轉(zhuǎn)移性腎癌的循環(huán)腫瘤分子標(biāo)志物在靶向治療中的研究進(jìn)展

任雨+石炳毅

[摘要] 近年來隨著對腎癌發(fā)病機(jī)制的不斷深入了解，腎癌發(fā)生發(fā)展過程中細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一些關(guān)鍵因子成為治療的靶點(diǎn)，最主要的是一系列抗血管生成療法，包括免疫療法。外周循環(huán)血中的分子標(biāo)志物具有提取方便、檢測靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，為疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后狀況提供十分重要的信息。本文主要對近年來新發(fā)現(xiàn)的循環(huán)蛋白分子標(biāo)志物（包括VEGF家族、炎癥因子和LDH）和核酸分子標(biāo)志物（包括循環(huán)DNA、microRNAs）作一綜述。這些循環(huán)腫瘤分子標(biāo)志物的檢測不僅有利于早期腎癌的診斷，而且能為臨床醫(yī)生更好的用藥提供指導(dǎo)依據(jù)，將成為一種新型的治療策略。

[關(guān)鍵詞] 腎癌；靶向治療；循環(huán)核酸；血管內(nèi)皮生長因子；微小RNA

[中圖分類號] R737.11 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）33-0160-05

[Abstract] In recent years， with more deeply understand of the pathogenesis in renal cell carcinoma， renal cell carcinoma acts as an important role in the development process of cell signal transduction pathway in the targeted therapy， especially a series of anti-angiogenic therapies， including immunotherapy. The molecular markers in peripheral blood circulation have the advantages of convenient extraction and high sensitivity， which could provide important information for the occurrence and development of the disease and the prognosis of the disease. This paper focuses on the recent discovery of circulating protein markers， including vascular endothelial growth factor（VEGF） family， inflammatory cytokines and lactate dehydrogenase and nucleic acid molecular markers（including cyclic DNA， microRNAs）. These circulating molecular markers are beneficial to the diagnosis of the disease progression of patients and the effect of intervention measures， and will be a new therapeutic strategy in future.

[Key words] Renal cell carcinoma； Targeted therapy； Circulating nucleic acid； VEGF； MicroRNA

腎癌是一種起源于腎小管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，占全部腎臟腫瘤的85%以上。腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC）約占成人惡性腫瘤的2%～3%，發(fā)病率位居泌尿系統(tǒng)腫瘤的第二位，僅次于膀胱癌[1]。在腎癌高發(fā)國家中，40%的病例與吸煙和肥胖有關(guān)[2]。隨著醫(yī)學(xué)水平的提高，多數(shù)患者能夠做到早期發(fā)現(xiàn)和及時(shí)治療，但仍有約1/4的患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已存在腫瘤的轉(zhuǎn)移。有文獻(xiàn)報(bào)道，約40%的腎癌患者最終死于腫瘤及其并發(fā)癥[3]。隨著轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌（mRCC）治療方法越來越多，根據(jù)患者和疾病的特征評估m(xù)RCC進(jìn)展顯得十分重要。

靶向療法是治療mRCC的一線或二線治療手段，其藥物從作用機(jī)制主要分為兩類：抗血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）/血管內(nèi)皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）和抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycinm，mTOR）途徑藥物。近年來，陸續(xù)有6種抗血管藥物（舒尼替尼、帕唑帕尼、阿西替尼、卡博替尼、lenvatinib、索拉非尼）、2種哺乳動物雷帕霉素靶向療法（坦羅莫司和依維莫司）和2種免疫療法（高劑量白介素-2和nivolumab）在美國批準(zhǔn)上市。目前僅有索拉非尼和舒尼替尼兩種藥被我國批準(zhǔn)用于晚期腎癌的治療[4]。然而，在實(shí)際的靶向治療中，靶向藥物的療效及副反應(yīng)具有較大的個(gè)體差異性[5]。多個(gè)國外的靶向藥物Ⅲ期隨機(jī)對照臨床研究顯示，靶向藥物雖然明顯改善了轉(zhuǎn)移性腎癌的無進(jìn)展生存期（PFS）和總生存期（OS），但也有獨(dú)特的不良反應(yīng)，尤其是多靶點(diǎn)抗腫瘤藥物[6]。因此，高特異性、高敏感度的腫瘤分子標(biāo)志物不僅能夠預(yù)測靶向藥物治療腎癌的療效和不良反應(yīng)，同時(shí)也為臨床醫(yī)生更好的用藥提供指導(dǎo)依據(jù)。

腫瘤分子標(biāo)志物是反映腫瘤存在的化學(xué)類物質(zhì)，其表達(dá)量或活性在腫瘤組織中不同于正常組織，進(jìn)而有利于提示腫瘤的性質(zhì)，借以了解腫瘤的組織發(fā)生、細(xì)胞分化及進(jìn)展，以幫助腫瘤的診斷、分類、預(yù)后判斷及治療指導(dǎo)。循環(huán)血是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的主要途徑之一，同時(shí)也是疾病診斷的主要取材之一。惡性腫瘤的血行轉(zhuǎn)移會給患者帶來極大的危害，因此，及時(shí)有效地發(fā)現(xiàn)循環(huán)血中的微量腫瘤分子標(biāo)志物不僅有利于患者的動態(tài)檢測與及時(shí)治療，同時(shí)也可以預(yù)測治療反應(yīng)[7]。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)步，許多循環(huán)蛋白分子和循環(huán)DNA陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。本綜述主要介紹血液中特異性循環(huán)蛋白分子、循環(huán)核酸分子標(biāo)志物。

1 循環(huán)血蛋白分子標(biāo)志物

1.1 VEGF家族

VEGF-A又稱血管通透因子，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種促進(jìn)血管形成有關(guān)的多肽生長因子。自2004年貝伐單抗被批準(zhǔn)用于治療結(jié)腸癌后，人們將VEGF-A作為貝伐單抗的一個(gè)預(yù)后指標(biāo)。Hegde PS等[8]為了研究VEGF是否能夠用來預(yù)測貝伐單抗治療RCC的預(yù)后反應(yīng)，他們在4個(gè)有關(guān)于貝伐單抗的Ⅲ期臨床試驗(yàn)中測量了人血漿中VEGF-A mRNA水平，包含貝伐單抗聯(lián)合干擾素α-2a的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所有的預(yù)后腫瘤類型中均能發(fā)現(xiàn)總VEGF-A分子（包括短鏈的VEGF-A121和長鏈的VEGF-A145、-A165、-A189、-A206）的表達(dá)，但是并不能預(yù)測貝伐單抗對RCC的反應(yīng)。隨后，他們使用能檢測單鏈VEGF-A的試劑盒，發(fā)現(xiàn)短鏈VEGF-A可以用來預(yù)測胰腺癌、胃癌、乳腺癌的預(yù)后反應(yīng)，但遺憾的是不能預(yù)測RCC，這也說明循環(huán)腫瘤分子標(biāo)志物具有組織特異性[9]。

VEGF-A雖然不能預(yù)測RCC的發(fā)生發(fā)展，但是可以評估其他RCC抗血管藥物的治療預(yù)后反應(yīng)。Escudier B等[10]開展了一項(xiàng)索拉非尼治療轉(zhuǎn)移性RCC（mRCC）患者隨機(jī)、雙盲、以安慰劑為對照的的研究，他們發(fā)現(xiàn)mRCC患者用藥后在其血漿中可檢測到較低水平VEGF-A，與預(yù)后效果成反比（無進(jìn)展生存期PFS，P=0.0013，總生存時(shí)間OS，P=0.0009），進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)血中高水平的VEGF-A患者使用索拉非尼用藥后其預(yù)后效果比低水平的VEGF-A更加有效。與此同時(shí)，Harmon CS等[11]在研究中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象。

除了VEGF-A，VEGF家族還有其他蛋白分子如VEGF-B、C、D和E以及胎盤生長因子1、2在血管生成和腫瘤生長中扮演關(guān)鍵的作用。研究發(fā)現(xiàn)，各種VEGF亞型分子分別結(jié)合與其相對應(yīng)的細(xì)胞表面受體：VEGF-A優(yōu)先結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子受體1（VEGFR-1）和VEGFR-2，VEGF-B結(jié)合于VEGFR-1，VEGF-C和VEGF-D結(jié)合于VEGFR-3，VEGF-E結(jié)合于VEGFR-2[9]。雖然VEGFR-3主要通過調(diào)控VEGF-C和VEGF-D的活性介導(dǎo)新淋巴管生成，但是在VEGF-A處于低水平時(shí)，VEGF-C和VEGF-D可以結(jié)合并激活VEGF-2[12]，結(jié)果激發(fā)了以VEGF-C和VEGF-D相結(jié)合作為腫瘤標(biāo)志物來評估VEGF-A的興趣。另有研究發(fā)現(xiàn)，RCC患者的這兩類VEGF生物標(biāo)志物，VEGF-C和可溶性VEGFR-3水平與PFS相關(guān)[13]。此外，VEGF-C和可溶性VEGFR-3表達(dá)水平在預(yù)后情況較好的患者中要比穩(wěn)定或者進(jìn)展性疾病患者低。在一個(gè)使用IFN-α和蘇尼替尼的對照試驗(yàn)中，研究者觀察到循環(huán)血中可溶性VEGFR-3比IFN-α預(yù)測蘇尼替尼的用藥效果更好[13]。此外，Zurita AJ等[14]開展了一個(gè)探討索拉菲尼聯(lián)合IFN-α回顧性臨床試驗(yàn)，他們分析了約60個(gè)腫瘤分子標(biāo)志物，包括VEGF配體和可溶性受體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩種受體均可預(yù)測PFS。

1.2 炎癥和其他生長因子

腫瘤血管生成、炎癥和基質(zhì)間的相互作用關(guān)系十分復(fù)雜，腫瘤細(xì)胞中各種信號隨著時(shí)間、濃度和位置不同而變化[15，16]。白介素-6（interleukin-6，IL-6）在RCC中高表達(dá)，扮演了促炎細(xì)胞因子的作用，受有絲分裂JAK-STAT信號通路調(diào)控[17]。一些研究已經(jīng)證實(shí)IL-6是抗血管治療RCC的潛在預(yù)測因子[18]。Voss MH等[19]開展了一項(xiàng)比較依維莫司和舒尼替尼的臨床研究，他們發(fā)現(xiàn)除了白介素-8（interleukin-8，IL-8），組織金屬蛋白酶抑制劑1（TIMP-1）也可以作為預(yù)測PFS的指標(biāo)。TIMP-1在細(xì)胞中結(jié)合并激活靶向基質(zhì)金屬蛋白酶，有助于改變腫瘤微環(huán)境，同時(shí)也扮演著細(xì)胞生長因子的作用[20]，且TIMP-1在其他臨床試驗(yàn)中也被證明具有此作用[21]。

乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）是在糖酵解和糖異生通路中很重要的一細(xì)胞代謝酶，有研究表明，血清LDH水平隨著細(xì)胞應(yīng)激和更新頻率而改變，包括缺氧、組織損傷和溶血等生物學(xué)現(xiàn)象。Motzer RJ等[22]針對血清LDH納入670例患者為研究對象，他們發(fā)現(xiàn)LDH是一個(gè)mRCC的獨(dú)立的預(yù)后腫瘤分子標(biāo)志物。LDH水平越高，患者OS越差，當(dāng)LDH大于300 U/L時(shí)，患者的OS小于4個(gè)月。Armstrong AJ等[23]做了一個(gè)西羅莫斯與IFN-α對照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LDH是OS較差的預(yù)后指標(biāo)（hazard ratio[HR]=2.81；95%CI：2.01～3.94；P<0.001），其中血清LDH升高的患者對于西羅莫斯反應(yīng)更好（median OS=6.9 mo vs 4.2 mo；HR=0.56；95% CI：0.38～0.81；P=0.002）。因此，他們認(rèn)為高水平的LDH是西羅莫斯用藥后OS較差的一個(gè)預(yù)后指標(biāo)。

2 循環(huán)血核酸標(biāo)志物

2.1 循環(huán)DNA（circulating cell-free DNA）

有研究發(fā)現(xiàn)，cDNA通過非致病的凋亡和腫瘤相關(guān)的壞死途徑釋放，在腫瘤患者和正常人群中的表達(dá)具有差異性，從而可以監(jiān)測早期RCC發(fā)展及藥物反應(yīng)[24]。Hauser S等[25]和Gang F等[26]研究發(fā)現(xiàn)，RCC患者中cfDNA表達(dá)水平及長度顯著高于健康志愿者。此外，在總cfDNA中，線粒體DNA同樣可以用來鑒別泌尿系統(tǒng)腫瘤患者與健康志愿者的差異。Lu H等[27]聯(lián)合分析了cfDNA長度和線粒體DNA，為了更加準(zhǔn)確地區(qū)分健康志愿者、患非轉(zhuǎn)移性RCC患者、轉(zhuǎn)移性RCC患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這三組人群中cfDNA和線粒體DNA有顯著性差異。

有證據(jù)表明，一些簡單的定量測量cfDNA含量的方法可以回顧性地鑒別RCC患者和健康志愿者。然而，這些方法目前并未應(yīng)用到RCC臨床診斷領(lǐng)域。腫瘤抑制基因VHL的失活與一部分RCC病例密切相關(guān)。De Martino M等[28]發(fā)現(xiàn)VHL和RASSF1A 兩個(gè)基因在患者cfDNA中相對于良性腫瘤呈高度甲基化狀態(tài)。這些結(jié)果也表明，對于一系列的RCC病例，分析cfDNA有助于RCC早期檢測和診斷。此外，一些臨床研究證明了cfDNA水平及長度與RCC預(yù)后的相關(guān)性。Gang F等[26]在研究中發(fā)現(xiàn)，手術(shù)治療RCC的患者其cfDNA片段越長，復(fù)發(fā)率越低。Wan J等[29]收集了患者腎癌切除前后的cfDNA水平，并且隨訪時(shí)間達(dá)3年之久，他們發(fā)現(xiàn)血漿cfDNA水平越高，腎癌復(fù)發(fā)率也越高。Feng G等[30]隨訪了患者接受索拉菲尼治療8～24周內(nèi)cfDNA水平，發(fā)現(xiàn)血漿內(nèi)cfDNA水平越高，其預(yù)后越差，在用藥8周時(shí)敏感性為66.7%，特異性為100%。因此在診斷RCC過程中，cfDNA可以用來監(jiān)測索拉菲尼的反應(yīng)，提供疾病復(fù)發(fā)的潛在依據(jù)。

2.2 循環(huán)MicroRNA

MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)生的、長度約為18～24個(gè)核苷酸的小RNA，其在細(xì)胞內(nèi)并不翻譯成蛋白質(zhì)，然而在細(xì)胞分化、生物發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。有文獻(xiàn)表明，miRNA通過調(diào)控腫瘤相關(guān)蛋白，從而調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[31]。因此，一些miRNA扮演著原癌基因的作用，另一些則扮演抑癌基因的作用，這些miRNA調(diào)節(jié)著細(xì)胞內(nèi)各種各樣的細(xì)胞信號通路，包括HIF-VHL缺氧途徑和上皮至間質(zhì)轉(zhuǎn)變途徑[32]。

與cfDNA類似，循環(huán)miRNA對于RCC的診斷具有高度敏感性。Gu L等[33]針對腎癌的miRNA腫瘤分子標(biāo)志物做了一個(gè)薈萃分析，他們納入了27篇文獻(xiàn)共2578名研究對象，發(fā)現(xiàn)有8種原癌性miRNA（miR-21、miR-1260b、miR-210、miR-100、miR-125b、miR-221、miR-630和miR-497）和10種抑癌性miRNA（miR-106b、miR-99a、miR-1826、miR-215、miR-217、miR-187、miR-129-3p、miR-23b、miR-27b和miR-126）與RCC不良預(yù)后相關(guān)。其中，miR-21與miR-126與OS呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。Fedorko M等[34]比較了195例RCC患者和100例健康志愿者，發(fā)現(xiàn)血清中高表達(dá)miR-378和miR-210診斷RCC具有80%的敏感性和78%的特異性。之后他們收集了20例腎臟部分切除患者資料，發(fā)現(xiàn)3個(gè)月后miR-378和miR-210顯著性下調(diào)。然而，雖然miR-378水平上調(diào)與臨床分期和無疾病生存期（disease-free survival，DFS）呈正相關(guān)，然而對于OS卻沒有診斷意義。Zhao A等[35]為了評估m(xù)iR-210能否作為診斷RCC的腫瘤分子標(biāo)志物，他們比較了32例RCC患者與42例健康對照人群，發(fā)現(xiàn)血清中miR-210水平顯著性高于對照組，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在RCC患者進(jìn)行手術(shù)后1周，其血清miR-210水平顯著下調(diào)。因此，他們認(rèn)為，血清miR-210可以作為新的檢測RCC的腫瘤分子標(biāo)志物。

循環(huán)miRNA也可以作為蘇尼替尼用藥后的預(yù)測性分子標(biāo)志物。Gamez-Pozo A等[36]將蘇尼替尼用藥后的RCC患者分為兩組，一組是12名超過6個(gè)月有不良反應(yīng)的患者，另一組是10名至18個(gè)月之前均沒有不良反應(yīng)的患者。他們發(fā)現(xiàn)兩組中有28個(gè)miRNAs具有差異表達(dá)，并以此構(gòu)建不良反應(yīng)和預(yù)后的預(yù)測模型。

miRNAs在免疫失調(diào)中也扮演十分重要的作用。Gigante M等[37]從25名RCC患者和15名正常健康志愿者中分離出細(xì)胞毒性T細(xì)胞，并檢測其中miRNAs表達(dá)含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RCC患者細(xì)胞毒性T細(xì)胞中相對于健康志愿者，其miR-29b和miR-198水平顯著性高表達(dá)。進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)表明，miR-29b和miR-198分別可以抑制MCL-1（抗凋亡途徑中，BCL2家族蛋白的一部分）和JAK3蛋白表達(dá)（T細(xì)胞增殖重要的信號激酶），因此，他們認(rèn)為這些過表達(dá)的miRNA是被誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞免受凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤的生長。此外，臨床上如PD-1抑制劑Nivolumab和Atezolizumab藥物都被報(bào)道與細(xì)胞毒性T細(xì)胞異常相關(guān)[38，39]。因此，細(xì)胞毒性T細(xì)胞中的miRNAs可能作為RCC的循環(huán)腫瘤分子標(biāo)記物。

3總結(jié)與展望

我們知道，近十多年來腎癌的治療方法較以往有了長足的進(jìn)步。尤其以索拉非尼和舒尼替尼為代表的酪氨酸激酶抑制劑和抗血管生成藥物，這些藥物徹底改變了轉(zhuǎn)移性腎癌的治療方式，使轉(zhuǎn)移性腎癌的治療從以往的免疫治療時(shí)代過渡到現(xiàn)在的分子靶向治療時(shí)代，并顯著延長了晚期轉(zhuǎn)移性腎癌患者的PFS和OS時(shí)長。

但與此同時(shí)，臨床工作者發(fā)現(xiàn)并非所有的轉(zhuǎn)移性腎癌患者對上述藥物均有良好的反應(yīng)，且分子靶向治療方式價(jià)格昂貴的同時(shí)也存在一定的副作用。因此如何選擇合適的患者進(jìn)行分子靶向治療，并在用藥前準(zhǔn)確評估相關(guān)患者的預(yù)后，成為迫切需要解決的問題。

在本綜述中我們提到特異性循環(huán)蛋白及核酸分子標(biāo)志物對于疾病的預(yù)后、進(jìn)展及治療反應(yīng)具有重要的預(yù)測作用。然而，關(guān)于預(yù)測治療反應(yīng)或抗性的循環(huán)腫瘤分子標(biāo)志物在未來需要進(jìn)行進(jìn)一步的了解及研究，也需要開展更大的前瞻性實(shí)驗(yàn)，以證實(shí)其在某種治療中的敏感性或者抗性。最終，我們相信預(yù)測性的腫瘤分子標(biāo)志物可以作為一種新型臨床策略應(yīng)用于臨床并指導(dǎo)實(shí)踐。

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（收稿日期：2016-07-06）