龍血竭膠囊對(duì)SD大鼠放射性皮膚損傷防護(hù)作用及機(jī)制的初步研究

許明君，郭海亮，袁 軍，王金鳳，鄧永雙，羅彬彬，李玉磊

(1.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，江西 贛州 341000；2.崇義縣人民醫(yī)院，江西 崇義 341300；3.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江西 南昌 330000)

放射性皮膚損傷是接受放射治療患者常見不良反應(yīng)，輕則皮膚色素沉著，干性脫皮；嚴(yán)重則出現(xiàn)濕性脫皮、潰瘍出血，晚期皮膚變薄、纖維化[1]。放射性皮炎一旦發(fā)生，治療需要較長(zhǎng)時(shí)間，嚴(yán)重的難以愈合，甚至帶來不可逆的功能障礙。放射性皮膚損傷的原理是皮膚受到照射后產(chǎn)生大量自由基，皮膚細(xì)胞的DNA或細(xì)胞膜受到損傷將導(dǎo)致皮膚細(xì)胞凋亡。目前臨床上使用較多的是比亞芬藥膏，主要成分是三乙醇胺，具有良好的水合作用，通過減輕皮膚干燥、清潔、加快滲出物排出、改善微循環(huán)、減輕炎癥反應(yīng)、促進(jìn)膠原合成起作用[2-5]。但比亞芬藥膏只是作為放射性皮炎的預(yù)防用藥，一旦皮膚出現(xiàn)濕性脫皮將不再適合使用。龍血竭為百合科龍血樹屬植物劍葉龍血樹提取的樹脂，其化學(xué)成分以酚類化合物為特征，具有抗脂質(zhì)過氧化、清除自由基、收斂、紫外吸收、抗蟲、抑菌和保水等多種生物活性[6-7]。本研究選擇大鼠模型，研究龍血竭對(duì)大鼠是否具有皮膚放射性損傷防護(hù)作用，初步探討其防護(hù)機(jī)制，為龍血竭用于防護(hù)放射性皮膚損傷提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥品、試劑及儀器龍血竭膠囊(云南云河藥業(yè)股份有限公司)。比亞芬(BIAFING)乳膏(法國梅迪克斯制藥廠)，BCA蛋白定量試劑盒(江蘇省海門市碧云天生物公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、總谷胱甘肽(GSH)超微量三磷酸腺苷(ATP)酶檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，Bcl-2抗體、Bax抗體和活化Caspase-3抗體(美國Santa Cruz公司)。放射治療機(jī)器(美國瓦里安公司)，免疫印跡設(shè)備(美國Bio-Rad公司)。

1.2動(dòng)物分組及照射條件由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購入健康雄性SD大鼠100只，合格證號(hào)SCXK(湘)2016-0002，SPF級(jí)，體重(197.15±10.18) g，飼養(yǎng)于濕度為45%贛南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心大鼠墊料窩內(nèi)，常規(guī)顆粒飼料飼養(yǎng)，許可證號(hào) SYXK(贛) 2012-0006。將大鼠隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組(Ctrl)、龍血竭對(duì)照組(LC)、照射模型組(RT)、比亞芬治療組(RT+BIA)、龍血竭治療組(RT+LC)，每組20只。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(每100 g注射10%水合氯醛0.3 mL)。大鼠背部照射區(qū)域剃毛后，用龍膽紫畫好4 cm×4 cm照射野。根據(jù)文獻(xiàn)選擇30 Gy β射線進(jìn)行皮膚放射性損傷模型制備[4]。龍血竭治療組、比亞芬治療組、照射模型組用Varian23 EX直線加速器產(chǎn)生的照射量率為400 cGy·min-1的 6 MeV β射線照射大鼠背部皮膚，照射面積為4 cm×4 cm，非照射部位以鉛板屏蔽；照射總劑量均為30 Gy。龍血竭正常對(duì)照和正?？瞻讓?duì)照組不予照射。龍血竭治療組大鼠照射后立即予以龍血竭膠囊粉末外敷(6.5 mg·cm-2)，比亞芬治療組大鼠照射后立即予比亞芬(10 mg·cm-2)外涂照射野皮膚，龍血竭對(duì)照組予以龍血竭膠囊粉末外敷(6.5 mg·cm-2)，每日2次至照射后2周，照射模型組和空白對(duì)照組對(duì)皮膚不加干預(yù)。

1.3拍照記錄大鼠皮膚外觀各組大鼠于照射損傷后1周及2周拍照，記錄皮膚外觀。

1.4HE染色光鏡觀察皮膚組織結(jié)構(gòu)照射后3天取全層皮膚組織標(biāo)本，石蠟切片，蘇木精—伊紅染色，光鏡下觀察皮膚組織病理形態(tài)。

1.5SOD活性、GSH、MDA、ATP酶含量測(cè)定將照射后3天大鼠皮膚組織制成組織勻漿，腹主動(dòng)脈采血，靜置10 min，4 ℃(離心半徑8 cm，4 000 r·min-1，10 min)離心，收集血清，于-80℃保存。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，檢測(cè)MDA含量，GSH-Px、SOD、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。多功能酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(A)值。BCA方法檢測(cè)組織勻漿蛋白含量。按試劑盒公式分別計(jì)算酶的活性和MDA含量，其中組織中的酶的活性與MDA含量以每mg蛋白中相應(yīng)的活性或含量為單位。

1.6Westernblot方法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)皮膚組織剪碎后置于加入了PMSF 的RIPA裂解液中，制成組織勻漿，4 ℃、10 000×g離心10 min取上清液，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定上清液蛋白濃度。取50 μg蛋白，加入上樣緩沖液，置于98 ℃水浴5 min，冰上放置5 min，-80 ℃存放。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h后，Bcl-2、Bax、Caspase-3及β-actin一抗，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜，加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育2 h。ECL顯影液顯色，凝膠成像儀拍照分析。

2 結(jié) 果

2.1照射后皮膚外觀照射后第1周：各照射組皮膚濾泡樣暗紅斑、腫、觸痛。對(duì)照組大鼠剃毛區(qū)域長(zhǎng)出新毛，外觀恢復(fù)如常。照射后第2周：龍血竭治療組照射野皮膚干性脫皮，比亞芬治療組除干性脫皮外出現(xiàn)小片狀濕性脫皮，照射模型組照射野內(nèi)濕性脫皮和潰瘍(見圖1)。

2.2HE染色觀察照射野皮膚組織病理圖2為大鼠皮膚HE染色病理切片，從圖中可以看出龍血竭對(duì)照組和空白對(duì)照組表皮、真皮、皮下組織結(jié)構(gòu)完整，毛囊和附屬腺體細(xì)胞分布正常。照射模型組病理改變最明顯，表皮細(xì)胞層數(shù)顯著減少，真皮層見少量毛囊結(jié)構(gòu)，腺體明顯萎縮，龍血竭治療組和比亞芬治療組表皮細(xì)胞層數(shù)比對(duì)照組少，比照射模型組多，真皮層可見細(xì)胞水腫變性，毛囊結(jié)構(gòu)減少，皮脂腺和汗腺萎縮，皮下組織萎縮，但都比照射模型組程度更輕。

圖1 30 Gyβ射線對(duì)各組大鼠皮膚輻射損傷的觀察

1.空白對(duì)照組;2.龍血竭對(duì)照組;3.照射模型組;4.比亞芬治療組;5龍血竭治療組。

2.3龍血竭對(duì)ATP酶的影響圖3為龍血竭對(duì)皮膚組織Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶影響的統(tǒng)計(jì)箱圖，從圖中可以看出龍血竭對(duì)Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶沒有明顯影響，組間統(tǒng)計(jì)沒有差異(P>0.05)。

Ctrl：空白對(duì)照組;LC：龍血竭對(duì)照組;RT:照射模型組;RT+BIA:比亞芬治療組;RT+LC：龍血竭治療組，下圖同。

2.4龍血竭抗氧化作用結(jié)果如圖4所示。龍血竭對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，血清及皮膚組織GSH-Px活性均升高，說明龍血竭對(duì)正常組織具有提高抗氧化作用，但其對(duì)SOD和MDA無影響。照射模型組與空白對(duì)照組比較，血清和皮膚組織GSH-Px和SOD活性均降低，而MDA含量升高，提示照射后可抑制機(jī)體和皮膚的抗氧化能力，產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。與照射模型組相比，龍血竭和比亞芬治療組血清GSH-Px活性升高，但對(duì)血清SOD和MDA無影響；皮膚組織GSH-Px和SOD活性均升高，同時(shí)MDA含量降低，說明兩種藥物均可通過提高抗氧化酶的活性，抑制氧化應(yīng)激起保護(hù)作用。照射后兩種藥物治療組比較，龍血竭治療組的血清GSH-Px、組織GSH-Px和SOD活性高于比亞芬組，提示在抗氧化能力方面，龍血竭優(yōu)于比亞芬。

注：**P<0.01，***P<0.001與正常對(duì)照組相比;#P<0.05，###P<0.001與模型組相比;

2.5龍血竭對(duì)大鼠皮膚組織Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)的影響結(jié)果如圖5所示。龍血竭對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)沒有明顯差異。照射模型組與空白對(duì)照組比較，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)升高，提示照射后抑制細(xì)胞凋亡的蛋白表達(dá)降低，引起細(xì)胞凋亡。與照射模型組相比，龍血竭和比亞芬治療組，Bcl-2蛋白表達(dá)相對(duì)較高，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)相對(duì)較低，說明兩種藥物均可通過提高抑制細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)起保護(hù)作用。照射后兩種藥物治療組比較，龍血竭治療組的Bcl-2蛋白表達(dá)高于比亞芬組，而Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)降低，提示在抗細(xì)胞凋亡方面，龍血竭優(yōu)于比亞芬。

圖5 龍血竭對(duì)大鼠皮膚組織Bcl-2，Bax，Caspase-3表達(dá)的影響

3 討 論

“龍血竭”為百合科龍血樹屬植物劍葉龍血樹提取的樹脂，具有活血散瘀，定痛止血，斂瘡生肌的功效，其化學(xué)成分以酚類化合物為特征，具有抗脂質(zhì)過氧化、清除自由基、收斂、紫外吸收、抗蟲、抑菌和保水等多種生物活性。近年來，有研究表明龍血竭具有明顯的體外和體內(nèi)抗氧化活性，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)龍血竭對(duì)小鼠的肝、脾、腦組織和骨髓細(xì)胞均有放射性損傷防護(hù)作用[8]。

本實(shí)驗(yàn)中，通過對(duì)各組照射后皮膚反應(yīng)的觀察，發(fā)現(xiàn)龍血竭可以減輕照射導(dǎo)致的皮膚損傷，其效果略好于比亞芬；從病理切片的結(jié)果可以看出龍血竭治療組與照射模型組比較，皮膚各層細(xì)胞結(jié)構(gòu)都得到保護(hù)，說明龍血竭膠囊對(duì)SD大鼠放射性皮膚損傷有防護(hù)作用。龍血竭對(duì)照組皮膚組織病理與空白對(duì)照組無差別，說明龍血竭對(duì)正常皮膚無影響。

Na+-K+-ATP酶在維持膜通透性、膜內(nèi)外離子成分及維持細(xì)胞正常代謝等方面起重要作用；Ca2+-Mg2+-ATP酶也是廣泛存在于細(xì)胞膜上的重要的膜結(jié)合酶，膜活性的降低可引起細(xì)胞的離子膜轉(zhuǎn)運(yùn)障礙及胞漿內(nèi)鈣離子的積聚，導(dǎo)致細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的異常[9]；本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)了各組大鼠皮膚樣本中各ATP酶含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這說明龍血竭并不能影響Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性。

皮膚在受到大劑量的電離輻射作用時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量不穩(wěn)定的具有很高氧化活性的自由基，自由基可以破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致放射性皮膚損傷[10]；哺乳動(dòng)物本身具有一系列抗氧化抵御自由基損傷的功能，參與抗氧化的酶主要是SOD和GSH-PX。SOD清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，GSH-PX特異地催化還原型谷胱甘肽對(duì)過氧化氫的還原反應(yīng)，可以起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。當(dāng)皮膚細(xì)胞的細(xì)胞膜受損將釋放MDA。檢測(cè)MDA的含量可間接測(cè)定膜系統(tǒng)受損程度。本實(shí)驗(yàn)受照射的大鼠皮膚組織和血清GSH-Px和SOD活性降低，MDA升高，說明射線照射后皮膚細(xì)胞和血清中抗氧化酶降低，細(xì)胞膜的脂過氧化程度升高，皮膚細(xì)胞受到不同程度的損傷；龍血竭治療組皮膚組織中的GSH-Px和SOD活性明顯升高，且高于比亞芬治療組，MDA降低，說明龍血竭可以保護(hù)機(jī)體的抗氧化酶，從而減少自由基過氧化反應(yīng)對(duì)皮膚細(xì)胞的損傷，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[3,11]。

皮膚早期反應(yīng)主要是表皮細(xì)胞受損，隨照射劑量的增高，真皮細(xì)胞可能發(fā)生延遲反應(yīng)，皮膚變薄、變脆，還可見到血管擴(kuò)張，這說明血管結(jié)構(gòu)受到損傷。有文獻(xiàn)報(bào)道龍血竭治療放射性濕性脫皮和潰瘍傷口愈合有確切效果[12-16]。本實(shí)驗(yàn)龍血竭治療組血清中的GSH-Px含量相對(duì)單純照射和比亞芬治療組升高，說明龍血竭還可以保護(hù)血液中的GSH-Px，進(jìn)而提高血管內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化能力，這對(duì)預(yù)防和治療皮膚晚期損傷有重要意義。

射線作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)的DNA[17]，自由基可能通過損傷DNA、影響信號(hào)傳導(dǎo)以及參與基因表達(dá)調(diào)控等途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而導(dǎo)致放射性皮膚損傷。Xin N等[18]報(bào)道，龍血竭對(duì)大鼠放射性腦損傷有防護(hù)作用，其機(jī)制與它抑制凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達(dá)相關(guān)。Bcl-2作為一種調(diào)亡抑制基因蛋白產(chǎn)物，可通過抗氧化作用和抑制氧自由基起到抑制細(xì)胞凋亡的作用[19]，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[20]，龍血竭粉外敷在糖尿病模型大鼠燙傷皮膚組織愈合過程中對(duì)Bcl-2有調(diào)節(jié)作用，龍血竭能明顯促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，改善創(chuàng)面微循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)Western blot檢測(cè)結(jié)果也顯示龍血竭組Bcl-2蛋白表達(dá)升高，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)降低。

綜上所述，龍血竭對(duì)放射性皮膚損傷有防護(hù)作用，其機(jī)制可能為保護(hù)機(jī)體的抗氧化酶和抑制細(xì)胞凋亡。