)藤屬植物的根皮部，因其高效低毒、廣譜、殺蟲(chóng)快、殘留時(shí)間短、害蟲(chóng)不易產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)，被視為較理想的殺蟲(chóng)劑[6]。近年來(lái)有研究表明，魚(yú)藤酮為強(qiáng)烈的神經(jīng)毒劑，與包括帕金森綜合癥在內(nèi)的一些疾病有關(guān)，且對(duì)水生生物有極高的毒性[7]。印楝素存在于印楝樹(shù)的種子、樹(shù)葉及樹(shù)皮中，具有對(duì)有害生物高效、對(duì)非靶標(biāo)生物安全、易分解、不污染環(huán)境等特點(diǎn)，是世界上公認(rèn)的理想植物殺蟲(chóng)劑[8]。目前，有關(guān)魚(yú)藤酮和印楝素在露地環(huán)境下的殘留及消解行為已有一些研究報(bào)道[9-19]，但尚未見(jiàn)有關(guān)2種藥劑在大棚蔬菜與露地蔬菜中殘留規(guī)律的比較研究，隨著魚(yú)藤酮和印楝素的廣泛應(yīng)用，開(kāi)展二者在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留檢測(cè)尤為重要。因此，采用乙腈提取、Florisil固相萃取柱凈化、高效液相色譜分析(HPLC)的方法，測(cè)定了魚(yú)藤酮和印楝素在露地和大棚2種栽培模式下黃瓜和土壤中的消解動(dòng)態(tài)和最終殘留，旨在闡明不同的栽培模式下，魚(yú)藤酮和印楝素在黃瓜及其土壤中的殘留差異，以期為魚(yú)藤酮和印楝素在露地和大棚蔬菜上的科學(xué)施用提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料

藥品與試劑：2.5%魚(yú)藤酮乳油購(gòu)自深圳市華農(nóng)生物工程有限公司；0.3%印楝素乳油購(gòu)自成都綠金生物科技有限責(zé)任公司；魚(yú)藤酮標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.5%)、印楝素標(biāo)準(zhǔn)品(純度95%)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為分析純。

儀器與設(shè)備：Agilent 1100液相色譜儀(配紫外檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、化學(xué)工作站)、FJ-200高速勻漿機(jī)(上海標(biāo)本模型廠)、FA2104電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)、高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)、BUCHIR-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)、SX-4-10馬弗爐(滬南電爐烘箱廠)、DC-12 氮吹儀配有DC-12H恒溫水浴鍋(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)及其他實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備。

供試作物：黃瓜品種為津優(yōu)2號(hào)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

于2018年在河南省商丘市同時(shí)進(jìn)行露地和大棚條件下的消解動(dòng)態(tài)和最終殘留試驗(yàn)。2塊地土質(zhì)、肥力等條件相似，常規(guī)栽培管理，露地和大棚同時(shí)種植黃瓜津優(yōu)2號(hào)。參照《農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》(NY/T 788—2004)[20]要求設(shè)置試驗(yàn)小區(qū)，每處理重復(fù)3次，小區(qū)面積為20 m2，各小區(qū)之間設(shè)置保護(hù)行，設(shè)空白對(duì)照處理。黃瓜樣品：采用隨機(jī)的方法在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)不同方向及上下不同部位采集6條以上 (不少于2 kg) 生長(zhǎng)正常、無(wú)病害、成熟的黃瓜果實(shí)；土壤樣品：5點(diǎn)法取樣，使用專(zhuān)用土壤采樣鏟，采樣深度為0～15 cm (消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)0～10 cm)，每小區(qū)采樣不少于1 kg。土壤在挑出石塊、草根等雜物后混勻，自然風(fēng)干，用縮分法縮分后取四分之一儲(chǔ)存；對(duì)于黃瓜樣品，用不銹鋼刀切成1 cm大小的碎塊，在不銹鋼盆中充分混勻，四分法縮分，取2份150 g的樣品，分別裝入封口袋中儲(chǔ)存。將樣品冷藏在-20 ℃冷庫(kù)中，全部用聚乙烯塑料袋包裝，待測(cè)。

1.2.1 消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn) 2.5%魚(yú)藤酮乳油和0.3%印楝素乳油，分別按有效成分84.375(推薦高劑量的1.5倍)、40.50 g/hm2(推薦高劑量的10倍)的劑量，于黃瓜果實(shí)生長(zhǎng)至成熟個(gè)體約1/2大小時(shí)對(duì)水均勻噴霧1次，分別于施藥后1、6 h和1、2、3、5、7、10、14 d采集黃瓜樣品，測(cè)定黃瓜中魚(yú)藤酮和印楝素的殘留量。另外，在露地和大棚的試驗(yàn)地塊，分別選20 m2表面平整、墑情良好的空地，按上述劑量加水稀釋后對(duì)地表進(jìn)行噴霧，于施藥后1、6 h和1、2、3、5、7、10、14 d采集土壤樣品，測(cè)定土壤中魚(yú)藤酮和印楝素的殘留量。

1.2.2 最終殘留試驗(yàn) 采用2.5%魚(yú)藤酮乳油和0.3%印楝素乳油，設(shè)低劑量56.25、4.05 g/hm2(推薦高劑量)和高劑量84.375、6.075 g/hm2(高劑量的1.5倍)分別施藥2次和3次，施藥間隔期為6 d。于黃瓜果實(shí)生長(zhǎng)初期施藥，按施藥劑量從低到高均勻噴霧，于最后一次施藥后3、5、7 d采集黃瓜和土壤樣品，測(cè)定魚(yú)藤酮和印楝素的殘留量。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品提取與凈化

1.3.1.1 黃瓜 準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0 g黃瓜樣品于100 mL離心管中，加入30 mL乙腈溶液，高速勻漿2 min后，加入3 g氯化鈉，渦旋1 min，4 000 r/min離心5 min，然后靜置40 min，使乙腈相和水相分層。取15 mL有機(jī)相于100 mL梨形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮 (40 ℃)近干，用正己烷定容至2 mL，待凈化。

預(yù)先用5.0 mL正己烷活化Florisil固相萃取柱，將上述黃瓜樣品濃縮液轉(zhuǎn)入柱內(nèi)，待樣液全部通過(guò)Florisil柱后，依次用8 mL正己烷-丙酮(體積比7∶3)、8 mL正己烷-丙酮(體積比6∶4)淋洗，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮(40 ℃)近干，用甲醇定容到2 mL，過(guò)0.22 μm濾膜，待HPLC檢測(cè)。

1.3.1.2 土壤 準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0 g土壤樣品于100 mL離心管中，加入50 mL乙腈溶液，高速勻漿3 min后，加入5 g氯化鈉，渦旋2 min，4 000 r/min離心5 min，然后靜置40 min，使乙腈相和水相分層。取25 mL有機(jī)相于100 mL梨形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮 (40 ℃)近干，用甲醇定容至2 mL，過(guò)0.22 μm濾膜，待HPLC檢測(cè)。

1.3.2 HPLC檢測(cè)條件 色譜柱：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 μm，5 μm)；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；魚(yú)藤酮洗脫條件：等濃度洗脫，V乙腈∶V水=70∶30，檢測(cè)波長(zhǎng)299 nm；印楝素洗脫條件：等濃度洗脫，V乙腈∶V水=40∶60，檢測(cè)波長(zhǎng)217 nm；定量方式采用外標(biāo)法。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取魚(yú)藤酮、印楝素各10 mg(精確至0.01 mg)，用甲醇溶解并定容至100 mL，配成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)母液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取適量的標(biāo)準(zhǔn)母液用甲醇稀釋成5、1、0.5、0.1、0.05、0.01 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.2中儀器條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 添加回收試驗(yàn) 在空白黃瓜、土壤樣品中進(jìn)行3個(gè)水平(分別0.01、0.1、0.5 mg/kg)的添加回收試驗(yàn)，每一添加水平做5個(gè)平行，按照1.3.1中樣品的提取、凈化方法進(jìn)行處理，另設(shè)空白對(duì)照，按照1.3.2中檢測(cè)條件測(cè)定魚(yú)藤酮和印楝素在黃瓜和土壤中的添加回收率。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 采用一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程式(Ct=C0e-kt)計(jì)算魚(yú)藤酮和印楝素在黃瓜或土壤中的殘留量，半衰期(T1/2)=ln2/k。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚(yú)藤酮和印楝素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖1、2可知，在0.01～5 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，魚(yú)藤酮和印楝素峰面積(y)與質(zhì)量濃度(x)呈良好線性關(guān)系，魚(yú)藤酮標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=19 890x+807.12(r2=0.999 3),印楝素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=7 484.4x+90.734(r2=0.999 8)，能夠滿足外標(biāo)法定量檢測(cè)魚(yú)藤酮和印楝素殘留量的要求。

圖1 魚(yú)藤酮標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig.1 Standard curve of rotenone

圖2 印楝素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of azadirachtin

2.2 HPLC法測(cè)定魚(yú)藤酮和印楝素的靈敏度、準(zhǔn)確度及精密度

根據(jù)添加回收率試驗(yàn)結(jié)果(表1)，在1.3.2中的儀器條件下，魚(yú)藤酮和印楝素在黃瓜和土壤中的最低檢出濃度均為0.01 mg/kg，最小檢出量均為0.036 ng。在0.01、0.1、0.5 mg/kg添加水平下，魚(yú)藤酮和印楝素在黃瓜中的平均回收率分別為94.7%～96.7%、94.1%～94.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.4%～5.5%、2.8%～4.2%；在土壤中的平均回收率分別為95.7%～99.5%、92.5%～99.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.5%～6.9%、2.5%～6.0%。該方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均符合國(guó)家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》(NY/T 788—2004)[20]的要求，能夠用于實(shí)際樣本的殘留量檢測(cè)分析。

表1 魚(yú)藤酮和印楝素在黃瓜和土壤中的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Tab.1 Recovery rate and relative standard deviation (RSD) for rotenone and azadirachtin in cucumber and soil (n=5)

2.3 魚(yú)藤酮和印楝素在黃瓜中的消解動(dòng)態(tài)

黃瓜中消解動(dòng)態(tài)測(cè)定結(jié)果(表2)表明，露地和大棚黃瓜中的魚(yú)藤酮和印楝素殘留量隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低，且二者的殘留降解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程Ct=C0e-kt。施藥后1 h，魚(yú)藤酮在露地和大棚黃瓜中的原始沉積量分別為0.632 4、0.732 4 mg/kg，其消解動(dòng)力學(xué)方程分別為C=0.512 3e-0.476 8t、C=0.580 6e-0.399 0t，R2分別為0.929 8、0.977 0，消解半衰期分別為1.45、1.74 d；印楝素在露地和大棚黃瓜中的原始沉積量分別為0.823 6、1.107 2 mg/kg，其消解動(dòng)力學(xué)方程分別為C=1.043 2e-0.625 6t、C=1.463 6e-0.511 4t，R2分別為0.982 5、0.918 8，消解半衰期分別為1.11、1.36 d。露地黃瓜中魚(yú)藤酮和印楝素原始沉積量均低于大棚，而大棚黃瓜中魚(yú)藤酮和印楝素的半衰期均長(zhǎng)于露地。

表2 魚(yú)藤酮和印楝素在黃瓜中的消解動(dòng)態(tài)Tab.2 Degradation dynamics of rotenone and azadirachtin in cucumber

注：C是殘留量，t是施藥后時(shí)間，T1/2是消解半衰期；ND表示未檢出(即樣品中魚(yú)藤酮和印楝素殘留量低于方法最低檢出濃度)。下同。

Note:Cis the residue,tis the time after pesticide application, andT1/2is the half-life; ND means that the pesticides are not detected (i.e. the residues of rotenone and azadirachtin in the samples are lower than the minimum detected concentration).The same as below.

2.4 魚(yú)藤酮和印楝素在土壤中的消解動(dòng)態(tài)

土壤中消解動(dòng)態(tài)測(cè)定結(jié)果(表3)表明，露地和大棚土壤中的魚(yú)藤酮和印楝素殘留量隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低，且二者的殘留降解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程Ct=C0e-kt。施藥后1 h，魚(yú)藤酮在露地和大棚土壤中的原始沉積量分別為0.552 4、0.665 1 mg/kg，其消解動(dòng)力學(xué)方程分別為C=0.383 9e-0.293 9t、C=0.262 5e-0.264 7t，R2分別為0.963 2、0.863 9，消解半衰期分別為2.36、2.62 d；印楝素在露地和大棚土壤中的原始沉積量分別為0.328 7、0.376 3 mg/kg，其消解動(dòng)力學(xué)方程分別為C=0.357 7e-0.372 4t、C=0.379 2e-0.317 8t，R2分別為0.971 4、0.959 2，消解半衰期分別為1.86、2.18 d。露地土壤中魚(yú)藤酮和印楝素原始沉積量均低于大棚，而大棚土壤中魚(yú)藤酮和印楝素的半衰期均長(zhǎng)于露地。

表3 魚(yú)藤酮和印楝素在土壤中的消解動(dòng)態(tài)Tab.3 Degradation dynamics of rotenone and azadirachtin in soil

2.5 魚(yú)藤酮和印楝素在黃瓜和土壤中的最終殘留量

由表4可知，無(wú)論大棚或露地，黃瓜和土壤中魚(yú)藤酮的最終殘留量隨施藥劑量、施藥次數(shù)的增加而增加，隨采樣時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，并且大棚黃瓜和土壤中魚(yú)藤酮的殘留量稍高于露地。2.5%魚(yú)藤酮乳油按推薦劑量56.25 g/hm2和1.5倍推薦劑量84.375 g/hm2分別施藥2～3次，末次施藥后3 d，露地采收的黃瓜和土壤中魚(yú)藤酮的最高殘留量分別是0.136 8、0.157 6 mg/kg，大棚采收的黃瓜和土壤中魚(yú)藤酮的最高殘留量分別是0.203 1、0.214 4 mg/kg；末次施藥后5 d，露地采收的黃瓜和土壤中魚(yú)藤酮的最高殘留量分別是0.065 2、0.073 2 mg/kg，大棚采收的黃瓜和土壤中魚(yú)藤酮的最高殘留量分別是0.084 1、0.102 1 mg/kg；末次施藥后7 d，露地采收的黃瓜和土壤中魚(yú)藤酮的最高殘留量分別是0.017 4、0.023 2 mg/kg，大棚采收的黃瓜和土壤中魚(yú)藤酮的最高殘留量分別是0.020 1、0.028 9 mg/kg。

由表4還可知，0.3%印楝素乳油按推薦劑量4.05 g/hm2和1.5倍推薦劑量6.075 g/hm2分別施藥2～3次，末次施藥后3、5、7 d露地和大棚采收的黃瓜和土壤中印楝素的殘留量均未檢出(即樣品中印楝素的殘留量低于方法最低檢出濃度)。

表4 魚(yú)藤酮和印楝素在黃瓜和土壤中的最終殘留量Tab.4 Final residues of rotenone and azadirachtin in cucumber and soil

續(xù)表4 魚(yú)藤酮和印楝素在黃瓜和土壤中的最終殘留量Tab.4(Continued) Final residues of rotenone and azadirachtin in cucumber and soil

3 結(jié)論與討論

本研究建立了黃瓜和土壤中魚(yú)藤酮和印楝素殘留的簡(jiǎn)便檢測(cè)方法，試驗(yàn)結(jié)果表明，黃瓜和土壤中魚(yú)藤酮和印楝素經(jīng)乙腈提取、Florisil固相萃取柱凈化、甲醇定容后，HPLC檢測(cè)，外標(biāo)法定量，在0.01、0.1、0.5 mg/kg添加水平下，魚(yú)藤酮和印楝素在黃瓜和土壤中的平均回收率為92.5%～99.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%～6.9%，魚(yú)藤酮和印楝素在黃瓜和土壤中的最低檢出濃度均為0.01 mg/kg，最小檢出量均為0.036 ng。由此可見(jiàn)，本研究采用的提取、測(cè)定方法能滿足魚(yú)藤酮和印楝素在黃瓜和土壤上的分析要求，因HPLC儀器價(jià)格較LC-MS低，故適合日常、大批量樣品的檢測(cè)。

魚(yú)藤酮在露地和大棚黃瓜中的原始沉積量分別為0.632 4、0.732 4 mg/kg，土壤中的原始沉積量分別為0.552 4、0.665 1 mg/kg，印楝素在露地和大棚黃瓜中的原始沉積量分別為0.823 6、1.107 2 mg/kg，土壤中的原始沉積量分別為0.328 7、0.376 3 mg/kg；魚(yú)藤酮在黃瓜和土壤中的半衰期分別為1.45、2.36 d(露地) 和1.74、2.62 d(大棚)，印楝素在黃瓜和土壤中的半衰期分別為1.11、1.86 d(露地) 和1.36、2.18 d(大棚)。露地黃瓜和土壤中魚(yú)藤酮和印楝素的原始沉積量均分別低于大棚，大棚黃瓜和土壤中的魚(yú)藤酮和印楝素的半衰期均長(zhǎng)于露地。這可能是由于在露地條件下施藥，風(fēng)等外力作用使藥液發(fā)生飄移，進(jìn)而減少藥液在黃瓜和土壤上的原始沉積量，另外，與露地環(huán)境相比，大棚內(nèi)環(huán)境相對(duì)封閉，空氣流通緩慢，施藥后藥液不易揮發(fā)散失，殘存農(nóng)藥易吸附或降落到作物表面，加之大棚塑料薄膜隔離光照和雨水，不利于農(nóng)藥的消解，這與丁悅等[21]對(duì)啶蟲(chóng)脒的研究結(jié)果相吻合。由此看來(lái)，露地和大棚不同栽培模式下作物的生長(zhǎng)環(huán)境不同，農(nóng)藥的消解半衰期也有所差異，用露地環(huán)境下所得的最大殘留限量(MRL)來(lái)指導(dǎo)大棚作物生產(chǎn)存在一定的風(fēng)險(xiǎn)[3，5]。

采收期距最后一次施藥3～7 d時(shí)，露地和大棚采收的黃瓜樣品中魚(yú)藤酮的最高殘留量分別為0.136 8、0.203 1 mg/kg，均低于我國(guó)規(guī)定的魚(yú)藤酮在甘藍(lán)中的MRL值0.5 mg/kg[20]。因此，2.5%魚(yú)藤酮乳油用于露地或大棚黃瓜時(shí)，按施藥劑量56.25～84.375 g/hm2施藥2～3次，安全間隔期為3 d，此時(shí)黃瓜中魚(yú)藤酮的殘留量符合國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)的要求，其在黃瓜上使用安全。

采收期距最后一次施藥3～7 d時(shí)，露地和大棚采收的黃瓜和土壤中印楝素的殘留量均未檢出(即樣品中印楝素的殘留量低于方法最低檢出濃度)。分析其原因可能有二：一是因?yàn)?.3%印楝素乳油中印楝素有效成分含量較低，僅0.3%；二是按1.5倍推薦劑量6.075 g/hm2對(duì)露地和大棚黃瓜施藥，印楝素原始沉積量較低，且消解很快。此外，本研究最初按1.5倍推薦劑量6.075 g/hm2對(duì)露地和大棚黃瓜施藥，1 d后印楝素的殘留量已經(jīng)低于最低檢出濃度而檢測(cè)不出，為了解印楝素在黃瓜上的殘留降解行為，把施藥劑量增大到40.50 g/hm2(推薦高劑量的10倍)，研究得出印楝素在黃瓜和土壤中的消解半衰期為1.11～2.18 d，這與楊曉云等[14]報(bào)道的用2倍推薦劑量對(duì)甘藍(lán)施藥，6 h后未檢出印楝素，當(dāng)把施藥劑量增大10倍，得出印楝素在甘藍(lán)中的消解半衰期為0.89 d的研究結(jié)果一致。我國(guó)規(guī)定印楝素在甘藍(lán)上的MRL值為0.1 mg/kg(臨時(shí)限量)[22]，因此，0.3%印楝素乳油用于露地或大棚黃瓜時(shí)，按施藥劑量4.05～6.075 g/hm2施藥2～3次，推薦安全間隔期為3 d，此時(shí)黃瓜中印楝素的殘留量符合國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)的要求，其在黃瓜上使用安全。