肝內(nèi)膽管癌上皮組織miR-215表達(dá)與病理特征的相關(guān)性

楊慶輝，李偉偉，王瑾，路平

肝膽管癌是患病率較高的一種惡性腫瘤，其發(fā)病可能與 肝吸蟲病、肝管囊腫、肝膽管結(jié)石、肝硬化等因素相關(guān)［1］。研究表明這類患者5年內(nèi)生存率約為5%～10%，死亡率非常高，預(yù)后欠佳［2］?，F(xiàn)階段，臨床針對惡性腫瘤患者主要通過綜合治療緩解病情，即以根治性手術(shù)為主，放、化療為輔的方法。然而，該病早期缺乏特異性癥狀，部分患者就診時已進(jìn)展為晚期階段，錯過最佳手術(shù)時機(jī)［3］。為了改善預(yù)后，臨床必須尋求更多能對其病情進(jìn)行評估的分子，便于為疾病診療提供依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)微小RNA對基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼RNA有調(diào)控作用，如miR-71、miR-71c、miR-215的表達(dá)均能反映惡性腫瘤患者病情［4］。動物實驗則提示在上述微小RNA中，僅miR-215具備同源miRNA［5］。既往研究中關(guān)于肝內(nèi)膽管癌miR-215表達(dá)的研究較少，本研究為了明確肝內(nèi)膽管癌上皮組織miR-215表達(dá)與病理特征的關(guān)系，納入120例患者為研究對象，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入我院2015年4月至2018年4月收治的120例肝內(nèi)膽管癌患者為研究對象，均行根治性手術(shù)治療，作為研究組。研究組男62例，女58例，年齡35～78歲，平均（58.62±15.31）歲；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期56例、Ⅲ ～Ⅳ期64例；腫瘤直徑2～7c m，平均（4.19±1.14）cm；術(shù)前癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen，CEA）≥5 ng/mL 86例，＜5 ng/mL 34例；術(shù)前糖鏈抗原CA199（Carbohydrate antigen199，CA199）：≥34 U/mL 82例，＜34 U/mL 38例；脈管癌栓：有31例，無89例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有48例，無72例；吸煙史：有23例，無97例；飲酒史：有26例，無94例。選取同期收治的肝良性瘤患者120例作為對照組，其中男67例，女53例，年齡32～75歲，平均（55.91±14.89）歲。研究方案經(jīng)本院倫理委員會通過，兩組性別、年齡比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 研究組：①經(jīng)病理檢查證實為肝內(nèi)膽管癌；②入院前無放療、化療史；③無心、腦血管??；④入院后行肝內(nèi)膽管癌根治術(shù)，并留取上皮組織標(biāo)本；⑤知情同意。對照組：①經(jīng)手術(shù)病理證實為肝良性瘤；②無心、腦血管??；③入院后行手術(shù)治療，留取上皮組織；④知情同意。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①腎、心、腦、肺等臟器重度損害；②重度感染；③伴其他惡性腫瘤；④既往有膽道手術(shù)史；⑤有麻醉、手術(shù)禁忌，無法留取樣本；⑥有認(rèn)知障礙、精神障礙。

1.3 檢測方法

選取葉/段切除組織，將包膜去除，粗略分離較大膽管并固定，置于振蕩器內(nèi)震蕩，將肝細(xì)胞去除，留取組織標(biāo)本，存放于-80℃冰箱內(nèi)待測。試劑包括Trizol試劑盒、miR-215引物、逆轉(zhuǎn)錄與PCR試劑盒。將標(biāo)本取出后，經(jīng)實時定量PCR法測定miR-215表達(dá)量。在標(biāo)本上加液氮，充分研磨，留取勻漿，并對總RNA進(jìn)行提取，嚴(yán)格根據(jù)說明書完成操作。逆轉(zhuǎn)錄條件：42℃30 min，95℃5 min，冰上冷卻，使其降至4℃。PCR反應(yīng)條件：95℃10 min、95℃15 s、60℃60 s，40個循環(huán)。將U6視作內(nèi)參基因，經(jīng)相對定量法對miR-215表達(dá)量進(jìn)行計算。

1.4 觀察指標(biāo)

比較研究組、對照組上皮組織中miR-215的表達(dá)量，繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curves，ROC）分析miR-215表達(dá)量對肝內(nèi)膽管癌的預(yù)測價值。收集肝內(nèi)膽管癌患者的臨床資料，包括性別、年齡、TNM分期、腫瘤直徑、術(shù)前CEA、脈管癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)前CA199、吸煙史、飲酒史、分化程度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對兩組臨床資料進(jìn)行處理。計數(shù)資料用%表示，采用χ2檢驗；計量資料用ˉ±s表示，采用t檢驗。利用ROC曲線分析miR-215表達(dá)量對肝內(nèi)膽管癌的預(yù)測效果，采用Spearman檢驗分析上皮組織miR-215表達(dá)與病理特征相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組上皮組織miR-215表達(dá)量比較

研究組miR-215在上皮組織中的表達(dá)量為（1.24±0.28），顯著高于對照組的（0.39±0.12），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。ROC曲線提示miR-215表達(dá)量預(yù)測肝內(nèi)膽管癌的曲線下面積為0.746（標(biāo)準(zhǔn)誤=0.032，P=0.000，95%CI=0.683～0.808），最佳截斷值為1.105，敏感度為70.00%，特異度為73.30%。ROC曲線見圖1。

圖1 miR-215表達(dá)量預(yù)測肝內(nèi)膽管癌的ROC曲線

2.2 肝內(nèi)膽管癌患者miR-215表達(dá)量與病理特征的關(guān)系

以miR-215表達(dá)量的最佳截斷值為界值，將肝內(nèi)膽管癌患者分成miR-215低表達(dá)組（n=36）與高表達(dá)組（n=84）。高表達(dá)組的TNM分期（Ⅲ ～Ⅳ期）、低分化占比分別為65.48%、44.05%，高于低表達(dá)組的25.00%、22.22%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.3 肝內(nèi)膽管癌患者miR-215表達(dá)量與病理特征的相關(guān)性分析

經(jīng)Spearman檢驗提示miR-215表達(dá)量與TNM分期、分化程度呈正相關(guān)（P＜0.05），其與性別、年齡、腫瘤直徑、術(shù)前CEA、術(shù)前CA199、脈管癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、吸煙史、飲酒史無 相關(guān)性（P＞0.05），見表2。

表1 肝內(nèi)膽管癌患者miR-215表達(dá)量與病理特征的關(guān)系［n（%）］

表2 肝內(nèi)膽管癌患者miR-215表達(dá)量與病理特征的相關(guān)性分析

3 討論

研究表明miRNA對人類多個基因組具有調(diào)控作用，它參與了細(xì)胞生長、分裂、代謝等過程，對腫瘤微環(huán)境的影響非常大［6-7］。一旦miRNA表達(dá)失調(diào)，則會導(dǎo)致其對基因組的調(diào)控作用無法充分發(fā)揮，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［8-9］。目前，已有多項研究證實miRNAs在鑒別良、惡性腫瘤中具有較高價值，如miR-92a、miR-92對結(jié)腸癌診斷的敏感度較高，miR-211、miR134對肺癌診斷效果較好［10-11］。近年來，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-215在多種生理液體中存在，如膽汁、尿液、血液等，為惡性腫瘤的診斷提供了有效依據(jù)［12-13］。

本次研究以肝內(nèi)膽管癌患者為研究對象，通過測定其上皮細(xì)胞中miR-215表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)膽管癌患者miR-215表達(dá)量較肝良性瘤患者明顯增高，提示miR-215在上皮細(xì)胞中的表達(dá)量對肝內(nèi)膽管癌存在一定預(yù)測價值。miR-215參與了多類腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡過程［14-15］。有研究人員針對骨肉瘤患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)miR-215在癌組織內(nèi)呈較低表達(dá)水平，提示它具備抑癌基因［16］。另有研究提示miR-215在肺癌腫瘤細(xì)胞中也呈低表達(dá)，且對ZEB2等靶基因有調(diào)控作用［17］。本研究發(fā)現(xiàn)miR-215在肝內(nèi)膽管癌上皮組織中呈高表達(dá)，與其在骨肉瘤、肺癌組織中的表達(dá)存在差異，提示miR-215在肝內(nèi)膽管癌中具備癌基因作用。研究表明miR-215高表達(dá)可導(dǎo)致機(jī)體部分抑癌基因表達(dá)被抑制，為惡性腫瘤細(xì)胞增殖、分化、遷移提供有利條件，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［18］，這為本研究結(jié)論提供了理論支持。動物實驗提示在肝膽管癌大鼠的癌組織中，蛋白酪氨酸磷酸酶受體T（PTPRT）呈低表達(dá)，而PTPRT為典型的抑癌基因，其表達(dá)水平會受miR-215抑制，且二者呈負(fù)相關(guān)［19］。這也證實miR-215在肝膽管癌組織中呈低表達(dá)，與本研究結(jié)論基本符合。

本研究的創(chuàng)新之處在于分析了miR-215表達(dá)量與病理特征的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量與TNM分期、分化程度呈正相關(guān)，而與年齡、性別、腫瘤直徑等其他指標(biāo)無相關(guān)性，與單因素研究結(jié)果基本一致，提示隨著miR-215在上皮組織中的表達(dá)量越高，患者的TNM分期、惡性分化程度越高。筆者結(jié)合既往研究［20］，推測miR-215可能通過抑制PTPRT的啟動子活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化、遷移，導(dǎo)致病情進(jìn)一步惡化。研究表明肝膽管癌患者的預(yù)后與TNM分期、分化程度密切相關(guān)，隨著TNM分期、惡性分化程度越高，患者的預(yù)后越差［21］。因此，臨床可將上皮組織中miR-215表達(dá)量作為評估患者病情的重要指標(biāo)。同時，本研究通過繪制ROC曲線，初步得出上皮組織中miR-215鑒別肝內(nèi)膽管癌、肝良性瘤的最佳界值為1.105，曲線下面積0.746，提示對于超過此水平的患者應(yīng)重視，而上皮組織中miR-215可作為鑒別良性、惡性病變的輔助性指標(biāo)。

綜上，本研究證實與肝良性瘤患者相比，肝內(nèi)膽管癌患者的上皮細(xì)胞內(nèi)miR-215表達(dá)量較高，能為肝內(nèi)膽管癌的診療提供依據(jù)，且miR-215表達(dá)量與患者的TNM分期、分化程度呈正相關(guān)，臨床需對此引起重視。本研究的局限性在于受研究經(jīng)費、病例納入時間等因素影響，導(dǎo)致樣本量較少，在未來的研究中，筆者將擴(kuò)大樣本量，對此進(jìn)行大樣本、多中心的研究。