食管鱗癌新輔助化放療敏感性相關血清microRNA的檢測及臨床應用價值

楊鯨蓉　吳健　葉仕新　連鐸煌　曾志勇

[摘要] 目的 探討血清microRNA（miRNA）與食管鱗癌新輔助化放療（NCRT）效果的關系及其預測價值。 方法 選取南京軍區(qū)福州總醫(yī)院2015年1月～2016年12月收治的接受術前NCRT的cT3-4N0食管鱗癌患者30例，NCRT前采集患者外周血，根據(jù)術后病理結果，分為敏感組和抵抗組，每組各15例;采用miRNA表達譜芯片檢測篩選出食管鱗癌NCRT敏感組和抵抗組差異表達的血清miRNA，然后，擴大樣本量進行實時熒光定量PCR驗證初篩的血清miRNA;分析篩選并驗證的miRNA和NCRT效果的關系;受試者工作特征（ROC）曲線評價miRNA預測NCRT效果的價值。 結果 兩組患者血清共篩查出16個差異表達的miRNA，其中miRNA-23，miRNA-211，miRNA-323經qRT-PCR驗證后，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。三者與食管鱗癌NCRT近期效果的曲線下面積分別為0.764、0.880和0.707。 結論 miRNA-23、miRNA-211和miRNA-323對食管鱗癌NCRT近期效果的評估可能具有一定的預測價值。

[關鍵詞] 食管鱗癌;新輔助化放療;微小RNA;臨床應用

[中圖分類號] R735.1 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2019）05（b）-0096-05

[Abstract] Objective To investigate the relationship between serum microRNA（miRNA） and neoadjuvant radiotherapy （NCRT） for esophageal squamous cell carcinoma and its predictive value. Methods From January 2015 to December 2016， 30 patients with preoperative NCRT cT3-4N0 esophageal squamous cell carcinoma admitted to Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command were selected. Peripheral blood of the patients were collected before NCRT. According to the postoperative pathological results， the patients were divided into the sensitive group and the resistance group， with 15 cases in each group. The differentially expressed serum mirnas in the NCRT sensitive group and the resistance group were detected by miRNA expression profile microarray. Then， the sample size was expanded for real-time fluorescence quantitative PCR to verify the initially screened serum mirnas. The relationship between the efficacy of miRNA and NCRT was analyzed and verified. Subject operating characteristic （ROC） curves were used to evaluate the value of miRNA in predicting the efficacy of NCRT. Results A total of 16 differentially expressed mirnas were detected in the serum of the two groups， among which miRNA-23， miRNA-211 and miRNA-323 were verified by qRT-PCR， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. The area under the curve of the short-term efficacy of the three factors and esophageal squamous cell carcinoma NCRT was 0.764， 0.880 and 0.707， respectively. Conclusion The evaluation of miRNA-23， miRNA-211 and miRNA-323 in the short-term efficacy of esophageal squamous cell carcinoma NCRT may have certain predictive value.

[Key words] Esophageal squamous cell carcinoma; Neoadjuvant chemoradiation; microRNA; Clinical application

我國食管鱗癌最為常見。對可切除的食管癌患者而言，外科治療是食管癌治療的首選方法。但食管癌患者單純手術生存率低，效果不盡人意。為提高食管癌治療效果，多項研究[1-2]表明，術前新輔助化放療（neoadjuvant chemoradiation，NCRT）可顯著提高局部進展期食管癌患者的5年生存率，改善預后。術前NCRT可提高食管癌患者生存率，但主要獲益者是NCRT敏感者。而NCRT抵抗的食管癌患者失去最合適的手術切除機會，預后甚至比單純手術更差。目前研究[3-8]表明，miRNA的差異表達與腫瘤化療/放療敏感性有著密切聯(lián)系。本研究通過miRNA表達譜芯片檢測食管鱗癌NCRT敏感和抵抗患者差異表達的血清miRNA;然后，擴大樣本量進行RT-PCR驗證，旨在尋找潛在的預測食管癌NCRT敏感性的生物學標志物。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取福建省福州總醫(yī)院（以下簡稱“我院”）2015年1月～2016年12月收治的30例接受術前NCRT的食管癌患者為研究對象。納入標準：內鏡活檢組織病理學提示食管鱗狀細胞癌;局部進展期食管癌，T3～4或淋巴結陽性的可切除胸段食管癌患者;無明顯化療、放療及手術禁忌證;NCRT后4～6周行食管癌切除術;能簽署治療知情同意書，對治療和隨訪有良好的依從性。排除標準：不滿足任一納入標準者;其他部位惡性腫瘤史;嚴重心血管疾病，嚴重肝腎功能障礙及其他不能耐受化放療的合并癥者;出現(xiàn)嚴重治療相關并發(fā)癥，不能繼續(xù)治療或常規(guī)隨訪;患者中途放棄治療;失訪。本研究經我院醫(yī)學倫理委員會審核批準，且入選者均已簽署知情同意書。本入研究中，NCRT敏感組15例，NCRT抵抗組15例。兩組患者年齡、性別、部位、腫瘤臨床分期、組織學分級等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），具有可比性。見表1。

1.2 治療方法

采用常規(guī)分割放療200 cGy/d，每周5 d，共20次，總量40 Gy。靶區(qū)包括腫瘤靶區(qū)和臨床靶區(qū)，即原發(fā)食管腫瘤病灶、轉移淋巴結和亞臨床病灶（食管腫瘤上下3 cm正常食管及食管旁淋巴引流區(qū)）。放療同期采用DP方案：多西他賽（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產，10 mg/支，批號：16060116）75 mg/m2，靜脈滴注（2～3 h），第1天;順鉑（江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司生產，30 mg/支，批號：160402）75 mg/m2，靜脈滴注（2 h），第1～3天。21 d為1個周期，共2次。然后，間隔4～8周進行食管癌根治術。

1.3 NCRT方案效果的評估

根據(jù)NCRT后4～6周行微創(chuàng)食管癌切除術后病理結果評估NCRT效果[9-10]。NCRT后病理反應分級是通過殘留腫瘤細胞與周圍纖維組織的比例來劃分的。腫瘤退縮1級（TRG1）為無腫瘤細胞殘留;腫瘤退縮2級（RRG2）為殘留腫瘤細胞占1%～10%;腫瘤退縮3級（TRG3）為殘留腫瘤細胞占11%～50%;腫瘤細胞退縮4級（TRG4）為殘留腫瘤細胞占50%以上;腫瘤退縮5級（TRG5）為無腫瘤退縮改變。目前研究[11-12]表明病理完全緩解和TRG2（TRG1～2）患者可從新輔助治療中獲益。因此本研究將TRG1～2納入治療敏感組，TRG3～5為抵抗組。

1.4 實驗方法

1.4.1 血清標本收集 ?符合納入標準的患者在接受NCRT前，征得患者同意后由臨床醫(yī)師收集食管癌術前NCRT敏感組和抵抗組患者的外周血5 mL，EDTA抗凝，低溫低速離心機1000 r/min離心10 min，取勻漿上清，于無RNA酶EP管中-70℃低溫保存。

1.4.2 miRNA芯片初篩 ?3例食管癌NCRT敏感者血清和3例NCRT抵抗者血清標本送至上?？党缮锕こ逃邢薰具M行miRNA表達譜芯片檢測。首先應用Trizol法提取RNA，并用RNasey Mini kit（QIAGEN）純化。使用NanoDrop ND-1000測量純化后的RNA濃度，電泳檢測RNA完整性。RNA標記和雜交根據(jù)Exiqon提供的方法進行。抽提的RNA通過質檢后，使用miRCURYTM Array Power Labeling kit（Cat #208032-A，Exiqon）對miRNA進行標記。標記完成后，將樣品與miRCURYTM LNA Array（v.19.0）（Exiqon）芯片雜交，雜交完成后，使用Wash buffer kit（Exiqon）清洗芯片。最后使用Axon GenePix 4000B芯片掃描儀掃描芯片。結果經過數(shù)據(jù)分析，根據(jù)差異倍數(shù)≥1.5且P < 0.05篩選與NCRT敏感患者血清相比在NCRT抵抗患者血清中差異表達的miRNA。

1.4.3 Real-time PCR檢測miRNA的表達 ?提取剩余患者血清RNA，按Qiagen公司的miRNaesy Mini Kit說明書進行操作。在miRBase數(shù)據(jù)庫種獲取目標miRNA的引物，利用莖環(huán)引物逆轉錄合成cDNA第一鏈。以合成的cDNA作為模板進行實時定量PCR擴增（同時測定每個樣品中hsa-miRNA-93-5p含量作為內參以校正上樣誤差）。分析實時定量PCR結果，根據(jù)標準曲線定量樣品中的目的miRNA。以hsa-miRNA-93-5p作為內參，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進行分析。實驗重復3次。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 19.0對資料進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，符合正態(tài)分布時，兩組數(shù)據(jù)比較用t檢驗;兩組計數(shù)資料比較采用χ2檢驗;等級資料采用非參數(shù)秩和檢驗;應用受試者工作特征（ROC）曲線評價目標miRNA的表達在食管鱗癌NCRT效果預測中的臨床價值。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 食管鱗癌術前NCRT敏感組和抵抗組患者血清miRNA表達譜比較

表達譜芯片雜交后，結果經過分析，根據(jù)改變倍數(shù)≥1.5且P < 0.05篩選出食管鱗癌術前NCRT敏感組和抵抗組患者中有差異表達的miRNA。共檢測出112個差異表達的miRNA，其中18個表達上調，94個表達下調。其中共有16種miRNA在食管癌術前NCRT敏感組和抵抗組血清標本中差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表2。其中上調表達的有3種，下調表達的miRNA有13種。差異表達有統(tǒng)計學意義的miRNA的熱圖。見圖1（封四）。

2.2 qRT-PCR對miRNAs進行驗證

用qRT-PCR對16種miRNA進行驗證。其中miRNA-211-5p、miRNA-323b-3p和miRNA-23c 三個miRNA在食管癌術前NCRT敏感組患者中的表達相對于抵抗組的表達差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表3。

2.4 ROC曲線分析

以手術切除后組織的病理報告為“金標準”，評估食管鱗癌患者行術前NCRT是否敏感。繪制miRNA-23c、miRNA-211-5p和miRNA-323b-3p在預測食管癌術前NCRT敏感性的ROC曲線。見表4、圖2。

3 討論

術前NCRT可提高食管癌患者生存率，但主要獲益者是NCRT敏感者，而NCRT抵抗的食管癌患者預后甚至比單純手術更差。因此，如果治療前能預測食管癌NCRT效果，篩選出NCRT敏感人群，則可對食管癌患者進行分層;使對NCRT敏感者從NCRT中獲得最大利益;NCRT抵抗者則可建議其他治療模式，規(guī)避NCRT毒副作用的危害;從而提高食管癌的總體效果，改善預后。目前預測食管NCRT效果及預后相關因素有：食管癌的病理分型，分化程度等臨床因素，另外，從分子層面進行食管癌NCRT預后因素的探索，是近年來的研究熱點，如抑癌基因、細胞周期調節(jié)因子、DNA損傷修復基因、耐藥蛋白、血管生成因子等[13-14]。但至今，未找到高度敏感而又經濟有效的可預測食管癌NCRT效果的生物學標志物。microRNA（miRNA）是一類具有內源性、功能性的非編碼RNA。目前有研究[3-8]表明，miRNA的差異表達與腫瘤化療/放療敏感性有著密切聯(lián)系。本研究通過miRNA表達譜的篩查分析食管鱗癌NCRT敏感組和抵抗組血清miRNA表達存在統(tǒng)計學意義（P < 0.05），首次闡明血清miRNA表達譜與食管鱗癌NCRT效果的關系，篩選出可預測食管鱗癌NCRT效果的血清miRNA。

miRNA預測食管癌NCRT效果的既往研究少有報道。Skinner等[3]篩選出miRNA：miRNA-505，miRNA-99b、miRNA-451、miRNA-145與食管癌NCRT相關，并通過建立miRNA表達譜評分并結合T分期、腫瘤分級來預測食管腺癌NCRT的有效性。Bibby等[4]研究表明miRNA-330-5p可作為食管腺癌的NCRT敏感性的預測生物學標志物，并可作為NCRT敏感性的一種新的治療靶點。Odenthal等[5]研究表明血清miRNA-222和miRNA-302c可作為胃食管連接部腺瘤的綜合治療效果的預測。Ko等[6]研究了25例Ⅲ期食管癌（鱗癌、腺癌）NCRT前后miRNA的差異表達，在病理完全緩解組和非病理完全緩解組，有5種miRNA（HS-240、hsa-miRNA-296、hsa-miRNA-31、hsa-miRNA-31和HS-217）的表達差異超過2倍，但并未進一步篩選并證明可作為預測食管癌NCRT的miRNA。本研究中共篩查出16種miRNA在食管癌術前NCRT敏感組和抵抗組血清標本中差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），其中上調表達的有3種，下調表達的miRNA有13種。通過qRT-PCR進一步驗證。其中miRNA-211-5p、miRNA-323b-3p和miRNA-23c 三個miRNA在食管癌術前NCRT敏感組患者中的表達相對于抵抗組的表達差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。這與既往研究[3-6]結果并不一致，可能的原因是既往研究對象均包含食管腺癌患者，而本研究僅選取的是我國常見的食管鱗癌患者。另外患者入組條件，NCRT效果分組標準也有所不同，當然本研究樣本量小也是一個因素，仍需要大樣本量的研究。

本研究中miRNA-211在食管鱗癌NCRT敏感組較抵抗組差異表達下調，定量分析其差異倍數(shù)為1.5倍。而關于miRNA-211與NCRT近期效果的分析提示敏感組的miRNA-211低表達率為86.7%，高于抵抗組的26.7%，提示miRNA-211下調表達量越低，NCRT越高。本研究進一步使用ROC曲線評價miRNA-211對于食管鱗癌NCRT敏感性的預測價值，曲線下面積為0.880，具有較好的診斷效能。Shafiee等[7]研究表明miRNA-211的過表達可引起食管鱗癌細胞SOX2OT和SOX2基因的下調，而SOX2OT和SOX2基因在腫瘤發(fā)生和多能性中有重要的作用。Zhang等[8]研究表明上調miRNA-211-5p可顯著抑制細胞和恢復化療敏感性。Asuthkar等[15]研究表明miRNA-211上調或者下調MMP-9，可增強化放療治療效果。

既往報道m(xù)iRNA-323與胰腺癌、前列腺癌和甲狀腺癌相關[16-17]，但在食管癌中鮮有報道。miRNA-323的缺失使PC-3前列腺癌細胞在G0/G1期停滯，并引起顯著的凋亡。多西紫杉醇耐藥的前列腺癌細胞miRNA-323表達水平較親本細胞高5.6倍。miRNA-323的過表達使前列腺癌細胞對多西紫杉醇的抑制濃度（IC50）值增高了50%[16]。本研究探討了miRNA-323與食管鱗癌的關系。在食管鱗癌NCRT敏感組患者血清miRNA-323呈下調趨勢，進一步定量兩組之間的差異倍數(shù)為1.22倍。ROC曲線下面積為0.707，提示miRNA-323在預測食管鱗癌NCRT效果方面有一定的價值。

miRNA-23參與包括神經系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程，常起致癌基因的作用。Shang等[18]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-23a對結腸癌細胞氟尿嘧啶的敏感性具有明顯的抑制作用;抑制miRNA-23的表達可增加卵巢癌細胞對順鉑的敏感性，引起細胞周期阻滯G0/G1期，增加細胞凋亡率[19]。另外，輻射誘導的胸腺淋巴瘤組織樣本中miRNA-23 a和miRNA-23 b上調，而miRNA-23a/b模擬物則淋巴瘤細胞死亡和凋亡。這可能與miRNA-23a/b的過表達降低了Fas蛋白的表達水平有關[20]。本研究中miRNA-23在食管鱗癌NCRT敏感組中呈下調表達，定量分析其差異倍數(shù)為1.31倍。本研究進一步使用ROC曲線評價miRNA-23在食管鱗癌NCRT預測效果價值，ROC曲線下面積為0.764。提示miRNA-23對NCRT敏感性有一定的預測價值。

綜上所述，本研究通過miRNA表達譜芯片檢測食管鱗癌NCRT敏感組和抵抗組差異表達的血清miRNA;共篩查出16種miRNA在食管癌術前NCRT敏感組和抵抗組血清標本中差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），其中上調表達的有3種，下調表達的miRNA有13種。通過qRT-PCR進一步驗證。其中miRNA-211-5p、miRNA-323b-3p和miRNA-23c這3個miRNA在食管癌術前NCRT敏感組患者中的表達相對于抵抗組的表達差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。結合臨床資料，通過準確性檢驗分析（ROC曲線）判斷上述3種血清miRNA在預測食管鱗癌NCRT效果的價值。后續(xù)仍需要通過進一步擴大樣本量來進行驗證結果，并探討其參與化放療敏感性調節(jié)的作用機制。

[參考文獻]

[1] ?Alderson D，Cunningham D，Nankivell M，et al. Neoadjuvant cisplatin and fluorouracil versus epirubicin，cisplatin，and capecitabine followed by resection in patients with oesophageal adenocarcinoma （UK MRC OE05）：an open-label，randomised phase 3 trial [J]. Lancet Oncol，2017，18（9）：1249-1260.

[2] ?Tang H，Tan L，Shen Y，et al. CMISG1701：a multicenter prospective randomized phase Ⅲ clinical trial comparing neoadjuvant chemoradiotherapy to neoadjuvant chemotherapy followed by minimally invasive esophagectomy in patients with locally advanced resectable esophageal squamous cell carcinoma （cT3-4aN0-1M0） （NCT03001596） [J]. BMC Cancer，2017，17（1）：450.

[3] ?Skinner HD，Lee JH，Bhutani MS，et al. A validated miRNA profile predicts response to therapy in esophageal adenocarcinoma [J]. Cancer，2014，120（23）：3635-3641.

[4] ?Bibby BAS，Reynolds JV，Maher SG. MicroRNA-330-5p as a Putative Modulator of Neoadjuvant Chemoradiotherapy Sensitivity in Oesophageal Adenocarcinoma [J]. Plos One，2015，10（7）：e0134180.

[5] ?Odenthal M，Hee J，Gockel I，et al. Serum microRNA profiles as prognostic/predictive markers in the multimodality therapy of locally advanced adenocarcinomas of the gastroesophageal junction [J]. Int J Cancer，2015，137（1）：230-237.

[6] ?Ko MA，Zehong G，Virtanen C，et al. MicroRNA expression profiling of esophageal cancer before and after induction chemoradiotherapy [J]. Ann Thorac Surg，2012，94（4）：1094-1103.

[7] ?Shafiee M，Aleyasin SA，Vasei M，et al. Down-Regulatory Effects of miR-211 on Long Non-Coding RNA SOX2OT and SOX2 Genes in Esophageal Squamous Cell Carcinoma [J]. Cell J，2016，17（4）：593-600.

[8] ?Zhang S，Ma H，Zhang D，et al. LncRNA KCNQ1OT1 regulates proliferation and cisplatin resistance in tongue cancer via miR-211-5p mediated Ezrin/Fak/Src signaling [J]. Cell Death Dis，2018，9（7）：742.

[9] ?Shridhar R，Hoffe SE，Almhanna K，et al. Lymph node harvest in esophageal cancer after neoadjuvant chemoradiotherapy [J]. Ann Surg Oncol，2013，20（9）：3038-3043.

[10] ?Wu TT，Chirieac LR，Abraham SC，et al. Excellent interobserver agreement on grading the extent of residual carcinoma after preoperative chemoradiation in esophageal and esophagogastric junction carcinoma：a reliable predictor for patient outcome [J]. Am J Surg Pathol，2007， 31（1）：58-64.

[11] ?H？觟lscher AH，Drebber U，Schmidt H，et al. Prognostic Classification of Histopathologic Response to Neoadjuvant Therapy in Esophageal Adenocarcinoma [J]. Ann Surg，2014，260（5）：779-785.

[12] ?Fakhrian K，Ordu AD，Lordick F，et al. Long-term outcomes of trimodality treatment for squamous cell carcinoma of the esophagus with cisplatin and/or 5-FU：more than 20 years′ experience at a single institution [J]. Strahlenther Onkol，2014，190（12）：1133-1140.

[13] ?Wu AJ，Goodman KA. Clinical tools to predict outcomes in patients with esophageal cancer treated with definitive chemoradiation：are we there yet？ [J]. J Gastro Oncol，2015， 6（1）：53-59.

[14] ?Toxopeus ELA，Nieboer D，Shapiro J，et al. Nomogram for predicting pathologically complete response after neoadjuvant chemoradiotherapy for oesophageal cancer [J]. Radiother Oncol，2015，115（3）：392-398.

[15] ?Asuthkar S，Velpula KK，Chetty C，et al. Epigenetic regulation of miRNA-211 by MMP-9 governs glioma cell apoptosis，chemosensitivity and radiosensitivity [J]. Oncotarget，2012，3（11）：1439-1454.

[16] ?Gao Q，Zheng J. microRNA-323 upregulation promotes prostate cancer growth and docetaxel resistance by repressing p73 [J]. Biomed Pharmacother，2018，97：528-534.

[17] ?Wang C，Liu P，Wu H，et al. MicroRNA-323-3p inhibits cell invasion and metastasis in pancreatic ductal adenocarcinoma via direct suppression of SMAD2 and SMAD3 [J]. Oncotarget，2016，7（12）：14912-14924.

[18] ?Shang J，Yang F，Wang Y，et al. MicroRNA-23a antisense enhances 5-fluorouracil chemosensitivity through APAF-1/caspase-9 apoptotic pathway in colorectal cancer cells [J]. J Cell Biochem，2014，115（4）：772-784.

[19] ?金愛紅，周霞平，周鳳珍.抑制miR-23a表達增強卵巢癌順鉑敏感性的分子機制[J].南方醫(yī)科大學學報，2015（1）：125-128.

[20] ?Li B，Sun M，Gao F，et al. Up-regulated expression of miR-23a/b targeted the pro-apoptotic Fas in radiation-induced thymic lymphoma [J]. Cell Physiol Biochem，2013， 32（6）：1729-1740.

（收稿日期：2018-09-14 ?本文編輯：封 ? 華）