光動(dòng)力療法聯(lián)合拉帕替尼抑制人表皮生長(zhǎng)因子受體-2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的基礎(chǔ)研究

孫蓓，張麗，劉曉東，佟仲生

人表皮生長(zhǎng)因子受體-2（HER2）陽(yáng)性表達(dá)的乳腺癌患者常治療失敗率及復(fù)發(fā)率高，預(yù)后較差。拉帕替尼（LAP）屬于一類常見的表皮生長(zhǎng)因子酪氨酸激酶抑制劑，其目前在抗腫瘤領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，且在實(shí)際應(yīng)用中表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性作用［1-3］。光動(dòng)力療法（PDT）對(duì)增生性疾病有很好的治療效果，其在抗腫瘤治療中表現(xiàn)出高效、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，其與化療、靶向治療等聯(lián)合進(jìn)行抗腫瘤治療已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)，但是大部分研究主要集中在胸腹腔腫瘤，而其在乳腺癌中的研究報(bào)道較少，并且其抗腫瘤的機(jī)制尚不清楚［4-6］。5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）是血紅素合成過程中糞卟啉Ⅲ原卟啉IX（PpIX）的前體。氨基乙酰丙酸（ALA）-PDT實(shí)現(xiàn)了由外源光敏劑的直接輸入到ALA在組織內(nèi)內(nèi)源性生成原卟啉光敏劑經(jīng)光照射啟動(dòng)PDT的突破。本研究探討新型光敏劑5-ALA用于PDT對(duì)HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系SKBR3的抑制情況，并分析其具體機(jī)制，同時(shí)討論P(yáng)DT聯(lián)合LAP對(duì)HER2陽(yáng)性乳腺癌的治療效果，以期為HER2陽(yáng)性乳腺癌的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究時(shí)間 本研究時(shí)間為2016年5月—2017年12月。

1.2 主要儀器及試劑 半導(dǎo)體激光光動(dòng)力治療儀（天津市雷意激光技術(shù)有限公司），5-ALA、MTT、Rhodamine 123（美國(guó)Sigma公司），LAP（英國(guó)葛蘭素史克公司，批號(hào)：H201006493），胎牛血清、胰蛋白酶、細(xì)胞培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)試劑盒及抗體（美國(guó)BD公司）。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系SKBR3隨機(jī)分為空白對(duì)照組、LAP組、PDT組、LAP+PDT組。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。空白對(duì)照組：不做干預(yù)。LAP組：分別加入不同濃度梯度（0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μmol/L）的 LAP，孵育24 h；PDT組：分別加入不同濃度梯度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mmol/L）的5-ALA，孵育3 h給予激光照射；LAP+PDT組：分別加入不同濃度梯度（0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μmol/L）的LAP，孵育21 h，再加入不同濃度梯度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mmol/L）的5-ALA，孵育3 h給予激光照射。PDT組及LAP+PDT組光照能量密度為2.5 J/cm2，PDT治療完畢后更換完全培養(yǎng)基，其他條件不變情況下繼續(xù)培養(yǎng)16 h。通過光度計(jì)檢測(cè)各組562 nm處的吸光度值，即細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，繪制各組不同給藥濃度下的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率曲線。分別計(jì)算LAP和5-ALA的半數(shù)抑制濃度（IC50），確定最佳給藥濃度及后續(xù)研究LAP組、PDT組、LAP+PDT組給藥濃度。分別比較各組在最佳給藥濃度下24、48 h時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系SKBR3隨機(jī)分為空白對(duì)照組、LAP組、PDT組、LAP+PDT組。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔?？瞻讓?duì)照組：不做干預(yù)。LAP組：加入1.00 μmol/L的LAP，孵育24 h；PDT組：加入1.00 mmol/L的5-ALA，孵育3 h給予激光照射；LAP+PDT組：加入1.00μmol/L的LAP，孵育21 h，再加1.00 mmol/L的5-ALA，孵育3 h給予激光照射。PDT組及LAP+PDT組光照能量密度為2.5 J/cm2，PDT治療完畢后更換完全培養(yǎng)基，其他條件不變情況下繼續(xù)培養(yǎng)16 h。消化之后收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min（離心半徑6 cm），棄去上清液，磷酸鹽緩沖液（PBS）充分沖洗細(xì)胞2遍；加入Annexin V-FITC 5 μl、PI 5 μl，避光孵育 15 min，加入緩沖液400 μl，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。

1.5 Rhodamine123法檢測(cè)綠色熒光強(qiáng)度及線粒體膜電位 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系SKBR3隨機(jī)分為空白對(duì)照組、LAP組、PDT組、LAP+PDT組。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞處理情況同1.4。加入線粒體探針Rhodamine123，終濃度為10 μg/ml，避光孵育30 min，棄培養(yǎng)基，加磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3遍。胰酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min（離心半徑6 cm），棄去上清液，PBS清洗細(xì)胞2次，倒置熒光顯微鏡下觀察各組綠色熒光強(qiáng)度，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組線粒體膜電位。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，取平均值。

1.6 Western blotting法檢測(cè)HER2表達(dá)水平 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系SKBR3隨機(jī)分為空白對(duì)照組、LAP組、PDT組、LAP+PDT組。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞處理情況同1.4。各組取5×106個(gè)細(xì)胞，加入500 μl預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，置于冰浴中作用60 min，4 ℃ 1 200 r/m離心10 min（離心半徑6 cm），吸出上清液，加入等體積的2×Loading buffer，沸水浴10 min，配置分離膠、積層膠，取電泳樣品上樣，每道20 μl，電泳，轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉處理2 h，加入一抗，4 ℃孵育12 h，洗膜，加入1∶20 000辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，震蕩孵育2 h，洗膜，加入化學(xué)發(fā)光底物（Luminol/Enhancer Solution和Stable Peroxide Solution按1∶1比例混合均勻），暗室孵育5 min。棄去發(fā)光底物，X線曝光顯影。計(jì)算HER2表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，取平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；采用金正均q值法［7］判斷聯(lián)合治療的協(xié)同作用，Q=實(shí)際聯(lián)合藥效R'（A+B）/理論聯(lián)合藥效R（A+B），R（A+B）=RA+RB-RA×RB，RA、RB為單獨(dú)用藥藥效，Q＜0.85為拮抗，0.85≤Q＜1.15為相加，Q≥1.15為協(xié)同。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 LAP的IC50為1.65 μmol/L，選取1.00 μmol/L（LAP組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為40.12%）為后續(xù)研究LAP組、LAP+PDT組給藥濃度（見圖1）。5-ALA的IC50為1.57 mmol/L，選取1.00 mmol/L（PDT組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為41.23%）為后續(xù)研究PDT組、LAP+PDT組給藥濃度（見圖2）。當(dāng)LAP為1.00 mmol/L，5-ALA為1.00 μmol/L時(shí)，LAP+PDT組細(xì)胞生長(zhǎng)抑瘤率為79.71%。聯(lián)合治療Q≈1.23，表明LAP與5-ALA聯(lián)合治療表現(xiàn)出良好的協(xié)同效果。

4組24、48 h細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；LAP組、PDT組、LAP+PDT組24、48 h細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率均大于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PDT組48 h細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率大于LAP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；LAP+PDT組24、48 h細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率均大于LAP組、PDT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

圖1 LAP組與LAP+PDT組不同給藥濃度下的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率曲線（LAP+PDT組5-ALA為1.00 mmol/L）Figure 1 Cell growth inhibition rate curves at different concentrations in LAP group and LAP+PDT group（5-ALA used in LAP+PDT group was 1.00 mmol/L）

圖2 PDT組與LAP+PDT組不同給藥濃度下的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率曲線（LAP+PDT組LAP為1.00 μmol/L）Figure 2 Cell growth inhibition rate curves at different concentrations in PDT group and LAP+PDT group（LAP used in LAP+PDT group was 1.00μmol/L）

表1 4組24、48 h細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較（±s，%，n=3）Table 1 Comparison of growth inhibition rates at 24，48 hours after intervention with the optima concentration in four groups

表1 4組24、48 h細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較（±s，%，n=3）Table 1 Comparison of growth inhibition rates at 24，48 hours after intervention with the optima concentration in four groups

注：LAP=拉帕替尼，PDT=光動(dòng)力療法；與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與LAP組比較，bP＜0.05；與PDT組比較，cP＜0.05

組別 24 h 48 h空白對(duì)照組 4.70±0.70 7.70±0.70 LAP 組 26.12±2.09a 45.12±3.42a PDT 組 32.46±4.12a 62.46±6.73ab LAP+PDT組 70.02±7.75abc 83.27±13.74abc F值 144.340 66.622 P值 ＜0.001 ＜0.001

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況Figure 3 Apoptosis in each group detected by flow cytometry

2.2 細(xì)胞凋亡情況 空白對(duì)照組主要為活細(xì)胞；與空白對(duì)照組相比，LAP組、PDT組的細(xì)胞主要表現(xiàn)為凋亡，LAP+PDT組則出現(xiàn)了明顯的凋亡和壞死，早期凋亡占比很低（見圖3）。

2.3 綠色熒光強(qiáng)度及線粒體膜電位 綠色熒光強(qiáng)度：對(duì)照組細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞為綠色熒光，胞漿著色深；LAP組、PDT組熒光強(qiáng)度有所降低；LAP+PDT組的熒光強(qiáng)度降低最明顯，提示活細(xì)胞減少（見圖4）。線粒體膜電位：4組線粒體膜電位比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；LAP組、PDT組、LAP+PDT組線粒體膜電位低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PDT組、LAP+PDT組線粒體膜電位低于LAP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；LAP+PDT組線粒體膜電位低于PDT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，見圖5、表2）。

2.4 HER2表達(dá)水平 4組HER2表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；LAP組、PDT組、LAP+PDT組HER2表達(dá)水平均低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義（P＜0.05）；PDT組、LAP+PDT組 HER2表達(dá)水平均低于LAP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；LAP+PDT組HER2表達(dá)水平均低于PDT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見圖6、表3）。

3 討論

圖4 各組綠色熒光強(qiáng)度（×200）Figure 4 Fluorescence intensity of green fluorescent protein in each group

表2 4組線粒體膜電位比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of mitochondrial membrane potential in four groups

表2 4組線粒體膜電位比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of mitochondrial membrane potential in four groups

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與LAP組比較，bP＜0.05；與PDT組比較，cP＜0.05

組別 線粒體膜電位空白對(duì)照組 66.56±7.79 LAP組 49.16±9.38a PDT組 34.96±7.32ab LAP+PDT組 22.52±6.96abc F值 22.894 P值 ＜0.001

圖5 Rhodamine123法檢測(cè)各組線粒體膜電位Figure 5 Mitochondrial membrane potential in each group detected by Rhodamine123

圖6 Western blotting法檢測(cè)各組HER2表達(dá)水平的凝膠電泳圖Figure 6 Expression level of HER2 in each group by gel electrophoresis with Western blotting

表3 4組HER2表達(dá)水平比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of expression level of HER2 in four groups

表3 4組HER2表達(dá)水平比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of expression level of HER2 in four groups

注：HER2=人表皮生長(zhǎng)因子受體-2；與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與LAP組比較，bP＜0.05；與PDT組比較，cP＜0.05

組別 HER2空白對(duì)照組 1.65±0.30 LAP組 1.24±0.11a PDT組 0.88±0.15ab LAP+PDT組 0.27±0.06abc F值 41.717 P值 ＜0.001

在乳腺癌患者中，HER2高表達(dá)是預(yù)后不良的重要因素，治療的失敗率及復(fù)發(fā)率高，生存時(shí)間短［8］。而在相關(guān)新技術(shù)的不斷應(yīng)用下，乳腺癌的治療效果不斷提高，且患者的預(yù)后也改善，不過有一部分患者在治療過程中出現(xiàn)了一定的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致治療效果較差，其中約10%的胸壁復(fù)發(fā)［9］。嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)皮膚潰爛、流血、化膿感染，極大影響患者的生活質(zhì)量及預(yù)后。PDT對(duì)增生性疾病有很好的治療效果，其在抗腫瘤治療中表現(xiàn)出高效、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，光動(dòng)力治療儀通過調(diào)節(jié)波長(zhǎng)可以使光波穿透至皮下1～2 cm，其可以很好地治療乳腺癌胸壁復(fù)發(fā)的表淺病灶，且治療后的復(fù)發(fā)率低［10］。顧瑛等［11］研究發(fā)現(xiàn)，活性氧成分在血卟啉單甲醚誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡方面有很好的效果，且其可以生成單態(tài)氧而促使乳腺癌細(xì)胞壞死，同時(shí)還誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡［12］。單態(tài)氧在PDT治療過程中可以通過光敏性損傷起作用，可以破壞細(xì)胞脂質(zhì)膜，進(jìn)而影響細(xì)胞的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹壞死，同時(shí)還影響細(xì)胞內(nèi)多種酶活性。然而目前PDT與靶向治療聯(lián)用的協(xié)同效應(yīng)還不是很明確。LAP屬于一類很常用的酪氨酸激酶抑制劑，其目前在抗腫瘤靶向治療領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，且表現(xiàn)出多方面的抗腫瘤活性［13-14］。本研究探討新型光敏劑5-ALA用于PDT對(duì)HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系SKBR3的抑制情況，并分析其具體機(jī)制，同時(shí)討論P(yáng)DT聯(lián)合LAP對(duì)HER2陽(yáng)性乳腺癌的治療效果，以期為患者的治療提供支持和依據(jù)。

KHDAIR等［15］發(fā)現(xiàn)，PDT聯(lián)合阿霉素能夠明顯抑制耐藥的腫瘤細(xì)胞增殖。CANTI等［16］將化療與PDT治療相結(jié)合，構(gòu)建小鼠荷瘤模型，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合PDT治療可使低劑量化療藥物抑瘤作用明顯增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)LAP為1.00 mmol/L，5-ALA為1.00 μmol/L時(shí)，LAP+PDT組細(xì)胞生長(zhǎng)抑瘤率為79.71%；聯(lián)合治療Q≈1.23；表明LAP與5-ALA聯(lián)合治療表現(xiàn)出良好的協(xié)同效果。與空白對(duì)照組相比，LAP組、PDT組的細(xì)胞主要表現(xiàn)為凋亡，LAP+PDT組則出現(xiàn)了明顯的凋亡和壞死，早期凋亡占比很低，這可能與二者聯(lián)用引起細(xì)胞膜、線粒體及細(xì)胞器等損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡有關(guān)。LAP組、PDT組、LAP+PDT組24、48 h細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率均大于空白對(duì)照組，PDT組48 h細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率大于LAP組，LAP+PDT組24、48 h細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率均大于LAP組、PDT組，提示PDT聯(lián)合LAP對(duì)HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系SKBR3可起到更好的抑制效果。

光敏劑在PDT治療中的作用方式和其定位存在一定的相關(guān)性，而其定位于線粒體的比例較高。如苯卟啉衍生物單元酸A及亞甲藍(lán)等在治療過程中可以導(dǎo)致凋亡相關(guān)因子（Bcl-2家族、p53基因家族）的變化，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞的凋亡和壞死［17-18］。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，LAP組、PDT組熒光強(qiáng)度有所降低，LAP+PDT組的熒光強(qiáng)度降低最明顯；LAP組、PDT組、LAP+PDT組線粒體膜電位低于空白對(duì)照組，PDT組、LAP+PDT組線粒體膜電位低于LAP組，LAP+PDT組線粒體膜電位低于PDT組；據(jù)此可判斷出PDT治療相關(guān)的腫瘤細(xì)胞凋亡作用與線粒體膜滲透性移位存在密切的關(guān)系，且PDT聯(lián)合LAP治療的效果更好。

LAP屬于一類常見的小分子靶向藥物，對(duì)HER2陽(yáng)性乳腺癌患者的治療效果明顯，其主要以HER2基因?yàn)樽饔冒悬c(diǎn)，然而PDT聯(lián)合LAP治療HER2陽(yáng)性乳腺癌的效果不是很確定。本研究結(jié)果顯示，LAP組、PDT組、LAP+PDT組HER2表達(dá)水平均低于空白對(duì)照組，PDT組、LAP+PDT組HER2表達(dá)水平均低于LAP組，LAP+PDT組HER2表達(dá)水平均低于PDT組，說明PDT聯(lián)合LAP能協(xié)同增強(qiáng)抗HER2治療的效果。

綜上所述，新型光敏劑5-ALA用于PDT對(duì)HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系SKBR3具有明顯的抑制作用，且PDT聯(lián)合LAP的抑制作用更強(qiáng)，其機(jī)制與降低腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位、HER2表達(dá)水平有一定關(guān)系。因此，PDT聯(lián)合LAP有望改善HER2陽(yáng)性乳腺癌患者生活質(zhì)量，提高其生存率，具有良好的應(yīng)用前景。

本研究局限性：

光動(dòng)力療法（PDT）聯(lián)合拉帕替尼（LAP）是通過何種具體機(jī)制起到協(xié)同增效作用尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；由于PDT較難達(dá)到2 cm以下深層病灶，因此程度較深的胸壁復(fù)發(fā)治療尚待進(jìn)一步探索。

作者貢獻(xiàn)：孫蓓進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)、結(jié)果的分析與解釋，撰寫論文；張麗進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理、論文的中英文修訂；劉曉東進(jìn)行數(shù)據(jù)收集與整理；佟仲生進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。