響應(yīng)面法優(yōu)化殼聚糖對(duì)三七莖葉皂苷提取液除雜工藝的影響

秦 楓,朱善元,李金貴,辛雪梅,王安平,吳 雙

(1.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225009; 2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院/江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 泰州 225300)

三七(Panaxnotoginseng)莖葉主要用于化瘀消腫、鎮(zhèn)痛止血等,在我國云南及東南亞國家有將其作為茶飲料及食用的習(xí)慣,亦可做成藥膳用以保健、養(yǎng)生[1-3]。三七莖葉主要成分為皂苷,含有人參皂苷Rb3、C-Mx1、Rc、Rb1及三七皂苷R1、Fa等幾十種皂苷[4-5]。GUO等[6]從三七莖葉中分離得到了54個(gè)組分,其中，25個(gè)組分中富含皂苷。皂苷具有治療酒精肝[7]、肥胖癥[8]及抑制芳香化酶活性[9]等作用,對(duì)心腦血管疾病的治療效果顯著。

三七莖葉作為三七的非藥用部位,價(jià)格低廉,常被作為廢棄物處理,若研究其提取工藝,并對(duì)其進(jìn)行綜合開發(fā)利用,可變廢為寶。在三七莖葉皂苷分離過程中發(fā)現(xiàn),莖葉中所含淀粉、蛋白質(zhì)等物質(zhì)會(huì)對(duì)活性成分分離帶來很大困擾,一般提取工藝多采用水煎醇沉法除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì),但要消耗大量乙醇,不僅成本高,而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力,還會(huì)造成有效成分流失。殼聚糖是天然陽離子型絮凝劑,具有優(yōu)良的絮凝效果。目前,雖有一些殼聚糖澄清三七莖葉水煎液的相關(guān)報(bào)道[10],但其考察因素較少,試驗(yàn)設(shè)計(jì)比較簡(jiǎn)單。與正交設(shè)計(jì)相比,響應(yīng)面法可以設(shè)計(jì)非線性模型,創(chuàng)建二次回歸方程,具有試驗(yàn)設(shè)計(jì)更全面、預(yù)測(cè)精度更高的優(yōu)點(diǎn)。鑒于此,本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化殼聚糖用于三七莖葉皂苷提取液除雜工藝,為三七莖葉皂苷進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)用藥物

三七莖葉、殼聚糖、香草醛等均購自揚(yáng)州科能生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 三七莖葉皂苷提取液制備 稱取三七莖葉200 g,置于燒杯中,以10倍的蒸餾水加熱回流提取3次。第1次加熱回流2 h,第2、3次加熱回流各1.5 h。每次以綢布趁熱過濾掉殘?jiān)?合并提取液,濃縮,定容至500 mL,即為三七莖葉皂苷提取液。此時(shí),藥液質(zhì)量體積比[生藥質(zhì)量(g)∶提取液體積(mL)]為1∶2.5。

1.2.2 殼聚糖溶液制備 稱取殼聚糖 10.0 g,先以少量l%醋酸攪拌至糊狀,再定容至1 000 mL。溶脹24 h以上,攪拌均勻,即為1%殼聚糖溶液,備用[11]。

1.2.3 皂苷對(duì)照品溶液配制與標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 將三七皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)品在60 ℃下干燥至恒質(zhì)量,取2.51 mg置于容量瓶中,以甲醇溶解,定容至25 mL,搖勻,得對(duì)照品溶液,質(zhì)量濃度為0.100 4 mg/mL。參照文獻(xiàn)[12]的方法,采用香草醛-高氯酸法測(cè)定皂苷質(zhì)量濃度,并制備標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]。

1.2.4 固形物去除率測(cè)定 精密量取澄清前、澄清后的提取液各15 mL,放在已經(jīng)干燥處理好的蒸發(fā)皿中,置于105 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干3 h,之后置于37 ℃恒溫干燥箱中冷卻30 min,快速稱質(zhì)量,計(jì)算固形物去除率(E1)。E1=(澄清前固形物質(zhì)量-澄清后固形物質(zhì)量)/澄清前固形物質(zhì)量×100%。

1.2.5 皂苷保留率測(cè)定 分別取澄清前、澄清后的提取液,按照1.2.3中的方法進(jìn)行皂苷保留率測(cè)定(E2)。E2=澄清后皂苷質(zhì)量/澄清前皂苷質(zhì)量×100%。

1.2.6 綜合評(píng)分計(jì)算 提取液中加入澄清劑進(jìn)行除雜,不僅需要最大限度地減少皂苷有效成分的損失,還要保證良好的澄清效果,因此,同時(shí)選擇E1和E2作為評(píng)價(jià)性指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分。將E1的權(quán)重設(shè)定為0.3,E2的權(quán)重設(shè)定為0.7,按下列公式計(jì)算綜合評(píng)分(OD)。OD=E1/E1max×0.3+E2/E2max×0.7[13]。

1.3 除雜工藝單因素考察

1.3.1 藥液質(zhì)量體積比對(duì)除雜效果影響 按單因素設(shè)計(jì)試驗(yàn),分別以A、B、C、D代表藥液質(zhì)量體積比、殼聚糖用量、作用溫度、攪拌時(shí)間。固定B為0.8 mL/g,取適量三七莖葉皂苷提取液原液,分別稀釋成藥液質(zhì)量體積比為1∶5、1∶6、1∶8、1∶10的提取液,每份20 mL,在50 ℃條件下加入殼聚糖溶液,充分?jǐn)嚢?0 min,置于水浴鍋中50 ℃保溫1 h。之后,在室溫下靜置12 h,離心,過濾,定容至25 mL,測(cè)定E1以及E2。

1.3.2 殼聚糖用量、作用溫度、攪拌時(shí)間考察 設(shè)定A為1∶6、C為50 ℃、D為20 min,考察B分別為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL/g時(shí)對(duì)E1、E2和OD的影響；設(shè)定A為1∶6、B為0.8 mL/g、D為20 min,考察C分別為40、50、60、70、80 ℃ 時(shí)對(duì)E1、E2和OD的影響；設(shè)定A為1∶6、B為0.8 mL/g、C為50 ℃,考察D分別為10、20、30、40、60 min時(shí)對(duì)E1、E2和OD的影響。

1.4 響應(yīng)面法優(yōu)化方法設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Design-Expert 8.0.6設(shè)計(jì)原理,將A、B、C作為自變量,進(jìn)行試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì),詳見表1。

表1 響應(yīng)面法優(yōu)化殼聚糖對(duì)三七莖葉皂苷提取液除雜工藝的分析因素和水平Tab.1 Factors and levels of response surface methodology to the purifying technology of the saponin extract of leaves and stems of Panax notoginseng with chitosan

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化殼聚糖對(duì)三七莖葉皂苷提取液除雜工藝標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.369 5x-0.070 9,R=0.993 8。其中,y為吸光度,x為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度。結(jié)合1.2.3可知,x介于0.008 37～0.050 20 mg/mL,存在良好線性關(guān)系。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化殼聚糖對(duì)三七莖葉皂苷提取液除雜工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

A、B、C、D對(duì)殼聚糖除雜效果的影響見表2—5。隨著A的降低,OD值呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)。B為0.8、1.4、1.6 mL/g時(shí)，OD值比較大。隨著C的增加,OD值出現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)。D達(dá)到20 min之后,不同攪拌時(shí)間對(duì)OD值的影響無明顯規(guī)律，且OD值較小。綜上,認(rèn)為A、B、C對(duì)OD值的影響較大。結(jié)合提取效率及工業(yè)生產(chǎn)的需要,將A設(shè)為1∶5、1∶6、1∶7,共3個(gè)水平,將B、C分別設(shè)為1.0 mL/g、60 ℃,建立模型。

表2 藥液質(zhì)量體積比對(duì)三七莖葉皂苷提取液除雜效果的影響Tab.2 Effect of mass-volume ratio of medicine to extract liquid on the purification of the saponin extract of leaves and stems of Panax notoginseng

表3 殼聚糖用量對(duì)三七莖葉皂苷提取液除雜效果的影響Tab.3 Effect of chitosan dosage on the purification of the saponin extract of leaves and stems of Panax notoginseng

表4 作用溫度對(duì)三七莖葉皂苷提取液除雜效果的影響Tab.4 Effect of acting temperature on the purification of the saponin extract of leaves and stems of Panax notoginseng

表5 攪拌時(shí)間對(duì)三七莖葉皂苷提取液除雜效果的影響Tab.5 Effect of stirring time on the purification of the saponin extract of leaves and stems of Panax notoginseng

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化殼聚糖對(duì)三七莖葉皂苷提取液除雜工藝試驗(yàn)與分析

2.3.1 響應(yīng)面法優(yōu)化殼聚糖對(duì)三七莖葉皂苷提取液除雜工藝模型的建立及方差分析 以A、B、C為考察因素,以 OD 作為評(píng)價(jià)指標(biāo),按照三因素三水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行試驗(yàn)。每個(gè)因素按1.4中的方法設(shè)置3個(gè)水平,試驗(yàn)按1.3.1中的方法進(jìn)行,響應(yīng)面分析方案及結(jié)果見表6,方差分析結(jié)果見表7。將所得數(shù)據(jù)以Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行分析,得響應(yīng)值(Y)對(duì)編碼自變量的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=81.32-1.77A-2.35B+17.69C+0.60AB+0.30AC-1.14BC-2.69A2+1.11B2-17.53C2。

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。由表7可得,模型的F值為8.96,P=0.004 3。P<0.01,表明達(dá)到極顯著水平。模型的確定系數(shù)為0.817 5,說明方程的因變量與全體自變量間線性關(guān)系顯著,響應(yīng)值的變化有81.75%來源于所選自變量。同時(shí),模型失擬項(xiàng)F值為0.28,P>0.05,可知失擬項(xiàng)不顯著,表明該方程試驗(yàn)誤差小,擬合較好。由此可知,擬合的回歸方程良好,故可用回歸模型代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。對(duì)響應(yīng)值影響顯著的因素是C和C2,AB、AC、BC不顯著,說明溫度對(duì)響應(yīng)值的影響較大,各因素之間無明顯交互作用。

2.3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化殼聚糖對(duì)三七莖葉皂苷提取液除雜工藝的等高線及響應(yīng)面結(jié)果與分析 根據(jù)二次多項(xiàng)回歸方程,分別固定因素C,取值 50 ℃；固定因素B,取中間值1.0 mL/g；固定因素A,取中間值1∶6,作AB、AC、BC之間的等高線圖和響應(yīng)面圖(圖1)。

表6 響應(yīng)面法優(yōu)化殼聚糖對(duì)三七莖葉皂苷提取液的除雜工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.6 Design and results of response surface methodology to the purifying technology of the saponin extract of leaves and stems of Panax notoginseng with chitosan

表7 響應(yīng)面法優(yōu)化殼聚糖對(duì)三七莖葉皂苷提取液的除雜工藝方差分析Tab.7 Analysis of variance in response surface methodology to the purifying technology of the saponin extract of leaves and stems of Panax notoginseng with chitosan

注：**為極顯著(P<0.01)。

Note: ** was extremely significant (P<0.01).

響應(yīng)面的陡峭程度反映了不同試驗(yàn)因素對(duì)結(jié)果的影響程度,響應(yīng)面越陡峭,說明該因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響越大。反之,則對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響越小。由圖1a1可知,AB之間作用平緩。由圖1b1、1c1可知,固定A、B其中任何1個(gè)因素,其OD值均隨著因素C的增高而呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì),但響應(yīng)面變化比較平緩,說明3個(gè)因素之間不存在交互作用,其中,因素C對(duì)結(jié)果影響極顯著。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化的殼聚糖對(duì)三七莖葉皂苷提取液除雜最佳提取工藝條件

由Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行嶺脊分析,用回歸模型進(jìn)行預(yù)測(cè),得出最佳工藝條件,其中,A為1∶6.25,B為0.80 mL/g,C為65.34 ℃。根據(jù)實(shí)際工藝條件操作的可行性和簡(jiǎn)易性,修正了各工藝條件,其中,A為1∶6,B為 0.80 mL/g,C為 65 ℃。為了解預(yù)測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性,在此工藝條件下進(jìn)行三七莖葉皂苷提取液除雜工藝的驗(yàn)證,重復(fù)3次試驗(yàn),結(jié)果見表8。E1為26.09%,E2為96.10%,其RSD分別為1.54%、0.69%,表明該模型有效,該方程能夠客觀地反映各因素對(duì)三七莖葉皂苷提取液除雜效果的影響。

a1、b1、c1：響應(yīng)面；a2、b2、c2：響應(yīng)面對(duì)應(yīng)的等高線a1,b1,c1: Response surface; a2,b2,c2: Contour corresponding to response surface圖1 各試驗(yàn)因素對(duì)三七莖葉皂苷提取液除雜效果的影響Fig.1 Effects of experimental factors on the purification of the saponin extract of leaves and stems of Panax notoginseng

表8 響應(yīng)面法優(yōu)化殼聚糖對(duì)三七莖葉皂苷提取液的除雜工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.8 Verification test results of the purifying technology of the saponin extract of leaves and stems of Panax notoginseng with chitosan

3 結(jié)論與討論

本研究采用的響應(yīng)面法是由BOX等[14]提出的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,其將試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模進(jìn)行優(yōu)化,回歸擬合整體因素與結(jié)果的函數(shù)關(guān)系,取得各因素最優(yōu)水平值[15]。該方法具有試驗(yàn)周期短、試驗(yàn)次數(shù)少、精密度高等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、制藥、化工等領(lǐng)域[16-18]。正交試驗(yàn)不能在獲得因素和響應(yīng)值之間找到明確的函數(shù)表達(dá)式,無法獲得最優(yōu)方案和最優(yōu)值,而且水平數(shù)較多時(shí),試驗(yàn)次數(shù)多,實(shí)施比較困難。本研究以三七莖葉為原料,采用殼聚糖除雜工藝,在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用 Design-Expert 8.0.6軟件,通過響應(yīng)面法對(duì)三七莖葉殼聚糖除雜工藝進(jìn)行了優(yōu)化,得出最佳工藝條件,其中,A為1∶6,B為 0.80 mL/g,C為 65 ℃。回歸分析表明,該回歸模型具有較高的準(zhǔn)確性和可信度,可用于三七莖葉皂苷提取液殼聚糖除雜的預(yù)測(cè)與分析。

關(guān)于三七莖葉的提取除雜已有相關(guān)的報(bào)道,潘育方等[10]應(yīng)用澄清劑殼聚糖,對(duì)三七莖葉粗粉的煎煮液進(jìn)行澄清條件試驗(yàn),得到最佳工藝：在室溫下,將殼聚糖(用量為0.075 g/100 mL)加入三七水提液中進(jìn)行絮凝。張志信等[19]應(yīng)用明膠,以黃酮質(zhì)量濃度為指標(biāo),對(duì)三七莖葉水提取液進(jìn)行澄清條件試驗(yàn),得到最佳提取工藝：澄清劑的添加量為提取液體積的0.9%,靜置2 d,pH值調(diào)節(jié)為6,溫度為室溫。李維莉等[20]采用酸水提取法提取三七葉苷,以膜-樹脂聯(lián)用技術(shù)分離純化三七葉苷,對(duì)純化的幾種方法如自然沉降法、水煎醇沉法、ZTC 1+ 1Ⅱ型天然澄清劑法、無機(jī)陶瓷膜微濾法、無機(jī)陶瓷膜-樹脂法進(jìn)行考察。結(jié)果表明,采用無機(jī)陶瓷膜分離與HPD 100大孔吸附樹脂聯(lián)用技術(shù)效果較好。從除雜率來看,上述各種方法都有純化作用,以膜-樹脂法為最高,達(dá)80%以上。從損失率看,水煎醇沉法的損失率最高,在30%左右。上述研究報(bào)道均未通過相關(guān)試驗(yàn)建立模型并進(jìn)行驗(yàn)證,其研究的工藝是否最佳缺乏充分依據(jù)。雖然均以澄清度、除雜率或有效成分質(zhì)量濃度為檢測(cè)指標(biāo),但均未采用綜合評(píng)分作為考查指標(biāo),結(jié)果判定缺乏周密性。雖然膜分離方法取得了較好的效果,但濾膜抗污染能力弱,使用壽命短,不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本研究采用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)條件,使皂苷保留率大于96%,固形物去除率高于20%,優(yōu)于上述大部分研究。

綜上所述,按照本研究所建立模型最佳工藝進(jìn)行試驗(yàn),固形物去除率和皂苷保留率均較高,且RSD較小,重現(xiàn)性較好,證明了該模型切實(shí)有效。此模型的建立,可為三七莖葉皂苷的提取精制及工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的參考,為三七莖葉的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。