鋅轉(zhuǎn)運體對男性（雄性）生殖作用的研究進展

施磊，蔣晨依，吳望舒，朱欣燁，余承瑄，劉悅，丁之德

鋅轉(zhuǎn)運是指鋅在細胞內(nèi)或細胞間的運輸過程。鋅轉(zhuǎn)運過程主要由兩大蛋白家族調(diào)控，即鋅轉(zhuǎn)運蛋白家族（Zinc transporter，ZnT）和鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運蛋白家族（Zrt-，Irt-like protein，ZIP）[1]。前者能將鋅由胞質(zhì)中轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)外（包括胞外基質(zhì)、囊泡與細胞器），后者則將鋅由胞質(zhì)外轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)中。在男性生殖系統(tǒng)中，鋅被認為是精子發(fā)生過程中主要營養(yǎng)物質(zhì)之一[2]。鋅在男性的睪丸、附睪和前列腺中都有分布，參與保護睪丸Sertoli細胞、促進睪酮生成等過程；而鋅轉(zhuǎn)運體能精確調(diào)控各組織和生精細胞中鋅的含量，并在這些過程中發(fā)揮了重要作用。

1 鋅轉(zhuǎn)運體

1.1 ZnT家族

1.1.1 ZnT家族的結(jié)構(gòu)特點 ZnT家族又稱膜運輸?shù)鞍准易?0（solute carrier 30，SLC30），是一類膜運輸?shù)鞍?，介?dǎo)鋅由胞質(zhì)中轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)外。目前在人體中已發(fā)現(xiàn)10個家族成員（ZnT1～10）。除ZnT5、ZnT6外，其他成員均以同二聚體的形式存在于質(zhì)膜上。目前人類ZnT家族的X衍射晶體結(jié)構(gòu)還未能獲得，但細菌來源的同源物YiiP晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)明晰，因此，可以由二者序列的相似性推測人類ZnT家族蛋白的結(jié)構(gòu)[3]。據(jù)推測，ZnT家族成員均有6個保守的跨膜結(jié)構(gòu)域（TMs）。氨基（N）端與羧基（C）端均位于胞質(zhì)側(cè)[4]。TM2和TM5之間有4個親水性的殘基，可能具有結(jié)合鋅的功能[5]?？拷麮端的部分有一個可以結(jié)合2個鋅離子的位點。此外，大部分ZnT家族的成員在TM4與TM5之間有一個富含組氨酸的套環(huán)（histidine-rich loop）結(jié)構(gòu)[3]。

1.1.2 ZnT家族的定位與功能 ZnT1兼有促進胞質(zhì)內(nèi)鋅外流[6]和抑制鋅通過L型鈣通道（L-type calcium channel，LTCC）內(nèi)流[7]的功能。除了能夠調(diào)控細胞內(nèi)外鋅的分布外，ZnT1還能夠通過與RAF原癌基因絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶1（RAFproto-oncogene serine/threonine-protein kinase-1，Raf-1）結(jié)合啟動胞外信號反應(yīng)激酶（ERK）信號通路，從而調(diào)控靶細胞的生理活動。ZnT2的功能與其細胞內(nèi)定位有關(guān)。研究表明，定位于內(nèi)體（endosome）和分泌小室（secretory compartment）的ZnT2能夠?qū)\離子從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到小泡并最終分泌，而定位于質(zhì)膜的ZnT2與胞質(zhì)鋅轉(zhuǎn)運出細胞有關(guān)。ZnT2同樣可存在于線粒體內(nèi)膜，并對線粒體鋅池（zinc pool）的維持和擴大起到重要作用。ZnT3在大腦和睪丸組織中特異性高表達。目前研究較為明確的是定位于大腦谷氨酸能神經(jīng)元的ZnT3，其作用可將鋅離子轉(zhuǎn)運至突觸小泡[8]。睪丸組織的ZnT3的具體功能尚不清楚，推測其參與了精子發(fā)生過程中鋅離子的轉(zhuǎn)運。ZnT4、ZnT5、ZnT6與ZnT7擁有相似的生理學(xué)功能。研究顯示，組織非特異性堿性磷酸酶（tissue non-specific alkaline phosphatase，TNAP）的激活受ZnT1、ZnT4、ZnT5、ZnT6和ZnT7共同調(diào)控[9]。此外，ZnT4、ZnT5、ZnT6和ZnT7在前列腺腺上皮細胞中均有表達，它們可能共同參與了轉(zhuǎn)運鋅進入腺上皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和（或）高爾基體以維持鋅穩(wěn)態(tài)過程。ZnT8主要在胰島β細胞的胰島素分泌小泡上表達，對于胰島素晶體的形成十分重要。ZnT8在睪丸組織中也有表達，其功能可能與睪酮合成有關(guān)[10]。ZnT9具有啟動Wnt信號通路和維持鋅穩(wěn)態(tài)的雙重功能，而目前研究顯示ZnT10是錳轉(zhuǎn)運體，其作為鋅轉(zhuǎn)運體的功能還尚未被發(fā)現(xiàn)[11]。表1為ZnT家族在男性生殖系統(tǒng)中的分布及亞細胞定位。

1.2 ZIP家族

1.2.1 ZIP家族的結(jié)構(gòu)特點 ZIP家族又稱膜運輸?shù)鞍准易?9（solute carrier 39，SLC39），是一類介導(dǎo)鋅攝入的跨膜蛋白。目前已在人體中發(fā)現(xiàn)14個成員（ZIP1～14）。根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)特點，ZIP家族又可分為4個亞家族，即LIV-1、subfamilyⅠ、subfamilyⅡ和gufA。大部分ZIP家族成員具有8個保守的跨膜域[5]。N端與C端均位于胞質(zhì)外側(cè)，即細胞器膜內(nèi)側(cè)或質(zhì)膜外側(cè)。其中N端很長且富含組氨酸，可能與鋅的轉(zhuǎn)運有關(guān)，而C端則非常短[4]。大部分ZIP在TM3和TM5之間有一個套環(huán)（loop）區(qū)域，其中有一段富含組氨酸的序列。TM4與TM5為具有雙親性（amphiphile）即親水性和親脂性（疏水性）的螺旋，被認為可形成一個供金屬離子穿過的腔隙[4]。

表1 ZnT家族在男性生殖系統(tǒng)中的主要分布及亞細胞定位

1.2.2 ZIP家族的定位與功能 ZIP1主要分布在質(zhì)膜上，負責將胞外鋅轉(zhuǎn)運至胞質(zhì)內(nèi)。ZIP2和ZIP3都是重要的鋅攝入轉(zhuǎn)運體。ZIP4主要表達于人表皮角質(zhì)形成細胞（human epidermal keratinocyte），其編碼基因突變會導(dǎo)致腸病性肢端皮炎（acrodermatitis enteropathica）。研究發(fā)現(xiàn)，敲除ZIP4基因會導(dǎo)致角質(zhì)形成細胞胞質(zhì)中鋅含量下降以及鋅結(jié)合蛋白ΔNp63轉(zhuǎn)錄活性降低，致使表皮最上層角質(zhì)形成細胞增殖，提示ZIP4在維持表皮角質(zhì)形成細胞鋅穩(wěn)態(tài)中有重要作用[12]。ZIP5存在于睪丸中，在Sertoli細胞和精原細胞的質(zhì)膜上均有表達。需要指出的是，盡管Sertoli細胞質(zhì)膜上有ZIP1，但在Sertoli細胞主要負責鋅內(nèi)流的轉(zhuǎn)運體是ZIP5[13]。ZIP6和ZIP10擁有相似的亞細胞定位，主要位于質(zhì)膜[14]。在睪丸中，ZIP6和ZIP10都特異性表達于精子細胞，推測兩者可能在精子發(fā)生過程中發(fā)揮富集鋅的作用。另外，與其他ZIP家族的轉(zhuǎn)運體不同，ZIP7主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，其功能是將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)儲存的鋅釋放到胞質(zhì)中。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，通過ZIP7釋放到胞質(zhì)的鋅參與啟動多種與細胞增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)的信號通路，提示ZIP7在調(diào)控細胞正常生理活動方面有一定作用[15]。ZIP8和ZIP14是兩個在進化上非常相近的轉(zhuǎn)運體。過去的研究更注重于這兩者在免疫方面的功能，而近期的研究表明，在男性生殖系統(tǒng)中，ZIP8和ZIP14的主要作用是為精母細胞發(fā)育提供鋅。此外，在Leydig細胞表面也發(fā)現(xiàn)了ZIP14的表達，推測其能夠在睪酮合成和分泌過程中提供鋅。ZIP9除了作為鋅轉(zhuǎn)運體之外，近年來還被發(fā)現(xiàn)是一種重要的睪酮受體[16]。ZIP11是gufA亞家族的唯一成員，關(guān)于它的研究較少?，F(xiàn)已知ZIP11具有增加胞內(nèi)鋅濃度和金屬硫蛋白表達的功能。ZIP12在人腦中高度表達，敲除后雖不影響神經(jīng)元細胞活力，但神經(jīng)元產(chǎn)生的突起明顯變少且變短，提示ZIP12在大腦發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用。而目前未有研究發(fā)現(xiàn)睪丸組織中ZIP12的具體功能。ZIP13的亞細胞定位非常特殊，有研究認為ZIP13存在于高爾基體，而Jeong等[17]的研究顯示ZIP13存在于細胞內(nèi)富含鋅的小泡中，但該小泡與已知細胞器的關(guān)系尚不清楚。目前已知ZIP13編碼基因的缺陷會引起Spondylocheirodysplasia-Ehlers-Danlos綜合征（Spondylocheirodysplasia-Ehlers-Danlos syndrome，SCD-EDS），Jeong等[17]在研究了SCD-EDS患者和未受影響的雜合子親代（heterozygous parent）的原代成纖維細胞以及ZIP13靶向小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染的HeLa細胞和非靶向?qū)φ盏腍eLa細胞后，推測ZIP13可將鋅從這些小泡中轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)，從而維持細胞內(nèi)鋅穩(wěn)態(tài)。表2為ZIP家族在男性生殖系統(tǒng)中的分布及亞細胞定位。

表2 ZIP家族在男性生殖系統(tǒng)中的主要分布及亞細胞定位

2 鋅轉(zhuǎn)運體在男性（雄性）生殖系統(tǒng)中的作用

2.1 鋅轉(zhuǎn)運體在睪丸中的作用

2.1.1 鋅轉(zhuǎn)運體與睪丸組織 大量實驗證明，睪丸組織中鋅在細胞分配失調(diào)，尤其是鋅的缺乏，會導(dǎo)致睪丸功能受損。具體機制可能為氧化應(yīng)激水平的上升，凋亡通路的激活以及炎癥因子的釋放等[18]。由此推測，鋅轉(zhuǎn)運體的正常分布對睪丸組織的保護起著重要作用，保證了鋅在各種細胞中的合理分配，使鋅發(fā)揮其正常的生理功能。盡管鋅轉(zhuǎn)運體在睪丸組織的大部分細胞中均有分布，但鋅轉(zhuǎn)運體如何調(diào)控睪丸組織中各種細胞內(nèi)鋅分配的機制或通路目前尚未完全闡明，如睪丸如何從血液循環(huán)中獲得鋅，如何調(diào)控精子發(fā)生中鋅的轉(zhuǎn)運。

2.1.2 鋅轉(zhuǎn)運體與生精細胞 鋅轉(zhuǎn)運體在生精細胞中有著獨特的表達，參與了精子發(fā)生。在精子發(fā)生過程中，各階段的生精細胞對于胞內(nèi)鋅含量有著不同的要求，而這依賴于鋅轉(zhuǎn)運體的差異化表達。有研究檢測了表達于大鼠粗線期精母細胞與圓形精子細胞上的鋅轉(zhuǎn)運體，發(fā)現(xiàn)二者的鋅轉(zhuǎn)運體的表達不盡相同。ZnT6在粗線期精母細胞中的表達量為圓形精子細胞的5倍。ZIP12在圓形精子細胞中的表達量則是粗線期精母細胞中的5倍。進一步對于鋅攝入的測定表明，這樣的差異直接導(dǎo)致了二者胞內(nèi)鋅含量的不同。研究人員推測，這很可能是由于相對于粗線期精母細胞，處于精子發(fā)生后期的圓形精子細胞需要更多的胞內(nèi)鋅含量以完成染色質(zhì)凝聚（condensation）等改變[19]。另一項對于小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，精原細胞特異性表達ZIP14，而初級精母細胞、次級精母細胞則表達ZIP5，但兩者的功能都主要為攝入鋅。精母細胞還會通過調(diào)節(jié)ZIP8和ZIP10的表達量以輔助鋅的攝入[20]。

此外，鋅轉(zhuǎn)運體也為精子細胞變形提供了重要保障。在精子細胞變形的過程中，一些特定的過程需要鋅轉(zhuǎn)運至胞質(zhì)，而且不同階段精子細胞質(zhì)膜表面的鋅轉(zhuǎn)運體種類也不同。圓形精子細胞表達ZIP6、ZIP8和ZIP10，而正在伸長的精子細胞表達ZIP1和ZIP6，不再表達ZIP8與ZIP10。這種精子細胞質(zhì)膜上鋅轉(zhuǎn)運體表達的變化除了可能與質(zhì)膜特定區(qū)域的喪失有關(guān)，也可能與某些鋅轉(zhuǎn)運的途徑不再被需要關(guān)聯(lián)[20]。

2.1.3 鋅轉(zhuǎn)運體與睪丸其他細胞 鋅轉(zhuǎn)運體除直接參與精子發(fā)生過程外，還涉及構(gòu)建適宜的睪丸微環(huán)境。睪丸Sertoli細胞表達ZnT1、ZIP5和ZIP9[16]，其中ZnT1水平明顯高表達。結(jié)合精母細胞特異性表達ZIP14的事實，有學(xué)者推測鋅在睪丸內(nèi)的轉(zhuǎn)運方向是從Sertoli細胞轉(zhuǎn)入精母細胞。此外，ZnT1可能與血睪屏障的功能有關(guān)。Sertoli細胞質(zhì)膜上的ZIP9可與睪酮結(jié)合，進而通過與G蛋白的作用觸發(fā)睪酮的非經(jīng)典信號通路（non-classical testosterone signaling cascade），促進了緊密連接蛋白（claudin）的表達和緊密連接的形成，提示ZIP9對血睪屏障的維持有一定作用[16]。

另一方面，鋅轉(zhuǎn)運體與睪酮的生成密切相關(guān)。ZnT7在小鼠睪丸的Leydig細胞中表達，并且可能參與類固醇合成[21]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)人絨毛膜促性腺激素處理的新生小鼠Leydig細胞中，ZnT8的表達顯著上升，與此同時，血清睪酮水平也有明顯升高。后續(xù)實驗指出，ZnT8基因敲除的小鼠血清睪酮水平遠低于正常小鼠，進一步證明ZnT8在睪酮生物合成中起到關(guān)鍵作用。具體機制可能為ZnT8通過影響蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）信號通路進而影響線粒體中的鋅含量[10]。而表達于Leydig細胞質(zhì)膜上的ZIP14則主要負責將鋅轉(zhuǎn)入細胞，轉(zhuǎn)入的鋅繼而參與了睪酮的生物合成[20]。鋅在5α-還原酶激活過程中至關(guān)重要，5α-還原酶為睪酮轉(zhuǎn)化成生物活性形式5α-二氫睪酮所必需，而鋅缺乏可使大鼠睪丸中參與睪酮合成酶的mRNA和蛋白水平均明顯降低，最終導(dǎo)致睪酮合成量下降。

2.2 鋅轉(zhuǎn)運體在附睪中的作用 鋅在附睪部位的轉(zhuǎn)運方向是從附睪上皮細胞到儲存的精子。附睪組織的鋅含量高于睪丸組織，但仍低于輸精管和精囊[13]。鋅轉(zhuǎn)運體可在附睪的不同部位表達[22]。免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)，ZnT1在幾乎所有附睪腔面的假復(fù)層纖毛柱狀上皮內(nèi)高表達，尤其是主細胞（principal cell）和基細胞（basal cell）。ZnT2在附睪管的腔面呈高表達且大部分在主細胞內(nèi)，而圍繞管腔的肌細胞（myoid cell）表達較少。ZIP家族中只有ZIP6和極少量的ZIP5被發(fā)現(xiàn)在主細胞有高表達[13]。由鋅轉(zhuǎn)運體維持的高鋅含量對于附睪行使正常生理功能有著重要意義。一方面，高鋅含量有助于維持附睪特異性蛋白谷胱甘肽過氧化物酶5（glutathione peroxidase 5，GPX5）的表達[23]。GPX5保護精子質(zhì)膜免受活性氧損傷。另一方面，附睪組織內(nèi)逐漸增多的鋅儲備及以ZnT家族蛋白為主導(dǎo)的表達模式是細胞外高鋅環(huán)境的兩個先決條件，附睪管道內(nèi)的高鋅濃度為附睪內(nèi)精子提供了鋅內(nèi)流的強大驅(qū)動力。

然而，與附睪組織的鋅轉(zhuǎn)運體表達模式相反，附睪精子表面僅表達ZIP1、ZIP5、ZIP6和ZIP8，不表達ZnT家族蛋白[13]。這說明附睪精子在細胞程序性設(shè)定上是吸收鋅的過程。原子吸收光譜測定法（atomic absorption spectrometry）證實附睪精子具有高效吸收鋅的能力，因此其鋅含量明顯高于睪丸精子[13]。吸收的鋅主要聚集在精子的頸部和中段，推測是為精子運動力的獲得（motility acquisition）做好準備[24]。需要指出的是，免疫熒光、原子吸收光譜和金屬自顯影技術(shù)（autometallography）顯示精子獲得運動力之后在整個細胞內(nèi)呈現(xiàn)出鋅的減少[13]。早期的研究在海星精子中發(fā)現(xiàn)類似的變化，由此研究者假設(shè)聚集在精子中段的鋅被胞外高親和力的物質(zhì)（如組氨酸和金屬螯合劑）捕獲，鋅的外向轉(zhuǎn)運起到催化啟動精子運動的作用，但由于附睪精子表面未檢測到ZnT家族蛋白表達，因此，該鋅的外向轉(zhuǎn)運如何實現(xiàn)還有待于進一步研究。此外，精子在附睪成熟中經(jīng)歷了染色質(zhì)凝聚等變化。精子內(nèi)逐漸升高的鋅含量可能與染色質(zhì)的重塑（remodeling）和壓縮（compaction）有關(guān)[13]。雖然形態(tài)學(xué)實驗已證明鋅能夠穩(wěn)定精子的染色質(zhì)和膜結(jié)構(gòu)，然而鋅轉(zhuǎn)運體參與精子成熟的具體機制仍需要進一步實驗來證明。

2.3 鋅轉(zhuǎn)運體在前列腺中的作用 前列腺是人體內(nèi)鋅含量最高的器官。在前列腺外周層的腺上皮分泌細胞中，每千克的濕重其鋅含量高達3μmol。前列腺鋅的功能主要與細胞代謝及增殖有關(guān)：一方面可以競爭抑制順烏頭酸酶，保護檸檬酸不被氧化，進而保護精子不被氧化。另一方面，胞質(zhì)內(nèi)鋅通過調(diào)控線粒體產(chǎn)能效率，抑制細胞增殖，誘導(dǎo)凋亡。低鋅含量與前列腺癌的發(fā)病密切相關(guān)，但鋅離子調(diào)控前列腺腺上皮細胞的增殖與凋亡的生理學(xué)意義還有待研究[25]。

精漿中的鋅濃度與前列腺功能有關(guān)。正常生育男性的精液中含高水平游離鋅 [每100 mL含鋅（14.08±2.01）mg]，其含量遠高于不育男性組[每100 mL含鋅（10.32±2.98）mg][2]。精漿的鋅可能和精子的抗氧化、損傷修復(fù)和生殖管道的免疫獲得有關(guān)[2]。

參與前列腺鋅分泌與轉(zhuǎn)運的鋅轉(zhuǎn)運體主要來自ZnT家族。ZnT2分布在前列腺所有細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，其功能可能是使細胞胞質(zhì)中鋅含量達到最適水平。ZnT4、ZnT5、ZnT6和ZnT7分布于高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其轉(zhuǎn)運的鋅可能最終被分泌到胞外。ZIP1定位于前列腺腺上皮細胞的基底面，而在基底細胞中無表達[26]。該蛋白能快速轉(zhuǎn)運血液中的鋅，以維持前列腺腺上皮細胞內(nèi)高鋅含量。ZIP2、ZIP3和ZIP4定位于前列腺腺上皮細胞的腔面，主要通過重吸收精漿中鋅以維持細胞內(nèi)鋅穩(wěn)態(tài)[27-28]。ZIP9被發(fā)現(xiàn)定位于人前列腺癌PC-3細胞系的質(zhì)膜，與Sertoli細胞質(zhì)膜上ZIP9機制類似。ZIP9與睪酮結(jié)合后可激活G蛋白。然而，ZIP9在前列腺癌細胞中引發(fā)的信號通路下游靶蛋白與其在Sertoli細胞中不同，ZIP9可激活腫瘤細胞的線粒體凋亡通路，同時增加胞內(nèi)鋅含量，加速細胞凋亡進程[29]。

3 結(jié)語

綜上所述，正常的鋅轉(zhuǎn)運過程有利于男性（雄性）生殖系統(tǒng)中鋅代謝的穩(wěn)態(tài)平衡，在精子發(fā)生和成熟中起著重要作用。鋅轉(zhuǎn)運異常將會影響生精上皮中生精細胞的正常發(fā)育、睪丸間質(zhì)中Leydig細胞的睪酮生物合成、附睪中精子運動力的獲得以及前列腺腺上皮中鋅的重吸收等過程，最終導(dǎo)致男性（雄性）生育力受損。鋅的代謝過程均需要鋅轉(zhuǎn)運體參與。然而，目前這一領(lǐng)域研究仍存在著大量的未知性：如人鋅轉(zhuǎn)運體家族的X衍射晶體結(jié)構(gòu)如何，鋅轉(zhuǎn)運體的mRNA與蛋白在同一細胞內(nèi)含量差別巨大的原因等。因此，更進一步闡明鋅及轉(zhuǎn)運體在男性（雄性）生殖系統(tǒng)中的具體作用機制，不僅可為臨床弱精子癥及其他男科疾病發(fā)病機制的探索提供新線索，同時也有望成為這些疾病治療的潛在性靶點。