秦巴硒菇提取物對人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721增殖與凋亡的調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究

李 娟，袁作輝，楊 帆，王倩鳳

（甘肅省人民醫(yī)院干部病房，甘肅 蘭州 730000）

肝癌是起源于肝臟的上皮或間葉組織的惡性腫瘤[1]，近年來肝癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)均有增加的趨勢[2]，據(jù)2018年全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年全球癌癥死亡率最高的五大癌癥中就包括肝癌[3-4]，肝癌新增人數(shù)達(dá)841 080例，占比4.7%，肝癌死亡人數(shù)781 631，占比8.2%，肝癌在我國尤為高發(fā)，是造成我國癌癥死亡的第四大原因[5-7]，肝癌死亡率是僅次于胃癌和食管癌的第三大消化系統(tǒng)惡性腫瘤[8-9]，并且其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。肝癌的早期發(fā)病隱匿，病程進(jìn)展至中后期會迅速侵襲轉(zhuǎn)移，惡性程度較高，目前臨床上進(jìn)行手術(shù)切除和肝移植以及術(shù)后聯(lián)合放化療是治療的主要手段[10-12]，但僅有30%的肝癌患者適合手術(shù)治療，但因超過80%的患者就診時(shí)已是晚期，常常錯過最佳的手術(shù)治療時(shí)機(jī)，即使經(jīng)過治療也不能較好地改善患者生活質(zhì)量，并且術(shù)后復(fù)發(fā)率高，5年生存率僅有15%，預(yù)后差[13-14]，嚴(yán)重威脅著人類的身體健康。因此，尋找新的肝癌治療藥物是延長肝癌患者生存時(shí)間、降低肝癌死亡率的關(guān)鍵。探尋以抑制肝臟腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡為切入點(diǎn)，探究一種新型、安全且有效的抗腫瘤藥物成為目前肝癌治療的新思路，也是提高臨床療效及輔助外科治療的新方法[15-18]。我國有豐富的中藥來源，一些植物提取物成為抗腫瘤藥物的重要來源，例如苦參堿、紫杉醇、秦巴硒菇提取物等。因此，近年來天然產(chǎn)物的抗癌活性受到廣泛關(guān)注[19]。其中，中藥秦巴硒菇（AgaricusblazeiMurrill-Qbsg）中富含β-葡聚糖，對自身免疫系統(tǒng)有著很強(qiáng)的刺激作用。在試管培養(yǎng)及動物模型中，秦巴硒菇中的β-葡聚糖都顯示出了抗腫瘤作用。從秦巴硒菇多糖中提取的酸性RNA蛋白復(fù)合物（FA-2-bβ）具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，具有抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖的活性，F(xiàn)A-2-b-β有抗感染、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗過敏、修復(fù)肝損傷、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的效果[20-21]。因此，本研究利用體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞SMMC-7721，并給予不同濃度的秦巴硒菇提取物處理，探究秦巴硒菇提取物對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡能力的影響，并進(jìn)一步探究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、藥物及試劑 人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，秦巴硒菇、胰蛋白酶、甲基噻唑藍(lán)（MTT）、胎牛血清DMEM完全培養(yǎng)基購于美國Sigma公司，AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術(shù)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及RT-qPCR試劑盒購于TAKARA公司，抗 P53、Caspase3、Caspase9、內(nèi)參一抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、β-actin購自上海英駿生物技術(shù)有限公司，二抗購于北京索萊寶有限公司。

1.1.2 主要儀器 多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）、CO2培養(yǎng)箱（中國力康生物公司）、超凈工作臺（Thermo Forma）、倒置顯微鏡（OlympusBX51）、流式細(xì)胞儀（德國ParcGmbh，CyFlow Space公司）、低溫離心機(jī)HITACH（日本CF-16RX公司）、自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Invitrogen Countess）、BIO-RAD CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo scientific公司）、全波長分光光度計(jì)（上海UNICO公司）、Trizol及RIPA裂解液（美國MRCMolecular Research Center公司）、自動蒸汽消毒鍋（日本SANYO公司）、-80℃超低溫冰箱（美國Thermo公司）、凝膠成像儀、垂直電泳槽、濕式轉(zhuǎn)膜槽 (美國BIO-RAD公司)、3 mmWhatman濾紙（美國GE公司）

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌SMMC-7721細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，置于37℃含5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞生長情況，每隔1～2天換液一次，棄去鏡下觀察細(xì)胞生長情況欠佳及有污染的細(xì)胞株，剩余為實(shí)驗(yàn)用。待細(xì)胞生長達(dá)80%左右時(shí)對細(xì)胞進(jìn)行不同濃度秦巴硒菇提取物處理并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期SMMC-7721細(xì)胞，以1×105/mL細(xì)胞濃度種植96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h，DMEM完全培養(yǎng)基稀釋秦巴硒菇提取物至濃度分別為0.5，1.0，2.0，4.0 μg/mL，陰性對照組加入 100 μL DMEM 完全培養(yǎng)基，每組設(shè)3個復(fù)孔。秦巴硒菇提取物處理48 h后，小心吸棄上層含藥物培養(yǎng)基。每孔加入10%MTT的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄掉上清液，加入DMSO，振蕩溶解10 min。在490 nm波長處測定吸光度值（OD值）。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞OD值/陰性對照組細(xì)胞OD值）×100%。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測 人肝癌SMMC-7721細(xì)胞種植于細(xì)胞60 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞增長達(dá)對數(shù)生長期后，分別加入濃度分別為 0.5，1.0，2.0，4.0 μg/mL 的秦巴硒菇提取物，繼續(xù)培養(yǎng) 48h，以胰酶消化并收集細(xì)胞，用高速離心機(jī)1000 r/min離心5 min，PBS清洗兩次，以Annexin V-FITC在暗室中孵育30 min，然后加入2 μL的PI（100 μg/mL），用流式細(xì)胞分析檢測SMMC-7721細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR 取對數(shù)生長期細(xì)胞以2.5×105/mL的濃度種植于60 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h后分別加入不同濃度秦巴硒菇提取物，使終濃度為 0.5，1.0，2.0，4.0 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，加入1 mL Trizol裂解細(xì)胞并收集細(xì)胞于無酶EP管中，加入0.2 mL的三氯甲烷，劇烈震搖EP管25～30次，4℃離心15 min，取上清并加入等體積的異丙醇，輕搖EP管10次，放置-20℃冰箱，離心后吸棄去上清液，加入1 mL75%無水乙醇，重懸后離心，吸棄上清，室溫自行干燥，加入適量無RNA酶水，室溫放置10 min。NANODROP2000中檢測RNA濃度及純度。由于RNA保存不當(dāng)時(shí)宜降解，影響其濃度及純度，遂取2 μgRNA按照TAKARA公司試劑盒反應(yīng)體系說明書，立即將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，按照TAKARA公司的qPCR試劑盒反應(yīng)體系加樣，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃30 sec；95℃5 sec；60℃30 sec共 45個循環(huán)。β-actin作為管家基因進(jìn)行校準(zhǔn)。采用2-ΔΔCt相對定量法分析結(jié)果，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組（Ct目的基因-Ct管家基因）-對照組（Ct目的基因-Ct管家基因），相對表達(dá)=2-ΔΔCt。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達(dá) 不同濃度秦巴硒菇提取物作用于細(xì)胞后，收集細(xì)胞，用RIPA裂解液提取蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度并調(diào)平。取等量的蛋白質(zhì)用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳跑膠進(jìn)行分離，蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉室溫?fù)u床上1 h，TBST稀釋一抗4℃孵育過夜（一抗的稀釋比例下：P53：1∶1 200；Caspase3：1∶1 000；Caspase9：1∶1 000；β-actin：1∶2 000），復(fù)溫 1 h，TBST 洗膜 3 次，加入 TBST 稀釋的二抗（二抗稀釋比例1∶1 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜3次。將PVDF膜浸在ECL超敏發(fā)光液中1 min，在ECL發(fā)光儀上進(jìn)行曝光成像。凝膠成像系統(tǒng)獲取蛋白質(zhì)條帶圖片，ImageJ對蛋白質(zhì)條帶灰度值進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 秦巴硒菇提取物對肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響

秦巴硒菇提取物對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，且隨秦巴硒菇提取物的濃度和時(shí)間的作用增加而呈現(xiàn)出抑制作用更加明顯，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見表 1。

表1 秦巴硒菇提取物對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞不同濃度和時(shí)間的增殖抑制率

2.2 秦巴硒菇提取物對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響

不同濃度的秦巴硒菇提取物作用于人肝癌SMMC-7721細(xì)胞24 h后，采用流式細(xì)胞分析檢測細(xì)胞凋亡率的變化，結(jié)果顯示不同濃度的秦巴硒菇提取物 （0.5，1，2，4 μg/mL） 作用于SMMC-7721細(xì)胞后，凋亡率明顯高于對照組（0 μg/mL），且隨秦巴硒菇提取物濃度增加細(xì)胞凋亡率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果見表 2。

表2 秦巴硒菇提取物對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響

2.3 Annexin V/PI凋亡檢測結(jié)果

應(yīng)用Annexin V/PI、FCM法對秦巴硒菇提取物作用于SMMC-7721細(xì)胞作用后的凋亡現(xiàn)象分別進(jìn)行兩次定性定量的測定。流式細(xì)胞散點(diǎn)圖分為4個象限，象限左下角LL代表正常細(xì)胞簇群，象限左上角UL代表機(jī)械損傷或壞死細(xì)胞簇群，象限右下角LR代表早期凋亡細(xì)胞簇群，象限右上角UR代表晚期凋亡或死亡細(xì)胞簇群。兩次對照組細(xì)胞與其他組細(xì)胞均存在顯著性差異（P＜0.05）。見圖 1～2。

圖1 秦巴硒菇提取物對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡的作用（第一組）

圖2 秦巴硒菇提取物對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡的作用（第二組）

2.4 秦巴硒菇提取物對P53/Caspase信號通路的影響

從條帶可以看出，各組的條帶深淺基本一致，說明各組的細(xì)胞總量相同。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示不同濃度的秦巴硒菇提取物均能誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生凋亡。與對照組相比，以β-actin為內(nèi)參蛋白。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，秦巴硒菇提取物誘導(dǎo)了P53、Caspase-3及Caspase-9蛋白的表達(dá)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。遞增濃度的秦巴硒菇提取物對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞P53、Caspase3及Caspase9蛋白的影響，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3，表明秦巴硒菇提取物可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞P53/Caspase信號通路的激活。

圖3 遞增濃度的秦巴硒菇提取物對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞P53、Caspase3及Caspase9蛋白的影響

3 討論

3.1 秦巴硒菇提取物具有抑制肝癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用

細(xì)胞增殖不受控制是癌癥發(fā)生的主要機(jī)制之一。誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡是大多數(shù)抗癌藥物抑制癌癥發(fā)展的作用機(jī)制。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，多類天然產(chǎn)物提取物也能通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗癌作用[22]。秦巴硒菇提取物為天然產(chǎn)物提取物，可抑制多種癌癥細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯，抑制細(xì)胞增殖相關(guān)通路激活，從而減緩腫瘤的生長，發(fā)揮抗癌作用[23]。本文研究也發(fā)現(xiàn)，高濃度的秦巴硒菇提取物能降低肝癌SMMC-7721細(xì)胞的活性。在無明顯細(xì)胞毒性的劑量下，秦巴硒菇提取物作用于肝癌細(xì)胞的時(shí)間長短與濃度大小與肝癌細(xì)胞增殖倍數(shù)呈負(fù)相關(guān)，顯著升高肝癌細(xì)胞的凋亡率，表現(xiàn)為劑量依賴性與時(shí)間依賴性，進(jìn)一步提示秦巴硒菇提取物具有抑制肝癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用[24-25]。

3.2 秦巴硒菇提取物可誘導(dǎo)P53/Caspase信號通路的激活

細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，由多條信號通路共同調(diào)控，這些信號通路主要通過改變線粒體通透性，誘導(dǎo)線粒體釋放凋亡誘導(dǎo)因子而啟動細(xì)胞凋亡過程[26-27]。Caspase家族是細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行者，Caspase家族蛋白的激活可誘導(dǎo)DNA降解、介導(dǎo)DNA損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[28]。Caspase3是凋亡的執(zhí)行分子，是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶。它是由CASP3基因編碼的，外部死亡受體途徑和內(nèi)在線粒體途徑啟動后共同的效應(yīng)酶，在凋亡肝癌細(xì)胞中明顯表達(dá)[29]。而Caspase9由CASP9基因編碼的凋亡啟動蛋白酶，通過磷酸化進(jìn)行調(diào)控激活，引發(fā)線粒體內(nèi)部活化凋亡途徑。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是癌癥治療中細(xì)胞死亡的首選模式，是癌癥治療關(guān)鍵。P53是Caspase家族蛋白的上游調(diào)控因子，在氧化應(yīng)激、紫外照射等多種應(yīng)激條件誘導(dǎo)DNA損傷過程中均呈高表達(dá)狀態(tài)[30]。P53作用于線粒體可誘導(dǎo)細(xì)胞色素C表達(dá)，細(xì)胞色素C可直接誘導(dǎo)Caspase9活化，活化的Caspase9可進(jìn)一步促進(jìn)Caspase3激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[31-32]。P53介導(dǎo)的P53/Caspase細(xì)胞凋亡信號通路是多類化療藥物治療癌癥的重要機(jī)制之一[33]。既往有研究表明，黑種草種子提取物可通過激活P53/Caspase信號通路誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，紫草素可通過誘導(dǎo)P53表達(dá)升高Caspase-9表達(dá)水平，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究采用Western blot法檢測了秦巴硒菇提取物處理肝癌細(xì)胞后，細(xì)胞P53、Caspase3和Caspase9的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，秦巴硒菇提取物在誘導(dǎo)P53表達(dá)的同時(shí)也能升高肝癌細(xì)胞Caspase3和Caspase9的表達(dá)水平，提示其能夠誘導(dǎo)P53/Caspase信號通路的激活，可能是秦巴硒菇提取物誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制之一。

綜上所述，秦巴硒菇提取物可抑制肝癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，并能促進(jìn)凋亡蛋白Caspase3和Caspase9的表達(dá)，其作用機(jī)制可能與誘導(dǎo)P53/Caspase信號通路的激活有關(guān)。本研究僅初步探討了秦巴硒菇提取物抗肝癌的作用機(jī)制，之后將通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證并進(jìn)一步探究其具體的分子作用機(jī)制，為臨床開發(fā)新的肝癌治療藥物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。