上海地區(qū)人群丙型肝炎病毒1b型進(jìn)化樹及其影響因素分析

丙型肝炎病毒(HCV)屬于黃病毒科黃病毒屬，為單正鏈RNA病毒[1]。HCV基因組全長(zhǎng)9.6 kb，包含有5′ 非編碼區(qū)(5′UTR)、3′UTR及一個(gè)編碼約3 000個(gè)氨基酸的單一開放讀碼框(ORF)。HCV在宿主體內(nèi)復(fù)制，每日能產(chǎn)生1 012個(gè)病毒[2]。由于HCV 非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)5B RdRp缺乏校錯(cuò)功能，HCV每復(fù)制一代可產(chǎn)生104～105個(gè)堿基突變[3-4]。因此，HCV在宿主體內(nèi)以“準(zhǔn)種”形式存在。準(zhǔn)種內(nèi)的病毒，其保守區(qū)同源性在91%～99%，變異部分主要為高變區(qū)-1(HVR-1)、HVR-2。目前HCV基因型可分為HCV1～7型，基因型之間的序列差異約為30%。每個(gè)基因型又可分為不同的基因亞型，基因亞型間的序列差異為15%～20%[5]。研究顯示中國(guó)人群中HCV基因型主要為HCV 1b型(66%)，其次為2a型(14%)；但中國(guó)不同地區(qū)的HCV基因型分布存在差異，珠江三角洲地區(qū)HCV 6a型為第2大基因型[6]。目前中國(guó)HCV序列演變的規(guī)律及特征尚未明確，本研究通過(guò)擴(kuò)增HCV 1b型NS3區(qū)序列，分析HCV 1b型序列變異情況、序列進(jìn)化以及演變的規(guī)律，并進(jìn)行人類白細(xì)胞抗原-A(HLA-A)及HLA-B類分子基因分型檢測(cè)，分析上海地區(qū)人群的HLA-Ⅰ類分子遺傳背景，明確上海地區(qū)人群的HLA-Ⅰ類分子對(duì)于HCV 1b型序列進(jìn)化的影響。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2010年7月至2015年4月期間上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化科及感染科診治的89例慢性丙型肝炎患者，患者均為漢族，均對(duì)本研究知情同意。慢性丙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2014年歐洲肝臟病協(xié)會(huì)(EASL)HCV感染診治指南[7]，選擇HCV抗體陽(yáng)性，HCV RNA陽(yáng)性(HCV RNA定量檢測(cè)結(jié)果在1.23 E+03～6.61 E+07 copies/mL)患者，排除近6個(gè)月內(nèi)感染的患者。使用EDTA抗凝管采取全血標(biāo)本。所有標(biāo)本均排除人類免疫缺陷病毒(HIV)或乙型肝炎病毒(HBV)合并感染。

1.2 HCV RNA抽提及NS3區(qū)擴(kuò)增

分離血清，抽提血清中HCV RNA(Qiagen病毒RNA抽提試劑盒)，采用型別特異性引物擴(kuò)增法對(duì)HCV RNA進(jìn)行基因分型。采用巢式PCR對(duì)HCV 1b基因型的HCV NS3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系及循環(huán)參數(shù)按照 TaKaRaTaq 聚合酶說(shuō)明書。取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，于紫外光下成像，觀察結(jié)果。將NS3區(qū)擴(kuò)增陽(yáng)性條帶產(chǎn)物送至上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.3 HCV序列分析

測(cè)序結(jié)果使用 CodonCode Aligner 軟件，參考序列峰圖進(jìn)行拼接后得到核苷酸序列。使用Align軟件進(jìn)行同源性分析。使用Ge-neious 7.0軟件進(jìn)行核苷酸及氨基酸序列分析。使用TreeMaker和FigTree軟件，基因距離使用GTR方法，分析HCV NS3區(qū)的序列變異情況，并進(jìn)行進(jìn)化樹分析。

1.4 HLA-A和HLA-B類分子測(cè)定

分離血細(xì)胞，進(jìn)行基因組DNA抽提，采用型別特異性引物PCR法檢測(cè)HCV 1b型患者相應(yīng)的HLA-A及HLA-B類分子等位基因。分析人群HLA-A及HLA-B類分子基因頻率，并與數(shù)據(jù)庫(kù)中國(guó)人群HLA-A及HLA-B類分子基因頻率比較。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組間HLA-A和HLA-B類分子頻率比較采用卡方檢驗(yàn)，HLA-Ⅰ類分子陽(yáng)性及陰性患者中序列突變頻率比較采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCV 1b型NS3區(qū)擴(kuò)增

將PCR陽(yáng)性結(jié)果送測(cè)序后，應(yīng)用CodonCode Aligner軟件，根據(jù)測(cè)序峰圖進(jìn)行序列拼接，最終得到89例HCV 1b型NS3區(qū)的全長(zhǎng)核苷酸及氨基酸序列，序列經(jīng)進(jìn)化樹分析后最終證實(shí)為1b型。

2.2 上海地區(qū)人群的HLA-A及HLA-B類分子基因分布情況

表1 HLA-A分子基因頻率

表2 HLA-B分子基因頻率

2.3 中國(guó)不同地區(qū)人群中HLA-A和HLA-B類分子基因頻率比較

圖1中國(guó)不同地區(qū)人群中HLA-A和HLA-B類分子基因頻率比較AHLA-A類分子基因頻率BHLA-B類分子基因頻率

2.4 上海地區(qū)人群中HCV 1b型序列演變分析

將本研究擴(kuò)增獲得的89例HCV 1b型NS3區(qū)進(jìn)行進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示89例序列主要落于兩個(gè)進(jìn)化叢內(nèi)，見圖2。

圖2 上海地區(qū)人群中HCV 1b型序列進(jìn)化樹分析

2.5 HCV NS3區(qū)序列進(jìn)化叢形成的影響因素

表3 不同進(jìn)化叢中HLA-A及HLA-B類分子基因頻率比較

2.6 不同進(jìn)化叢的一致序列比對(duì)結(jié)果

將進(jìn)化叢1以及進(jìn)化叢2序列分別進(jìn)行序列比對(duì)，得到各自一致序列，再將不同進(jìn)化叢一致序列與中國(guó)地區(qū)所有序列的一致序列以及HCV 1b型標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行序列比對(duì)。結(jié)果顯示進(jìn)化叢1與中國(guó)所有序列的一致序列高度一致，同源性達(dá)100%，進(jìn)化叢1的一致序列與HCV 1b型標(biāo)準(zhǔn)序列之間的同源性為96.67%，進(jìn)化叢2的一致序列與標(biāo)準(zhǔn)序列之間的同源性為96.2%。本研究結(jié)果顯示，HCV 1b型NS3區(qū)631個(gè)氨基酸中共有25個(gè)位點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)序列不一致，其中14個(gè)位點(diǎn)位于已報(bào)道的T細(xì)胞表位內(nèi)。

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