法醫(yī)物證學(xué)中精陰混合斑分離檢驗方法的研究進展

石 瑀，尚雋博，羅珮云，李凌睿，趙 宇，劉宇萱，王保捷，姚 軍,*

（1. 中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，沈陽 110122；2. 中國醫(yī)科大學(xué)臨床三系，沈陽 110122）

性侵犯罪在刑事案件中的占比呈逐年增長態(tài)勢，根據(jù)《2019年中國性侵司法案件大數(shù)據(jù)報告》，2017年審結(jié)的強奸案數(shù)量為2 881例，幾近2014年的兩倍。該類犯罪社會危害性大，對受害者會造成長期的身心傷害。因此，迅速、準確地偵破該類案件對警示不法分子、維護社會正常秩序具有重要作用。在此類案件中，常見的生物檢材包括陰道/陰莖拭子、內(nèi)褲、床單、衛(wèi)生紙、安全套等，這些檢材多為含精子細胞和女性上皮細胞的混合物。在法醫(yī)物證學(xué)中，包含兩名或以上個體的混合生物檢材稱為混合斑（mixed stain）。對于精陰混合斑，可通過檢驗精液和陰道液中的特殊成分進行確證。近年，精液斑的確證試驗發(fā)展較快，有很多方法，但主要有兩種，即精子檢出法和免疫學(xué)試驗法。而對于陰道液的確證，當(dāng)前常用細胞學(xué)檢查和陰道肽酶測定兩種方法。此外，基于細胞和組織特異性的mRNA、microRNA、DNA甲基化標記等進行精陰混合斑的確證研究也取得了一定進展，為微量、陳舊性疑難精斑檢材的鑒定提供了新途徑[1]。然而，如何準確、高效地分離精陰混合斑中的精子細胞，并盡量避免女性上皮細胞成分的干擾是處理此類檢材的關(guān)鍵，對于案件定性和證據(jù)價值發(fā)揮具有至關(guān)重要的作用。但多數(shù)情況下，這類混合斑中女性個體上皮細胞含量高，而精子細胞卻相對較少，并且由于部分精陰混合斑附著的載體具有較強的粘附性，造成洗脫效率低，采用常規(guī)差異提取法對精子細胞進行分離檢驗往往非常困難，有時即使獲得了分型結(jié)果，也表現(xiàn)為多組分并存的混合分型[2]，難以對實驗結(jié)果進行分析和利用。針對精陰混合斑開發(fā)了許多分離檢驗技術(shù)，也有很多文獻對其做過綜合報道。本文著重從細胞和DNA兩個層面進行綜述，梳理有關(guān)文獻、重點闡述近年來國內(nèi)外的最新研究進展。

1 精陰混合斑細胞分離方法

1.1 差異裂解法

差異裂解法（different extraction）或稱兩步消化法（two-step lysis），于1985年由Gill等[3]提出。該方法利用精子細胞與陰道上皮細胞核表面的差異，將精陰混合斑檢材分兩步消化，從而獲取純的精子細胞DNA[4]。該法成本低、操作簡單，至今仍是國內(nèi)外大部分鑒定機構(gòu)及實驗室分離精陰混合斑的主要方法。然而，常規(guī)的差異裂解法分離效率較低，對于某些微量、陳舊性的檢材或精陰混合斑中精子細胞含量相對較少的檢材，常會造成消化不完全或過度消化的情況，使精子細胞DNA損失，導(dǎo)致STR分型失敗。

近年來，許多研究者就其分離效率低等因素，對差異裂解法不斷進行了改良。2014年，Lounsbury等[5]通過改變第一次溫育時緩沖液的條件（增加緩沖液pH等），提升了精子細胞回收率；2017年，馬駿等[6]提出并建立尼龍膜套管技術(shù)，根據(jù)精陰細胞物理性狀差異以及分子篩的原理，將差異裂解法中第一次消化后所得的混合液利用尼龍膜套管分離精子細胞，該技術(shù)所需尼龍膜套管價格相對便宜，實驗操作簡單，耗時短，可將精陰混合斑中精子細胞和女性上皮細胞有效分離，減少了精子細胞的損失，特別適用于男女物質(zhì)比例懸殊、常規(guī)差異裂解法難以消化完全的精陰混合斑，有很好的應(yīng)用價值；2018年，Timken等[7]在原有基礎(chǔ)上增加“試管轉(zhuǎn)移”步驟，即將重新懸浮的精子沉淀移至新試管中，再進行第二次溫和裂解和隨后的洗滌，大大提升了精子細胞的DNA純度；2020年，趙凱等[8]發(fā)現(xiàn)在差異裂解法中利用硅珠提取方法，能獲得良好的靈敏度及抗抑制能力，效果優(yōu)于免疫磁珠法，并可廣泛適用于各種法醫(yī)檢材；2020年，Kim等[9]使用蘇木精（0.03%，體積分數(shù)）對精子細胞染色，通過差異提取過程觀察染色的細胞，減少了多個洗滌步驟導(dǎo)致的精細胞損失；2020年，何佳烘等[10]報道，在前期處理混合斑時增加純化和二次消化步驟，對于混有女性陰道血或男女物質(zhì)比例懸殊的檢材，除去女性血液成分后，經(jīng)洗滌可使細胞碎片與精子沉淀分開，能減少精陰混合斑中精子的損失，大大增加精子細胞分離的成功率。

為使差異裂解法標準規(guī)范化，節(jié)省人力并避免與含有SDS等毒性有機物的消化液直接接觸，不少研究者利用機器人等技術(shù)對差異裂解法做出改進以實現(xiàn)自動化：2019年，Timken等[11]通過使用Hamilton AutoLys STAR系統(tǒng)對差異裂解法實現(xiàn)自動化，該系統(tǒng)配備有方法所需的溫育、振蕩和離心等步驟的相關(guān)組件，能實現(xiàn)上述步驟的完全自動化，經(jīng)與手動操作對比，證明該法具有可行性；2020年，Goldstein等[12]通過QIAcube自動樣品制備系統(tǒng)實現(xiàn)了差異裂解法的自動化，降低了下游混合物的干擾，提高了STR配置文件的質(zhì)量，顯著減少了動手時間。

1.2 顯微捕獲法

1.2.1 激光捕獲顯微切割技術(shù)

激光捕獲顯微切割技術(shù)（laser capture microdissection，LCM）是一種可以分離單個細胞的技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)對不同形態(tài)細胞的分離檢驗。單純LCM通過在組織切片上覆蓋一層透明的熱塑膜，根據(jù)精陰細胞的形態(tài)差異，利用激光經(jīng)顯微鏡直觀自動地從檢材中捕獲單細胞亞群或單個細胞[13]，從而實現(xiàn)精陰混合斑的分離檢驗。該技術(shù)針對性極強，能從復(fù)雜的精陰混合斑檢材中快速、準確地獲得微量的精子細胞，較傳統(tǒng)的差異裂解法在洗脫過程中損失掉的精子細胞更少[14]。但是對于男女物質(zhì)比例懸殊或精子細胞形態(tài)難以辨認的陳舊性檢材[15]，無法準確地分離出精子細胞。此外，由于LCM對設(shè)備要求較高，其也不便于在基層大規(guī)模普及。

2011年，Axler-DiPerte等[16]將LCM與免疫熒光染色技術(shù)結(jié)合進行精子細胞分離，通過將熒光染料核固定并與針對精子細胞的特異性抗體偶聯(lián)，對混合斑中的精子細胞進行HYLiterTM免疫熒光染色后，在直觀顯微鏡下辨認染色后的精子細胞并標記；2014年，楊帆等[17]把LCM與FISH相結(jié)合，利用X、Y染色體相對應(yīng)的特異性熒光探針，將X、Y染色體分別染成紅色和綠色，在觀察熒光信號時，先使用藍色熒光使細胞核輪廓清晰可見，定位后再調(diào)至紅綠色熒光，能夠快速定位細胞的位置。上述兩種方法，均適用熒光標記定位細胞位置，可以達到分離細胞的目的，能大大提高細胞的識別效率，且FISH能清晰地分辨陰道上皮細胞和精子細胞，便于精子細胞的識別，而對于精子細胞形態(tài)不規(guī)則的檢材，這種方法的優(yōu)勢就更明顯。

1.2.2 顯微操作法

顯微操作法更多運用于生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，F(xiàn)indlay等[18]于1997年首次利用顯微操作法實現(xiàn)單細胞的分離檢驗。該技術(shù)通過顯微操作儀，在不同倍鏡下調(diào)節(jié)吸吐旋鈕，利用顯微操作儀吸針將懸液中的精子細胞轉(zhuǎn)移至擴增液面，并對精子細胞準確計數(shù)[19]，從而可成功地從精陰混合斑中分離出精子細胞。該法優(yōu)點在于可直接獲取精陰混合斑中的精子細胞，減少模板損失，提高分型成功率，節(jié)省檢材，對精陰混合斑中微量精子的檢驗效果較好。2011年，黃江平等[20]采用單細胞顯微捕獲聯(lián)合低體積擴增技術(shù)，很好地分離了混合上皮細胞，有效解決了混合上皮細胞的分型問題；此外，由于低體積擴增體系的體積減小，節(jié)省了試劑，半球狀的密閉空間提供了最佳的微反應(yīng)環(huán)境，也提高了PCR反應(yīng)的靈敏度。但是該法儀器設(shè)備要求高，檢驗速度慢，對人員操作能力要求高，且單一精子DNA檢驗會出現(xiàn)隨機擴增問題，影響準確性，需要多次重復(fù)操作進行綜合研判。

1.3 微流控芯片技術(shù)

微流控芯片技術(shù)（microfluidic chip）是把生物學(xué)、化學(xué)等實驗操作過程集成到一塊芯片上，該芯片內(nèi)部至少要有一尺度為微米甚至納米的結(jié)構(gòu)，能夠自動完成實驗及分析的全過程[21]。細胞捕獲或分離區(qū)域和反應(yīng)檢測區(qū)是芯片的主要功能區(qū)，同時也是不同微型芯片的關(guān)鍵和特色區(qū)域[21]，可滿足不同的需求。該技術(shù)通過將精陰細胞混合液注射至微型芯片中，在特定區(qū)域根據(jù)不同的功能及特點，將細胞混合液中的精子細胞進行分離。該法優(yōu)點在于其上樣體積小、檢測結(jié)果單個周期短，能夠有效節(jié)省檢材與試劑，可快速檢測，耗時少。同時，該法適用于自動化檢測并能實現(xiàn)精子細胞的微觀操控和精確分析。

2009年，Norris等[22]根據(jù)聲波差異提取的原理，通過微流控芯片技術(shù)實現(xiàn)精陰細胞的分離，創(chuàng)立了聲波差異提取法。2015年，Liu等[23]基于精陰細胞的大小及流體動力學(xué)上的差異制造了一種微型芯片，大大提高了精子細胞DNA的分離效率。2018年，Inci等[24]利用微流控與Sialyl-LewisX寡糖序列結(jié)合，將精子細胞DNA的分離測定時間從原先的8 h減少到8 min，大大提高了精子分離的捕獲效率。2020年，Deshmukh等[25]將微流控芯片與手機成像系統(tǒng)相結(jié)合，通過精陰細胞之間的形態(tài)差異，利用代碼，實現(xiàn)二者分離，以期達到精子細胞DNA提取的目的。此外，還有研究者以微流控芯片為基礎(chǔ)，利用精陰細胞導(dǎo)電性及形狀不同，通過雙向電泳[26]的方法分離出精陰混合斑中的精子細胞。但是，微流控芯片技術(shù)是一項新興技術(shù)，其芯片的集成化、商品化程度還不高，技術(shù)也有待完善可靠，現(xiàn)尚沒有成熟的芯片產(chǎn)品面世。

1.4 孔徑過濾法

該方法根據(jù)精陰細胞形態(tài)學(xué)大小差異即陰道上皮細胞直徑（40～60 μm）遠大于精子細胞直徑（約6 μm），將精陰混合液通過不同孔徑的過濾網(wǎng)多次過濾，從而分離出精陰混合斑中的精子細胞。其利用成熟的過濾技術(shù)對精陰混合斑中的精子細胞進行分離富集，較差異裂解法分離速度快、操作簡單、經(jīng)驗要求不高、可實現(xiàn)精陰混合斑的快速分離檢驗。但是目前仍僅適用于常量的精陰混合斑檢材。

2018年，朱典等[27]通過對其發(fā)明的一種人體脫落上皮細胞濾器[28]作改良，利用不同孔徑的尼龍網(wǎng)格膜制作濾網(wǎng)，采用二重過濾的方法，快速分離并檢驗精子細胞，在數(shù)起案件檢驗中取得了良好的效果，具有一定的實際應(yīng)用價值。

1.5 免疫磁珠法

磁性分離技術(shù)其工業(yè)應(yīng)用已有很長的歷史。1979年Ugelstad等首次將該技術(shù)應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。近年來該技術(shù)也開始運用于法醫(yī)精陰混合斑中精子細胞的分離[29]，該技術(shù)通過制備與精子細胞表面特異性抗原相對應(yīng)的抗體，偶聯(lián)磁珠形成免疫磁珠，再使其與混合檢材中的精子細胞形成磁珠-抗體-精子細胞復(fù)合物，在外加磁場作用下就可實現(xiàn)定向捕獲并分離出精子細胞。

精子細胞的表面特異性抗原種類較多。2002年，Eisenberg等[30]根據(jù)精子細胞表面的3種特異性抗原制備免疫磁珠，成功分離出了精陰混合斑中的精子細胞；2007年，Anslinger等[31]篩選出3種抗血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抗體并制備成免疫磁珠，實現(xiàn)了精陰混合斑中精子細胞的分離，擴大了免疫磁珠的選擇范圍；2011年，趙興春等[32]利用抗人精子魚精蛋白抗體和抗-SPAG8抗體構(gòu)建免疫磁珠，制作特異性定向捕獲復(fù)合體，實現(xiàn)了精子細胞定向富集和分離，初步建立了捕獲試劑體系；2015年，李學(xué)博等[33]發(fā)現(xiàn)MOSPD3抗體、SPAG8抗體均可以運用于免疫磁珠技術(shù)特異性分離精陰混合斑中的精子細胞。此外，在一些輪奸案件中，常會混合多名男性的精子細胞。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)不同血型男性的精子細胞表面會有不同的ABO特異性抗原，據(jù)此選擇與之相對應(yīng)的特異性抗原，采用免疫磁珠法分離精子細胞的同時，可對不同男性的精子細胞進行分離。2016年，Xu等[34]通過將免疫磁珠法和流式細胞術(shù)相結(jié)合，成功地將兩名不同ABO血型的嫌疑人的精子細胞DNA分離。該類抗原的發(fā)現(xiàn)，為日后從精陰混合斑鑒定出兩名及以上男性精子DNA提供了借鑒。目前，發(fā)現(xiàn)的精子特異性抗原已達100多種，制備免疫磁珠的方法也有多種，這些將有利于該技術(shù)的方法學(xué)研究和優(yōu)化[33]。

免疫磁珠技術(shù)的優(yōu)點在于操作簡單，分離快速，使用安全，所需實驗器材和儀器價格相對便宜，可在基層鑒定機構(gòu)和公安局普及。對于多人實施的性犯罪，該技術(shù)可利用不同ABO血型的男性精子細胞表面特異性抗原的差異，查明精陰混合斑中不同血型的男性成分來源。此外，該方法基本不會對精子細胞本身造成破壞，并可同時進行精子細胞的分離、純化與富集，具有自動化檢驗的發(fā)展前景。其缺點在于需要對特異性抗體進行篩選，且對于某些案件，若檢材較為陳舊、精子細胞表面抗原降解，則很難實現(xiàn)免疫磁珠與精子細胞的結(jié)合，此時就需要結(jié)合實際情況，借助或運用其他技術(shù)完成精子細胞的分離。

1.6 流式細胞術(shù)

流式細胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）或稱熒光激活細胞分類術(shù)（fluorescence-activated cell sorter，F(xiàn)ACS），是一種以流式細胞儀為核心，可對快速直線流動狀態(tài)中的單列細胞或生物顆粒進行逐個、多參數(shù)、快速定性、定量分析或分選的技術(shù)。

該技術(shù)經(jīng)對精陰細胞混合液中的精子細胞進行免疫熒光標記，制成單細胞懸液，通過流動室液流系統(tǒng)、光源與光學(xué)系統(tǒng)、信號收集與轉(zhuǎn)換系統(tǒng)可分別對精子細胞實現(xiàn)樣品聚集、產(chǎn)生光信號并轉(zhuǎn)為電信號。電信號再通過計算機與分析系統(tǒng)就能逐個、多參數(shù)、快速地對細胞進行定性、定量分析。而后細胞經(jīng)過分選區(qū)，利用細胞膜表面不同的電荷量，通過分選系統(tǒng)施加的高壓電場，就可完成對細胞的分離[35]。

Schoell等[36]通過主要組織相容性復(fù)合體I類分子（MHC I）、細胞角蛋白和CD45分子在精陰細胞表面的差異性表達等特點，采用流式細胞熒光分選技術(shù)經(jīng)逆向篩選實現(xiàn)了精陰細胞分離[37]。但對陳舊、干燥、降解嚴重的檢材，該方法會因為細胞膜表面蛋白的缺失而失效。因此有研究者指出，可將物證提取方法由陰道拭子改為陰道灌洗，以減少轉(zhuǎn)移過程中對精子細胞的損傷，提高分離成功率。

FCM可通過計算機自動實現(xiàn)對精子細胞多參數(shù)的快速定性、定量分析和分選。但是對于精子細胞含量極低的檢材以及精子細胞難以辨認的陳舊性檢材，其與LCM有相同的局限性；再者其也要求檢驗者應(yīng)具有較高的經(jīng)驗與技術(shù)水平。此外，流式細胞儀費用較高，難以在基層推廣。

上述6種精陰混合斑細胞的分離技術(shù)與方法各自的技術(shù)特點和使用條件概括于表1。

表1 本文所述精陰混合斑細胞分離方法比較Table 1 Comparison among methods to separate sperm cells from mixed stains of seminal and vaginal fluid

2 精陰混合斑DNA分型分析方法

精子細胞和陰道上皮細胞含有大量DNA，研究者從精子細胞和陰道上皮細胞提取DNA，可以通過不同的遺傳標記，獲得DNA的多態(tài)性信息，從而分析細胞來源，達到個人識別的目的。

2.1 單一精子來源的DNA分析

在對精陰混合斑進行細胞分離后，能夠得到單一來源的精子細胞。在提取其DNA后，利用DNA多態(tài)性分型技術(shù)（目前多采用PCR-STR分型技術(shù)[4]），通過檢測其DNA多態(tài)性，可以實現(xiàn)對該精子細胞的個體識別。由于精子細胞為單倍型，僅分析一個精子細胞無法獲得個人的完整基因型，故一般需要捕獲7個以上細胞才能獲得個體的完整分型（＞99%），而每個捕獲樣本還需至少平行檢驗兩次以上，以保證每個精子細胞均能獲得準確的分型。

此外，由于Y染色體為男性特有，Y-STR呈男性伴性遺傳，除突變外，父系所有親屬都具有相同的Y-STR單倍型，因此可以利用父系親屬的參考樣本對犯罪嫌疑人進行排除或追蹤。然而，其用于個人識別僅具有排除意義，不能認定同一。

2.2 精液特異DNA甲基化位點

基因組中特定區(qū)域的甲基化特征具有細胞或組織特異性，精斑中的DNA也有其自身特異的甲基化特征。依據(jù)DNA甲基化位點構(gòu)建精液特異性SNP分型復(fù)合體系可以特異性地獲得精子SNP位點的分型，對于精液的鑒定具有重要價值。但該體系距離實用尚需時日，有關(guān)問題如通過管家基因的分型結(jié)果來判斷陰性結(jié)果的樣本中是否含有生物檢材，進行種屬確證實驗驗證是否具有人種屬的特異性，以及分析更多體液相關(guān)的甲基化位點數(shù)據(jù)，補充更多的精液特異性位點使分型更加準確等[38]，仍需要做大量的工作。

2.3 女性DNA來源的分析

大多數(shù)情況下，對強奸案件相關(guān)物證檢驗時，精陰混合斑中女性物質(zhì)DNA的檢測及其數(shù)據(jù)庫檢索往往被忽視[39]。然而在一些情況下，“被害人”會出于某種目的而提供假證。因此在強奸案件中，女性物質(zhì)的認定也是有關(guān)物證可作為證據(jù)的前提條件，只有確認了其與被害人相關(guān)，檢出的精斑才有意義，并且對案件定性還會起到至關(guān)重要的作用。

法醫(yī)實踐中，常從差異裂解法第一次消化后離心的上清液中提取混合斑女性DNA成分，并對常染色體進行STR多態(tài)性分析以實現(xiàn)對女性成分的個人識別。

2.4 混合DNA的分型分析

雖然隨著技術(shù)革新，前文所述各種精陰混合斑分離方法一直在不斷改善，精子細胞的分離率也在不斷提高，但是大多數(shù)情況下，檢材中男女比例懸殊，加之部分精陰混合斑附著載體具有較強的粘附性，最后還是無法得到單一來源的DNA。男性和女性個體在不同遺傳標記系統(tǒng)中存在差異，可根據(jù)DNA混合圖譜中的峰高和峰面積來推測男性個體的數(shù)目及在混合斑中的比例，因此，可以通過檢測這些遺傳標記來達到區(qū)分判斷精陰混合DNA分型的目的。該方法是通過使用男女不同的遺傳標記、分型方法以及分析方法，對精陰混合斑的DNA混合物進行分析，以確定其來源及個體數(shù)，為案情提供信息。目前使用到的遺傳標記有短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）、單核苷酸多態(tài)性（SNP）、微單倍型（MH）等。

2.4.1 短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）

在法醫(yī)DNA分析中，多應(yīng)用常染色體STR和Y染色體STR進行DNA分析，其中Y-STR在性犯罪案件中應(yīng)用已非常成熟，近年來新的Y-STR不斷出現(xiàn)，使得其數(shù)量愈加龐大，且在不同人種差異鑒別上也顯現(xiàn)出獨特優(yōu)勢[40]。當(dāng)前，常用染色體STR標記在法醫(yī)DNA分析中應(yīng)用最為廣泛的是復(fù)合擴增法和毛細管電泳法（CE）。近年來，二代測序技術(shù)也有應(yīng)用，而且較傳統(tǒng)的毛細管電泳STR分型技術(shù)，該技術(shù)既能檢測STR基因座的長度多態(tài)性信息，又能分析各基因座序列多態(tài)性信息，通過分析核心序列和側(cè)翼序列的堿基序列差異，可對等位基因進行精準分型，故在法醫(yī)物證領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用[41]。當(dāng)前，STR-CE分型的個體識別框架已建立較完備，STR也是當(dāng)今法醫(yī)DNA分析的主流。在刑事偵查中，法醫(yī)可將犯罪現(xiàn)場獲得的STR與數(shù)據(jù)庫中的進行比對，如有匹配，就將利于調(diào)查進一步進行[40]。

STR標記仍有一定的局限性，其雖然可以很好地分析兩個人的DNA混合物，但是不適合于復(fù)雜的混合物分析，且混合物中目標DNA至少要占DNA總量的5%～10%時才能做出分析，否則就會出現(xiàn)隨機擴增效應(yīng)、隨機抽樣變異等導(dǎo)致片段丟失。此外，STR標記也不能很好地適用于降解DNA的分析。

近年來，有不少研究者在對STR標記方法進行改良：

1）將其他類型的遺傳標記與STR相結(jié)合，如SNP-STR、DIP-STR等，以求極大程度地在不平衡混合DNA中靶向檢測出次要成分DNA，例如在2018年，Tan等[42]使用11種新的SNP-STR標記，通過ARMS進行基因分型，實現(xiàn)了次要貢獻者的DNA在1∶100的混合樣本中得到成功分型。

2）DNA混合物的定量分析解釋，可以分析2人以上、5人以下的DNA混合物，當(dāng)前主要有半連續(xù)（定性）模型和全連續(xù)（定量）模型兩種方法，其中，半連續(xù)模型僅能利用定性信息，而連續(xù)模型能夠充分利用包括定性信息的分型結(jié)果。2011年，第一個連續(xù)軟件TrueAlleleò獲得驗證，并隨后在英國和美國的法院得到應(yīng)用，其他如STRmix?的連續(xù)軟件，也有驗證和應(yīng)用[40]。2016年，第一個開源連續(xù)模型軟件EuroForMix發(fā)布。然而通過實驗研究與實踐應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，全連續(xù)模型不能解決復(fù)雜混合物中存在的少量DNA問題，且與半連續(xù)模型相比，連續(xù)模型的算法和計算相當(dāng)復(fù)雜，在法庭上更難討論，不同連續(xù)軟件的LR一致性要低于半連續(xù)軟件。

在我國，前期研究主要集中在前期投入少而經(jīng)驗要求相對較高的人工分析領(lǐng)域，相比于較早開始DNA檢驗的國外，國內(nèi)從理論模型研究到系統(tǒng)平臺搭建都還不成熟，在自動化和智能算法方面國外仍有很多可借鑒之處[43]。在不久的將來，隨著人工智能技術(shù)的不斷發(fā)展，STR分型技術(shù)將會趨向自動化，可有效擴大應(yīng)用范圍并降低使用門檻，會有助于從根本上解決混合斑STR分型分析應(yīng)用的難題。

2.4.2 單核苷酸多態(tài)性（SNP）

當(dāng)前SNP標記已運用于法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，雖然較STR而言，SNP的多態(tài)性低，無法獲得與STR相同的信息量，這也是SNP的主要限制，但是其更適合于短擴增片段的降解DNA或災(zāi)難受害者識別，且其突變率較低。此外，SNP標記較STR有更多的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。

近年來，一些科學(xué)家提出了一種利用數(shù)千個雙SNP來分析復(fù)雜混合物的策略，而不是追求每個SNP的高雜合子。2011年，Voskoboinik和Darvasi[44]應(yīng)用一種隨機人不排隊（random man not excluded,RMNE）的方法，基于數(shù)千個雙SNP分析復(fù)雜混合物的策略，提出了p（RMNE）的算法：

式中：S是排除位點或錯配位點的數(shù)目，p（Ai）是位點i的主等位基因頻率。p（RMNE）越小，被懷疑是混合物貢獻者的機會越小。一般來說，p（RMNE）＜10-9。

有學(xué)者提出，可以通過增加SNP的位點數(shù)量來提高DNA混合物的鑒別力，但是此舉會暴露個體過多的DNA信息，造成侵犯隱私。但無論如何，其在降解DNA分析方面的優(yōu)勢是無可爭議的，隨著檢測與測序技術(shù)的成熟，其有潛力服務(wù)于各種法醫(yī)學(xué)目的[40]。

2.4.3 微單倍型（MH）

MH作為一種新引入的遺傳標記，已成為法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。其最早由Kidd等[45]于2013年提出，為在小于300 bp的DNA區(qū)段內(nèi)、包含2個SNP的多態(tài)性位點。在300 bp DNA片段長度范圍內(nèi)，微單倍型內(nèi)部SNP間的重組率幾乎為0。一個微單倍型位點可視作一個獨立基因庫，其多態(tài)性由SNP的特定組合所構(gòu)成[46]。

MH標記的特點在于其突變率低，長度短，更適合于降解DNA的分析，在突破STR標記局限性的同時，又承載有SNP標記的所有優(yōu)點，且能較大程度地發(fā)揮測序技術(shù)在法醫(yī)學(xué)分析中的優(yōu)勢。此外，MH標記通過定義幾個鏈接SNP作為一個單一的位點，可以減少無用信息DNA片段的測序，避免侵犯隱私。然而，由于作為一種新引入的遺傳標記，MH標記的群體遺傳數(shù)據(jù)相對缺乏，檢測成本也相對較高，另外，位點篩選條件也還有待提高。但值得肯定的是，MH標記將會是一個非常有前途和通用性的工具，在未來，將會被更廣泛地運用于精陰混合斑分析以及其他法醫(yī)學(xué)應(yīng)用。

3 總結(jié)與展望

國內(nèi)外研究者針對已開發(fā)的各項技術(shù)，結(jié)合精子細胞及其DNA的多種特異性，建立了許多精陰混合斑分離檢驗技術(shù)，并一直在不斷改良。但所有技術(shù)與方法主要還是通過細胞水平的分離以及DNA水平的分型分析實現(xiàn)對精陰混合斑的分離檢驗。

在細胞水平，差異裂解法作為一種傳統(tǒng)的精陰混合斑分離技術(shù)，現(xiàn)仍被廣泛應(yīng)用，且研究者也在不斷地對其進行改進，如本文提到的國內(nèi)學(xué)者研發(fā)并應(yīng)用的尼龍膜套管法，國外學(xué)者利用機器人技術(shù)所做出的革新，前者能大大提高差異裂解法的分離效率，后者則可實現(xiàn)自動化。另外，其他新技術(shù)也不斷被關(guān)注和應(yīng)用，如微流控芯片技術(shù)和免疫磁珠技術(shù)準確率高，操作相對簡單，均有較好的發(fā)展前景，免疫磁珠法更是可在基層鑒定機構(gòu)和公安機關(guān)逐漸普及。在DNA水平，從精陰混合斑中分離出精陰細胞并分別提取DNA，獲得DNA多態(tài)性分型，就可判斷混合斑中各成分的來源。同時，由于精液中的特有成分，如精子特異的DNA甲基化位點，法醫(yī)研究人員可通過直接檢測這些位點判斷精液的來源。然而，由于現(xiàn)今精陰混合斑的分離方法難以實現(xiàn)對精子細胞的精準完全捕獲，故很多時候就無法獲得單一來源的DNA，此時或可通過不同的遺傳標記，對精陰混合斑的DNA混合物進行分析，以確定其來源。當(dāng)前，STR標記檢驗鑒定仍是法醫(yī)DNA分析主要且必用的方法，許多國家都建立了STR國家DNA數(shù)據(jù)庫。此外，依據(jù)檢材條件并結(jié)合案情，其他遺傳標記亦或可調(diào)用或幫助分析，其中，MH標記法可較大程度發(fā)揮測序技術(shù)在法醫(yī)學(xué)分析中的優(yōu)勢，有很好的前途和較高的通用性。

誠然，現(xiàn)在仍缺乏一種簡單、快速、高效、安全并能廣泛普及適用的精陰混合斑分離檢驗技術(shù)。相信隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，未來會有更多新興技術(shù)應(yīng)用于精陰混合斑處理，精陰混合斑分離檢驗技術(shù)會更多、更具實用性，性犯罪案件中精陰混合斑的分離檢驗將不再是一個難題。