籽用和肉用印度南瓜果實(shí)發(fā)育過(guò)程中淀粉合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)分析

王超杰 王云莉 徐文龍 韓宏宇 王志超 崔崇士 屈淑平

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

在高等植物中淀粉主要由兩種不同的葡聚糖聚合物組成：直鏈淀粉和支鏈淀粉。支鏈淀粉是天然淀粉的主要成分，是以α-1，6-糖苷鍵和α-1，4-糖苷鍵共同形成長(zhǎng)度不一的分支并以一定的次序相結(jié)合的簇狀結(jié)構(gòu)（Gentry et al.，2016）；直鏈淀粉是次要成分，是由α-1，4-糖苷鍵連接而成的線(xiàn)性多聚物，通常占總儲(chǔ)備淀粉的15%～35%（Vu et al.，2014）。植物種類(lèi)和貯藏器官不同，其直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量和比例也有所不同。貯藏器官淀粉的合成（圖1）主要發(fā)生在質(zhì)體中，由一系列關(guān)鍵的酶催化合成（Ball & Morell，2003；Stitt et al.，2010；Zeeman et al.，2010；Toyosawa et al.，2016；Wyatt et al.，2016）。淀粉合成的第一步是葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphate，G6P）由葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GPT）將其由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至質(zhì)體中。G6P 在質(zhì)體葡萄糖磷酸變位酶（pPGM）的催化作用下生成葡萄糖-1-磷酸（glucose-1-phosphate，G1P）。G1P 和ATP 在ADP-葡萄糖磷酸焦磷酸化酶（ADP-Glc pyrophosphorylase，AGPaseL）的催化下生成ADPG，ADPG 是直鏈淀粉和支鏈淀粉合成的共同前體，為淀粉鏈的延伸提供糖基，此過(guò)程中，質(zhì)體內(nèi)的ATP 主要是從胞質(zhì)中由質(zhì)體型ATP/ADP 轉(zhuǎn) 運(yùn) 蛋 白（plastidic ATP/ADP transporter，AATP）運(yùn)輸而來(lái)。顆粒結(jié)合型淀粉合成酶（granule-bound starch synthase，GBSS）主要負(fù)責(zé)直鏈淀粉糖鏈的延伸?？扇苄缘矸酆铣擅福╯oluble starchsynthase Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，SSSⅠ～Ⅳ）主要負(fù)責(zé)支鏈淀粉糖鏈的延伸，支鏈淀粉中α-1，6-糖苷鍵的引入主要是由淀粉分支酶（starch-braching enzyme，SBE）完成，而淀粉去分支酶（debranching enzyme，DBE）的主要作用是水解不正確的α-1，6-糖苷鍵分支，對(duì)支鏈進(jìn)行修飾。

圖1 植物淀粉的生物合成途徑（Wyatt et al.，2016）

淀粉是南瓜果肉的重要成分，淀粉含量的高低與南瓜果實(shí)的食用口感相關(guān)，南瓜收獲時(shí)，干物質(zhì)與淀粉含量越高，果肉口感越面（Hurst et al.，1995）。Nakkanong 等（2012）研究了中國(guó)南瓜（Cucurbita moschata）、印度南瓜（Cucurbita maxima）和種間雜種（Maxchatal）果實(shí)發(fā)育過(guò)程的6 個(gè)時(shí)期淀粉代謝相關(guān)基因的表達(dá)量及淀粉組成，結(jié)果顯示AGPaseL 與GBSSⅠ基因的轉(zhuǎn)錄水平與淀粉含量變化趨勢(shì)一致，SSSⅡ、ISAⅠ和SBEⅡ基因與支鏈淀粉合成相關(guān)。Wyatt 等（2016）對(duì)美洲南 瓜（Cucurbita pepo）Sweet REBA 和Lady Godiva 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，確定了在美洲南瓜果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的蔗糖和淀粉代謝相關(guān)的酶基因，并對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行研究。王安君（2017）對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的中國(guó)南瓜（Cucurbita moschata）CMO-X 和CMO-E 以及印度南瓜（Cucurbita maxima）CMA的果實(shí)進(jìn)行高通量測(cè)序，探究果實(shí)糖類(lèi)和淀粉合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選出蔗糖和淀粉代謝途徑差異表達(dá)的基因共12 個(gè)，結(jié)合qRT-PCR 驗(yàn)證中國(guó)南瓜CMO-X 和CMO-E 中差異基因表達(dá)量與相關(guān)代謝物含量的關(guān)系，確定GBSS、SSS 和SBE 為淀粉合成途徑關(guān)鍵基因。

雖然直鏈和支鏈淀粉在南瓜果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的積累與其代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)量之間的關(guān)系有多篇報(bào)道，但對(duì)于印度南瓜果實(shí)發(fā)育過(guò)程中直鏈淀粉和支鏈淀粉的積累與關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的關(guān)系報(bào)道較少。肉用印度南瓜果實(shí)口感緊實(shí)、甜面，深受消費(fèi)者青睞，籽用印度南瓜果實(shí)口感疏松，果肉基本全部廢棄。因此，本試驗(yàn)以肉用印度南瓜和籽用印度南瓜高代自交系材料為研究背景，探究籽用和肉用印度南瓜品種果肉中直鏈和支鏈淀粉的積累模式及合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的差異，以期為南瓜品質(zhì)育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

籽用印度南瓜自交系98-2，果實(shí)口感疏松；肉用印度南瓜自交系312-1，果實(shí)口感粉面；均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院南瓜分子遺傳育種研究室提供。2017 年5 月中旬，在黑龍江省哈爾濱市東北農(nóng)業(yè)大學(xué)向陽(yáng)基地種植，每份材料種植30 株，株距50 cm，行距140 cm，3 次重復(fù)，均采用常規(guī)栽培管理方式及水肥供給。人工輔助授粉，并掛標(biāo)記牌，每個(gè)單株只留1 個(gè)瓜。在不同的果實(shí)發(fā)育階段（授粉后5、10、20、30、40、50 d）進(jìn)行取樣，每個(gè)時(shí)期2 份材料分別選取3 個(gè)長(zhǎng)勢(shì)一致且無(wú)機(jī)械損傷的果實(shí)，離體后立即縱切，取南瓜果肉部分用錫箔紙包裹后迅速在液氮中冷凍，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中。

1.2 干物質(zhì)含量的測(cè)定

取上述冷凍南瓜果肉部分測(cè)定每份材料的干物質(zhì)含量，即將果肉在65 ℃條件下烘干至恒重，測(cè)定其干質(zhì)量。

1.3 南瓜淀粉的提取

將冷凍南瓜果肉取出后，于-50 ℃冷凍干燥48 h，磨粉，將干粉過(guò)100 目篩。按 Stevenson 等（2005）的堿提取方法提取南瓜淀粉，取過(guò)篩后干粉加10 mL 0.05% NaOH 放置20 h；用蒸餾水反復(fù)清洗3 次，5 000 r · min-1離心10 min 后加入19 mL 0.1 mol · L-1NaCl 和0.1 mL 10%甲苯渦旋混勻，離心棄上清液；再用蒸餾水清洗3 次，乙醇洗2 次，用冷凍干燥機(jī)干燥樣品，即得到粗提的南瓜 淀粉。

1.4 總淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉含量的測(cè)定

取上述粗提的南瓜淀粉磨粉后的南瓜干粉15 mg，用5 mL 80% Ca（NO3）2懸浮，在沸水中水浴10 min，于4 000 r · min-1條件下離心4 min 后將上清液轉(zhuǎn)入20 mL 容量瓶中，殘?jiān)?0% Ca（NO3）2重復(fù)提取 2 次，合并提取液，定容至20 mL。每個(gè)處理3 次重復(fù)，參照徐昌杰等（1998）的測(cè)定方法測(cè)定總淀粉含量。

稱(chēng)取粗提的南瓜淀粉15 mg，加入1.0 mL 1 mol · L-1NaOH 溶液，30 ℃恒溫箱內(nèi)糊化20 h。加入2～3 mL 水，于沸水中分散8 min。取3 mL 分散液，加入1 mL 脫脂液，靜置10 min，棄去上層，重復(fù)脫脂 3 次。吸取脫脂液0.5 mL，加入5 mL 水、0.1 mol · L-1乙酸溶液1 mL、0.02%碘試劑1.5 mL定容。顯色10 min 后于620 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。參照楊金華等（1992）的方法繪制混合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算直鏈淀粉和支鏈淀粉含量。

1.5 RNA 的提取及cDNA 的合成

采用 Trizol（Invitrogen USA）法提取不同果實(shí)發(fā)育階段南瓜果肉RNA。RNA 的質(zhì)量和濃度通過(guò)超微量紫外分光光度計(jì)（SMA 4000 Merinton USA）進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的完整性。cDNA 合成使用 Rever Tra Ace q-PCR RT Master Mix with gDNA Remover（Code No. FSQ-301，TOYOBO，JAPAN） 試 劑 盒。0.5 μg RNA 加2 μL 4 × DN Master Mix（已添加 gDNA Remover），加入RNase-free ddH2O 至 8 μL，混勻后于37 ℃水浴5 min。cDNA 合成用上面提到的8 μL 反應(yīng)液加2 μL 的5× RT Master MixⅡ至 10 μL混勻，37 ℃水浴15 min；98 ℃水浴5 min，于-80 ℃條件保存。

1.6 淀粉合成途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)分析

選擇10 個(gè)參與淀粉合成途徑的相關(guān)酶基因進(jìn)行表達(dá)分析，部分引物參照Nakkanong 等（2012）文獻(xiàn)中的引物序列，引物信息見(jiàn)表1。以Actin 為內(nèi)參基因。應(yīng)用天根生化科技（北京）有限公司RealMaster Mix SYBR Green（Code No.FP202） 試劑盒進(jìn)行qRT-PCR。qRT-PCR 反應(yīng)體系包括1 μL稀釋的cDNA，上下游引物各1 μL，9 μL 的2.5×Real Master Mix（with 20×SYBR Solution）反應(yīng)液，加8 μL RNase-free ddH2O 到20 μL。所有反應(yīng)液均在冰上配制，之后徹底混勻。qRT-PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s。所有cDNA 均進(jìn)行3 次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 南瓜果實(shí)發(fā)育過(guò)程中干物質(zhì)和淀粉積累的變化

南瓜果實(shí)發(fā)育過(guò)程中干物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果表明（表2），在授粉后5 d，2 份材料中干物質(zhì)含量差異不大，隨著果實(shí)的發(fā)育，肉用南瓜312-1 中干物質(zhì)呈現(xiàn)快速積累，在授粉后40 d 達(dá)到峰值，在果實(shí)成熟后期（授粉后50 d）略有下降，而籽用南瓜98-2 的干物質(zhì)含量一直變化不大，維持在發(fā)育初期的水平，沒(méi)有顯著積累的過(guò)程，在授粉后50 d達(dá)到峰值。授粉后10～50 d，2 份材料之間的干物質(zhì)含量差異均達(dá)顯著或極顯著水平。

如表3 和圖2 所示，在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，2 份材料312-1 和98-2 的總淀粉和支鏈淀粉積累模式存在明顯差異，312-1 中總淀粉和支鏈淀粉積累模式相似，都是隨著果實(shí)發(fā)育逐漸積累，在授粉后40 d 時(shí)達(dá)到高峰，隨后略有下降；而98-2 中總淀粉和支鏈淀粉含量一直維持在果實(shí)發(fā)育初期（授粉后5 d）水平，沒(méi)有顯著積累的過(guò)程；在果實(shí)發(fā)育的各個(gè)時(shí)期，312-1 中總淀粉和支鏈淀粉含量均極顯著高于98-2。在授粉后40 d 時(shí)312-1 果實(shí)中總淀粉和支鏈淀粉含量分別為53.84%和41.85%，而98-2 果實(shí)中總淀粉和支鏈淀粉含量分別為8.29%和5.70%。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物

表2 南瓜果實(shí)發(fā)育過(guò)程中干物質(zhì)含量的變化

表3 南瓜果實(shí)發(fā)育過(guò)程中淀粉含量的變化

圖2 98-2（A）和312-1（B）在果實(shí)發(fā)育6 個(gè)時(shí)期的淀粉積累量

2 份材料中直鏈淀粉的積累模式大致相同，都是維持在果實(shí)發(fā)育初期的水平，沒(méi)有顯著積累過(guò)程，在發(fā)育過(guò)程中略有上下波動(dòng)。果實(shí)發(fā)育的不同時(shí)期312-1 中直鏈淀粉含量均顯著或極顯著高于98-2，在授粉后40 d 時(shí)312-1 果實(shí)中直鏈淀粉含量為11.99%，而98-2 果實(shí)中直鏈淀粉含量為2.59%，兩者相差4.6 倍。

在淀粉組成上，2 份材料均是以支鏈淀粉為主。在整個(gè)果實(shí)發(fā)育期間，312-1 中支鏈淀粉含量平均為總淀粉含量的71.27%，98-2 中支鏈淀粉含量平均為總淀粉含量的79.00%，2 份材料在淀粉組成上差異不大。

2.2 南瓜果實(shí)發(fā)育過(guò)程中淀粉合成途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的變化

淀粉合成途徑中10 個(gè)關(guān)鍵酶基因在2 份南瓜材料果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量變化如圖3 所示。除ISA Ⅲ、SSSⅡ和SBEⅡ基因外，其他7 個(gè)基因的表達(dá)模式相似，均是在2 份材料果實(shí)發(fā)育前期（授粉后5 d）高度表達(dá)，在果實(shí)發(fā)育中后期表達(dá)量均維持在相對(duì)較低的水平，其中GPT、AGPaseL、GBSSⅠ 和SSS Ⅲ這4 個(gè)基因在2 份材料不同果實(shí)發(fā)育期均存在顯著或極顯著差異。

GPT 和GBSSⅠ基因在312-1 果實(shí)發(fā)育前2個(gè)時(shí)期的表達(dá)量均極顯著高于98-2，但授粉20 d 之后GPT 和GBSSⅠ基因的表達(dá)量均顯著或極顯著低于98-2。312-1 果實(shí)發(fā)育過(guò)程中AATP、AGPaseL、SBEⅠ（除授粉后30 d）、SSSⅡ（除授粉后10 d）和SSS Ⅲ基因的表達(dá)量均高于98-2。PGM 基因除授粉后5 d 和30 d，其他各個(gè)時(shí)期均是312-1 中的表達(dá)量低于98-2。ISA Ⅲ基因在2 份材料中的表達(dá)量大體呈現(xiàn)“V”字形變化趨勢(shì)，該基因在授粉后5、30 d 和50 d 時(shí)312-1 中的表達(dá)量顯著高于98-2，其余各時(shí)期2 份材料間差異不顯著。SBEⅡ基因在312-1 授粉后5 d 和10 d 的表達(dá)量顯著低于98-2，后期則相反。

圖3 南瓜果實(shí)發(fā)育過(guò)程中10 個(gè)淀粉合成途徑關(guān)鍵酶基因的相對(duì)表達(dá)量

3 結(jié)論與討論

南瓜干物質(zhì)和淀粉含量與南瓜口感品質(zhì)關(guān)系密切（Ferriol & Picó，2008；孫守如 等，2008；徐麗珊 等，2009；尹玲 等，2012）。本試驗(yàn)中，肉用印度南瓜312-1 中干物質(zhì)和總淀粉含量均大于同期籽用印度南瓜98-2，98-2 口感疏松，312-1 口感緊實(shí)、面而粉，結(jié)合2 份南瓜果實(shí)中的淀粉和干物質(zhì)含量，推斷南瓜質(zhì)地緊實(shí)、粉質(zhì)與南瓜中淀粉和干物質(zhì)含量有關(guān)。

在2 份印度南瓜材料果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，肉用印度南瓜312-1 果實(shí)中的直鏈和支鏈淀粉的積累均顯著或極顯著高于籽用印度南瓜98-2。除ISA Ⅲ、SSSⅡ 和SBEⅡ 基 因 外，GPT、AATP、PGM、AGPaseL、GBSSⅠ、SSS Ⅲ和SBEⅠ基 因 在2 份材料果實(shí)發(fā)育過(guò)程中表達(dá)模式相似，各基因表達(dá)量在2 份材料中存在較大差異。GPT、AATP 和AGPaseL 主要參與淀粉合成前體物質(zhì)（ADPG）的合成。前人從基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中已證明GPT、AATP 和AGPaseL 基因在南瓜淀粉合成中的重要作用。Wyatt 等（2016）發(fā)現(xiàn)在美洲南瓜Sweet REBA 果實(shí)發(fā)育過(guò)程中GPT 和AATP 的轉(zhuǎn)錄水平高于Lady Godiva，且Sweet REBA 果實(shí)中的淀粉含量高于Lady Godiva。Nakkanong 等（2012）研究發(fā)現(xiàn)在印度南瓜和Maxchata 中AGPaseL 基因的轉(zhuǎn)錄水平與淀粉含量變化趨勢(shì)一致，AGPaseL 基因在印度南瓜和Maxchata 中高度表達(dá)導(dǎo)致其積累較多的淀粉。本試驗(yàn)中，GPT、AATP 和AGPaseL基因均在2 份材料果實(shí)發(fā)育前期（授粉后5 d 和授粉后10 d）高表達(dá)，且在312-1 中的表達(dá)量顯著或極顯著高于98-2，推測(cè)GPT、AATP 和AGPaseL在印度南瓜果實(shí)淀粉合成過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。GBSS 是直鏈淀粉生物合成的關(guān)鍵酶，GBSSⅠ基因的表達(dá)與許多植物的貯藏器官中直鏈淀粉含量具有明顯的相關(guān)性，例如馬鈴薯（Kozlov et al.，2007）、木薯（Raemakers et al.，2005）和甘薯（Otani et al.，2007）。在本試驗(yàn)中，2 份材料在果實(shí)發(fā)育早期直鏈淀粉便高度積累，GBSSⅠ基因在果實(shí)發(fā)育早期（授粉后5～10 d）的表達(dá)量較高，且在312-1果實(shí)中的表達(dá)量極顯著高于98-2，推測(cè)GBSSⅠ基因是調(diào)控印度南瓜果實(shí)中直鏈淀粉積累的關(guān)鍵酶基因。SSS、SBE 和DBE 共同參與支鏈淀粉的生物合成（高振宇 等，2004；Tetlow et al.，2008；鄭義 等，2009），本試驗(yàn)中SSSⅡ、SSSⅢ、SBEⅠ和SBEⅡ基因在312-1 果實(shí)發(fā)育多個(gè)時(shí)期的表達(dá)量顯著高于98-2，312-1 支鏈淀粉的含量也極顯著高于98-2，推測(cè)SSSⅡ、SSSⅢ、SBEⅠ和SBEⅡ基因是調(diào)控印度南瓜果實(shí)中支鏈淀粉積累的關(guān)鍵酶基因。在水稻中有研究表明ISA Ⅲ基因參與淀粉的降解（Yun et al.，2011），本試驗(yàn)中2 份材料在授粉后50 d SSSⅡ和ISAⅢ基因高度表達(dá)，授粉后50 d 果實(shí)中支鏈淀粉含量也下降，SSSⅡ和ISA Ⅲ基因是否參與淀粉的降解還有待進(jìn)一步研究。