尼龍膜套管分離技術(shù)對(duì)混合斑中精子細(xì)胞DNA的提取

馬 駿 ，童 奇 ，高良弼 ，朱 川 ，江志強(qiáng)

（1.長(zhǎng)興縣公安司法鑒定中心，浙江 長(zhǎng)興 313100；2.安吉縣公安司法鑒定中心，浙江 安吉 313300）

法醫(yī)DNA分析技術(shù)在刑事司法實(shí)踐中的作用日益凸顯。大多數(shù)性侵案件中，常常遇到混合斑的DNA檢驗(yàn)，如何從女性陰道分泌液與男性精液組成的混合斑中獲得精子細(xì)胞是檢驗(yàn)鑒定的關(guān)鍵，而精子的個(gè)體來(lái)源鑒定又是案件偵破和訴訟的關(guān)鍵。一般此類(lèi)混合斑的檢材載體類(lèi)型較多，采用常規(guī)的差異裂解法[1]對(duì)精子細(xì)胞進(jìn)行分離，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，步驟繁瑣，特別是在女性陰道上皮細(xì)胞大量存在而精子細(xì)胞較少時(shí)，很難獲得完整、單一的精子細(xì)胞DNA分型，有時(shí)即使獲得了分型結(jié)果，也多為混合分型[2]。而在實(shí)踐中面對(duì)大量檢材時(shí)，常要求在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行精子細(xì)胞的提取，但存在消耗時(shí)長(zhǎng)和提取效率之間的不平衡。基于此，筆者運(yùn)用尼龍膜套管分離技術(shù)，建立一種新型的混合斑中精子細(xì)胞分離的方法，以有效解決上述難題。

1 材料與方法

1.1 材料

40份男女性混合斑檢材來(lái)源于長(zhǎng)興縣公安局所承辦的性侵案件，其中陰道拭子26份、內(nèi)褲8份、床單3份、衛(wèi)生紙2份、衛(wèi)生棉1份。

1.2 主要試劑和儀器

人精液PSA檢測(cè)金標(biāo)試劑條（德國(guó)MERCK公司），硅膜試劑盒（Forensic DNA Extraction Kit for Soft Tissues，加拿大 Pulse 公司），AmpF?STR?Identifiler?Plus PCR擴(kuò)增試劑盒（美國(guó)AB公司）。

尼龍膜套管（加拿大Pulse公司），9700型PCR儀、3500xL基因分析儀（美國(guó)AB公司），5355型恒溫混勻儀（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.3 精子細(xì)胞分離方法

依據(jù)GA 766—2008人精液PSA檢測(cè)金標(biāo)試劑條法[3]對(duì)40份檢材（1～40號(hào)）進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果均呈陽(yáng)性，其中21、29號(hào)（陰道外口拭子）和36號(hào)（現(xiàn)場(chǎng)床單）檢材為弱陽(yáng)性。對(duì)所有樣本分別采用常規(guī)差異裂解法和尼龍膜套管分離技術(shù)對(duì)精子細(xì)胞進(jìn)行分離。

1.3.1 常規(guī)差異裂解法

通過(guò)多波段光源照射，剪取40份檢材上可疑斑跡適量（約0.5cm×0.5cm），置于1.5mL離心管中，剪碎，加入 TNE 緩沖液 900 μL、10%SDS 裂解液 100 μL、10mg/mL蛋白酶K 7μL，37℃下置于5355型恒溫混勻儀上混勻4h。

將1.5mL離心管漩渦振蕩1min。采用套管離心法（離心半徑 7cm，5000r/min，離心 15 min），用 1 mL TNE緩沖液浸潤(rùn)后，以離心半徑7cm，5 000 r/min，離心10min，棄去上清液。外部1.5mL離心管得沉淀精子及女性DNA殘留物，加入1 mL TNE緩沖液重新懸浮，以離心半徑7cm，13000r/min，離心5min，重復(fù)3次后棄去上清液，得到精子細(xì)胞沉淀約50μL。

1.3.2 尼龍膜套管分離技術(shù)

通過(guò)多波段光源照射，剪取40份檢材上可疑斑跡適量（約0.4 cm×0.4 cm），置于2 mL離心管中，剪碎，加入 TNE緩沖液 1.35 mL、10%SDS裂解液 150 μL、10 mg/mL蛋白酶K 12 μL，56℃下置于 5355型恒溫混勻儀上混勻4h。

將2mL離心管漩渦振蕩1min，以離心半徑7cm，2500r/min，離心2min[4]，分批次吸取上清液加入尼龍膜內(nèi)套管中，10 000×g離心1 min，期間更換外套管。用600μL TNE緩沖液清洗離心管內(nèi)檢材1次，漩渦振蕩1min，以離心半徑 7cm，2500r/min，離心 2min，吸取上清液至前述尼龍膜內(nèi)套管中，10 000×g離心1min。用600μL TNE緩沖液清洗內(nèi)套管分離的精子細(xì)胞3次，10000×g離心1min，內(nèi)套管尼龍膜上得分離精子細(xì)胞。

為驗(yàn)證精子細(xì)胞是否完全被尼龍膜截獲，分別收集最后的清洗液，10000×g離心5min，得沉淀約50μL，按照精子細(xì)胞DNA提取方法提取，檢驗(yàn)是否有精子細(xì)胞被清洗濾過(guò)尼龍膜。

1.4 精子細(xì)胞DNA的提取、PCR擴(kuò)增與分型檢測(cè)

將分離所得的精子細(xì)胞使用硅膜試劑盒進(jìn)行提取。

經(jīng)過(guò)兩種方法提取的精子細(xì)胞DNA模板采用AmpF?STR?Identifiler?Plus PCR擴(kuò)增試劑盒在9700型PCR儀上進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為10μL，擴(kuò)增產(chǎn)物使用3500xL基因分析儀進(jìn)行電泳分離和激光掃描分析，采用GeneMapperTMID-X v1.4軟件分析獲得檢材的STR分型結(jié)果。

2 結(jié) 果

40份混合斑檢材采用兩種提取方法的分型結(jié)果見(jiàn)表1。采用尼龍膜套管分離技術(shù)分離的檢材僅3份有女性成分微弱殘留，其余均獲得了完整的單一男性精子細(xì)胞STR分型，峰值均在4000～30000RFU，均衡性較好。采用常規(guī)差異裂解法分離的檢材中，有25份完全未檢出男性精子細(xì)胞STR分型，15份檢出男性精子細(xì)胞STR分型（7份為不完整的男性精子細(xì)胞STR分型，6份有女性成分殘留，2份為完整的單一男性精子細(xì)胞STR分型）。

尼龍膜套管最后的清洗液沉淀中未檢出男性精子細(xì)胞，說(shuō)明在高速離心清洗時(shí)無(wú)精子細(xì)胞透過(guò)尼龍膜，精子細(xì)胞無(wú)明顯損失。

表1 40份混合斑檢材采用兩種提取方法的分型結(jié)果 （N=40）

3 討 論

性侵案件中混合斑檢材的載體類(lèi)型較為復(fù)雜，一般情況下，陰道拭子、內(nèi)褲較多。常規(guī)差異裂解法對(duì)精子細(xì)胞進(jìn)行分離，往往都在體積較小的1.5 mL離心管中[5]，振蕩分離時(shí)空間有限，不利于精子細(xì)胞與載體的分離。因此，混合斑中的精子細(xì)胞DNA能否檢驗(yàn)成功，關(guān)鍵在于能否實(shí)現(xiàn)精子細(xì)胞與載體的分離[6]。

尼龍膜套管包括柱狀內(nèi)管和2 mL離心外管，內(nèi)管直徑約8mm、長(zhǎng)2.5cm（最多可加入800μL液體），底部為孔徑0.45 μm的尼龍膜（經(jīng)過(guò)疏水處理），對(duì)DNA低吸附，在無(wú)離心力的作用下液體無(wú)法滲漏。精子細(xì)胞膜富含硫醇蛋白[7]，需在二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、β-巰基乙醇等還原劑的作用下才能打開(kāi)其中的二硫鍵，從而破膜釋放DNA[8]。精子細(xì)胞一般頭部長(zhǎng) 3.0～5.0μm、寬 2.0～3.0μm，體部長(zhǎng) 5.0～7.0μm、寬1.0μm，尾部長(zhǎng)40～60μm[9]，根據(jù)分子篩原理，當(dāng)消化后的混合液體流經(jīng)內(nèi)管后，未被消化的精子細(xì)胞經(jīng)過(guò)濾被攔截在尼龍膜內(nèi)，女性上皮細(xì)胞DNA成分隨溶液穿過(guò)尼龍膜進(jìn)入外套管內(nèi)，從而達(dá)到物理分離精子細(xì)胞的目的。

本研究在第一步消化時(shí)直接采用56℃孵育，能提高蛋白酶K的裂解效率（蛋白酶K在56～65℃時(shí)活性較高[10]），精子在硫醇蛋白的保護(hù)下不受影響，而女性上皮細(xì)胞則能夠基本消化干凈，運(yùn)用低速離心分離去除載體，再利用尼龍膜過(guò)濾，高速離心收集精子細(xì)胞，從而達(dá)到物理分離精子細(xì)胞的目的。尼龍膜套管具有疏水、低吸附DNA的特性，女性DNA成分幾乎不會(huì)殘留在尼龍膜上，清洗精子細(xì)胞時(shí)也不會(huì)因?yàn)椴僮饕蛩貙?dǎo)致精子細(xì)胞的損失，使得分離較為徹底。

本研究中有部分陰道中段拭子和棉質(zhì)內(nèi)褲的檢材通過(guò)尼龍膜套管分離技術(shù)檢出女性成分殘留，分析其原因是女性上皮細(xì)胞含量較多，增加洗滌次數(shù)可以解決該問(wèn)題。常規(guī)差異裂解法中部分載體（如床單、絲質(zhì)內(nèi)褲、衛(wèi)生紙、衛(wèi)生棉）檢出率較低，分析其原因是載體的纖維有較強(qiáng)的吸附力，精子細(xì)胞與載體分離不徹底，與尼龍膜套管分離技術(shù)相比，常規(guī)差異裂解法洗脫能力有限。因此，尼龍膜套管分離技術(shù)檢出完整的單一男性分型的數(shù)量要高于常規(guī)差異裂解法，尼龍膜對(duì)于精子細(xì)胞的分離也較為徹底。

當(dāng)然，混合斑中精子細(xì)胞的分離方法還有很多，如激光捕獲顯微切割技術(shù)、顯微操作、流式細(xì)胞儀技術(shù)、免疫磁珠沉淀等[8]，但是，多數(shù)方法對(duì)于實(shí)驗(yàn)操作者的經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)要求較高，基層實(shí)驗(yàn)室在相關(guān)儀器設(shè)備的配備上也有限制，因此，在大量的日常檢案中很難發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究建立的尼龍膜套管分離技術(shù)適用于混合斑中精子細(xì)胞的分離，可以將混合斑中精子細(xì)胞和女性細(xì)胞的DNA徹底分離，減少精子損失，特別是對(duì)含有大量女性細(xì)胞且精子細(xì)胞較少的檢材提取效果明顯，整個(gè)提取實(shí)驗(yàn)成本低廉、快速簡(jiǎn)便，無(wú)需特殊設(shè)備，在日常檢案中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。