潰瘍性結(jié)腸炎患者結(jié)腸黏膜5-HT信號通路的變化特點

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種炎癥性腸病(IBD)，其特征是結(jié)腸黏膜和黏膜下慢性炎性反應(yīng)，臨床表現(xiàn)主要包括腹瀉、便血和腹痛。UC的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確[1]。

腸道5-羥色胺(5-HT)主要由腸嗜鉻(EC)細(xì)胞合成、貯存和釋放[2]。EC細(xì)胞通過色氨酸羥化酶1(TPH1)合成5-HT，5-HT釋放后，一部分作用于各種5-HT受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，另一部分被5-HT再攝取轉(zhuǎn)運蛋白(SERT)攝取到上皮細(xì)胞中，經(jīng)單胺氧化酶代謝而終止作用。5-HT在胃腸道的運動、分泌和感覺調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)5-HT與腸道疾病如腸易激綜合征、IBD有關(guān)[2,4-5]。有研究報道UC患者結(jié)腸黏膜中5-HT信號通路的變化，但結(jié)果不一致[2]。本課題組研究了5-HT信號通路在UC患者結(jié)腸黏膜中的變化，并分析了5-HT釋放量與UC疾病活動度的相關(guān)性，以期進(jìn)一步了解UC的發(fā)病機(jī)制。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

本研究選擇2016年6月至2018年1月在香港大學(xué)深圳醫(yī)院接受診治的18例活動期UC患者，另選擇11名同期的健康體檢者作為健康對照組。UC患者包括11例男性和7例女性，年齡范圍24～68歲，平均年齡(45.3±12.0)歲，平均病程(4.5±3.1)年。UC的診斷根據(jù)潰瘍性結(jié)腸炎共識第1部分，采用Mayo病活動指數(shù)(DAI)評估UC疾病活動度(3～5分為輕度，6～10分為中度，11～12分為重度)[6]。UC組與健康對照組的年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1。兩組均未使用針對5-HT系統(tǒng)的藥物(如選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑、5-HT4激動劑或5-HT3拮抗劑)。通過結(jié)腸鏡下活組織檢查獲得兩組的結(jié)腸黏膜組織標(biāo)本。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有入選者均知情同意。

表1 兩組一般情況

1.2 結(jié)腸黏膜5-HT含量的測定

按照說明書制備結(jié)腸黏膜組織勻漿，使用酶免疫分析試劑盒(美國ENZO公司)檢測5-HT含量。組織中5-HT含量單位為ng/mg。

1.3 結(jié)腸黏膜5-HT釋放量的測定

每個受試者均取兩塊結(jié)腸黏膜活組織標(biāo)本用來檢測5-HT釋放量。將標(biāo)本置于37 ℃、5% CO2的組織培養(yǎng)板中(24孔)，在1 000 μL含有10%胎牛血清(美國Gibco公司)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中孵育24 h，吸取培養(yǎng)液后離心，獲取上清液，用酶免疫測定試劑盒(美國ENZO公司)測定釋放到上清液中的5-HT量。

1.4 免疫熒光法檢測5-HT、TPH1和SERT的分布和表達(dá)

將結(jié)腸黏膜活組織標(biāo)本固定在10%的中性甲醛中過夜，常規(guī)制備石蠟切片。石蠟切片經(jīng)脫蠟和水化后，經(jīng)pH 6.8的枸櫞酸鈉溶液用高壓鍋行抗原熱修復(fù)，在室溫下0.1 mol/L PBS溶液(含5%正常驢血清和0.3%Triton X-100)中孵育30 min，4 ℃孵育一抗過夜，使用的一抗包括山羊抗人5-HT(1∶1 000)、兔抗人SERT(1∶100)和兔抗人TPH1(1∶100)，均購自美國Abcam公司。切片用PBS溶液洗3次，在室溫下用相應(yīng)的二抗孵育1 h，使用的二抗包括Alexa Fluor 594標(biāo)記的驢抗山羊IgG(1∶200)和Alexa Fluor 594標(biāo)記的驢抗兔IgG(1∶200)，均購自美國Jackson ImmunoResearch公司。切片用PBS溶液洗3次，再用包含DAPI的抗熒光衰減試劑封片(美國Cell Signaling公司)，用熒光顯微鏡進(jìn)行圖像采集和分析。

1.5 圖像分析EC細(xì)胞數(shù)量

用熒光顯微鏡觀察5-HT和DAPI染色的免疫反應(yīng)性，使用20倍高倍鏡獲取圖像。5-HT免疫反應(yīng)呈紅色，DAPI復(fù)染細(xì)胞核為藍(lán)色，位于結(jié)腸黏膜內(nèi)的5-HT免疫陽性細(xì)胞即EC細(xì)胞。每個切片隨機(jī)選取3個視野計數(shù)EC細(xì)胞數(shù)量和隱窩數(shù)量[24]，計算隱窩的EC細(xì)胞平均數(shù)(3個視野的EC細(xì)胞總數(shù)÷3個視野的隱窩總數(shù))。

1.6 結(jié)腸黏膜TPH1和SERT的mRNA表達(dá)水平

采用qRT-PCR檢測TPH1和SERT的mRNA表達(dá)水平。使用RNeasy Plus Mini試劑盒(德國Qiagen公司)，從新鮮冷凍結(jié)腸黏膜組織中提取和純化總RNA。測定所有樣品的RNA量，凝膠電泳評估RNA完整性。使用QuantiNova Reverse Transcription試劑盒(德國Qiagen公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將所得的cDNA用于qRT-PCR。

qRT-PCR在LightCycler 480實時熱循環(huán)儀(德國Roche公司)中進(jìn)行，反應(yīng)體積為20 μL。TPH1、SERT和內(nèi)參基因β-肌動蛋白的mRNA水平采用QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒(德國Qiagen公司)進(jìn)行PCR檢測。PCR擴(kuò)增條件為95 ℃、5 s，然后95 ℃、5 s和60 ℃、10 s進(jìn)行40個循環(huán)。用2-ΔΔCt法將SERT和TPH1的mRNA水平與內(nèi)參基因β-肌動蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并與健康對照組進(jìn)行比較。所有引物購自上海英濰捷基公司，SERT的正義引物為5′-TTGGACGTGTGAGGAT GTGG-3′，反義引物為5′-TCCCTGTTCTCTC CTACGCA-3′；TPH1的正義引物為5′-ACGTCGA AAGTATTTTGCGGA-3′，反義引物為5′-AC GGTTCCCCAGGTCTTAATC-3′；β-肌動蛋白的正義引物為5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，反義引物為5′-CTCCTTAATGTCACGCACGA T-3′。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。比較UC組和健康對照組時，用Studentt檢驗分析比較組間均數(shù)，用卡方檢驗分析計數(shù)資料。采用線性回歸分析確定5-HT釋放量與UC疾病活動度的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5-HT的含量

如圖1A所示，UC組結(jié)腸黏膜中5-HT含量[(67.48±21.14)ng/mg]顯著高于健康對照組[(24.69±7.08) ng/mg]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，說明UC患者結(jié)腸黏膜5-HT的含量增加。

2.2 TPH1的表達(dá)

腸道5-HT絕大部分由EC細(xì)胞合成、儲存和分泌。5-HT生物合成的限速酶為TPH1。UC患者結(jié)腸黏膜中5-HT含量增加是否與5-HT合成增加有關(guān)？本研究采用RT-PCR定量研究TPH1的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與健康對照組(1.01±0.18)相比，UC組結(jié)腸黏膜中TPH1的mRNA水平(2.01±0.43)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見圖1B。免疫熒光法檢測發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸黏膜隱窩內(nèi)TPH1免疫反應(yīng)性呈紅色，DAPI復(fù)染細(xì)胞核為藍(lán)色，UC組結(jié)腸黏膜中TPH1的免疫反應(yīng)性較對照組升高，提示其TPH1蛋白表達(dá)水平顯著升高，見圖1C和1D。UC患者結(jié)腸黏膜中TPH1表達(dá)水平升高，提示5-HT合成增加。

圖1結(jié)腸黏膜中5-HT含量和TPH1表達(dá)A兩組的5-HT含量比較B兩組的TPH1 mRNA表達(dá)水平比較C對照組TPH1的免疫熒光反應(yīng)(紅色) ×200DUC組TPH1的免疫熒光反應(yīng)(紅色) ×200

2.3 EC細(xì)胞的數(shù)量

為了確定結(jié)腸黏膜中5-HT含量增加是否與EC細(xì)胞數(shù)量增加有關(guān)，本研究通過免疫熒光標(biāo)記結(jié)腸黏膜中5-HT來定量檢測EC細(xì)胞。如圖2A和2B所示，結(jié)腸黏膜隱窩內(nèi)5-HT免疫反應(yīng)性呈紅色，DAPI復(fù)染細(xì)胞核為藍(lán)色，UC組的5-HT免疫反應(yīng)性較對照組升高。如圖2C所示，定量分析顯示UC組結(jié)腸黏膜中每個隱窩的EC細(xì)胞數(shù)量[(1.3±0.3)個]比對照組[(0.5±0.1)個]顯著增加(P<0.001)。

圖2結(jié)腸黏膜中EC細(xì)胞數(shù)量A對照組的5-HT免疫熒光反應(yīng)(紅色) ×200BUC組的5-HT免疫熒光反應(yīng)(紅色) ×200C兩組的EC細(xì)胞數(shù)量定量分析比較

2.4 5-HT的釋放量及其與UC疾病活動度的相關(guān)性

結(jié)腸黏膜5-HT釋放量如圖3A所示，與健康對照組[(15.18±3.42)ng/mg]相比，UC患者5-HT釋放量顯著增加[(81.16±16.62)ng/mg]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。這表明隨著TPH1表達(dá)水平的升高，5-HT含量和EC細(xì)胞數(shù)量的增加，結(jié)腸黏膜5-HT釋放量也增加。相關(guān)分析顯示，UC組結(jié)腸黏膜5-HT釋放量與UC疾病活動度(Mayo評分)呈線性正相關(guān)(r=0.735，P=0.001)，見圖3B。

圖3結(jié)腸黏膜5-HT釋放量及其與UC疾病活動度的相關(guān)性A兩組結(jié)腸黏膜5-HT釋放量比較B結(jié)腸黏膜5-HT釋放量與UC疾病活動度的相關(guān)性分析

2.5 SERT的表達(dá)

上述數(shù)據(jù)表明UC組結(jié)腸黏膜5-HT的釋放量增加，然而，如果5-HT釋放后被再攝取滅活的能力受到影響，5-HT信號通路可能改變。為了確定SERT在UC組結(jié)腸黏膜中的表達(dá)是否發(fā)生改變，本研究采用免疫熒光法檢測發(fā)現(xiàn)，SERT廣泛表達(dá)于結(jié)腸黏膜細(xì)胞，陽性表達(dá)的細(xì)胞染色為紅色。與對照組相比，UC患者結(jié)腸黏膜中SERT的免疫反應(yīng)性顯著降低(見圖4A和4B)，提示結(jié)腸黏膜中SERT的蛋白表達(dá)水平也降低。本研究采用qRT-PCR法檢測SERT的mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與對照組(1.05±0.33)相比，UC組結(jié)腸黏膜中SERT mRNA表達(dá)水平(0.33±0.14)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見圖4C。

圖4結(jié)腸黏膜中SERT表達(dá)水平A對照組的SERT免疫熒光反應(yīng)(紅色) ×200BUC組的SERT免疫熒光反應(yīng)(紅色) ×200C兩組的SERT mRNA表達(dá)水平比較

3 討論

UC發(fā)病率在全球普遍升高，其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。5-HT在腸道運動、分泌和感覺功能中起著重要作用，并可加重結(jié)腸炎動物模型的炎性反應(yīng)[5]，因此UC發(fā)病可能與5-HT信號通路的改變有關(guān)。有關(guān)UC患者結(jié)腸黏膜5-HT信號通路異常的研究報道較少，而且結(jié)果不一致[2]。

本課題對UC患者結(jié)腸黏膜5-HT信號通路的變化以及5-HT釋放量與UC疾病活動度的相關(guān)性進(jìn)行了研究。腸黏膜中5-HT信號通路涉及5-HT的合成、儲存、釋放和再攝取降解。本研究結(jié)果表明，5-HT信號通路的幾個關(guān)鍵環(huán)節(jié)在UC患者中發(fā)生改變，包括結(jié)腸黏膜中EC細(xì)胞增加、5-HT含量增加、合成酶TPH1表達(dá)上調(diào)以及SERT下調(diào)而導(dǎo)致的5-HT再攝取改變，這些改變導(dǎo)致UC患者結(jié)腸黏膜中5-HT的有效性增強(qiáng)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)結(jié)腸黏膜5-HT釋放量與UC疾病活動度呈正相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，UC組結(jié)腸黏膜中EC細(xì)胞數(shù)、5-HT含量和TPH1表達(dá)水平高于健康對照組，表明UC組結(jié)腸黏膜中5-HT的有效性增強(qiáng)。EC細(xì)胞中5-HT合成的限速酶TPH1表達(dá)升高，提示EC細(xì)胞合成5-HT增加。以往研究表明，UC患者結(jié)腸黏膜中EC細(xì)胞數(shù)量和5-HT含量增加[7-8]，與本研究結(jié)果一致。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)重度UC患者的結(jié)腸黏膜中EC細(xì)胞數(shù)量減少[9]，這可能是由于重度UC患者結(jié)腸黏膜損傷導(dǎo)致EC細(xì)胞數(shù)量減少，也可能與EC細(xì)胞計數(shù)方法有關(guān)(EC細(xì)胞數(shù)量÷上皮細(xì)胞數(shù)量)，UC患者結(jié)腸黏膜細(xì)胞增生可能導(dǎo)致EC細(xì)胞計數(shù)結(jié)果減少。

本研究發(fā)現(xiàn)UC患者結(jié)腸黏膜5-HT釋放量增加，提示結(jié)腸黏膜中5-HT含量和EC細(xì)胞數(shù)量的增加改變了5-HT的釋放量。動物實驗發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎性反應(yīng)時5-HT釋放量增加[10]，但也有研究發(fā)現(xiàn)UC患者結(jié)腸黏膜5-HT釋放量無改變[9]，這可能與檢測方法有關(guān)，結(jié)腸黏膜5 min的5-HT釋放量可能不足以反映炎性反應(yīng)的黏膜與正常黏膜的差異。本研究檢測結(jié)腸黏膜24 h的5-HT釋放量，發(fā)現(xiàn)炎性反應(yīng)黏膜較正常黏膜釋放更多的5-HT。釋放量增加的5-HT可能作用于各種5-HT受體，從而誘導(dǎo)更強(qiáng)的生物學(xué)作用。動物實驗發(fā)現(xiàn)，5-HT可誘導(dǎo)動物結(jié)腸炎性反應(yīng)加重[11]，TPH1基因敲除小鼠[5]和TPH1抑制劑[12-13]均可使小鼠的結(jié)腸炎性反應(yīng)顯著減輕。本研究發(fā)現(xiàn)，5-HT釋放量與UC疾病活動度(Mayo評分)呈正相關(guān)性。因此，UC患者結(jié)腸黏膜5-HT釋放量增強(qiáng)，可能導(dǎo)致結(jié)腸炎性反應(yīng)加重。

本研究還發(fā)現(xiàn)，UC組結(jié)腸黏膜5-HT攝取轉(zhuǎn)運蛋白SERT的mRNA和免疫反應(yīng)水平下調(diào)。以往研究發(fā)現(xiàn)UC患者結(jié)腸黏膜中SERT表達(dá)在蛋白和轉(zhuǎn)錄水平上均顯著降低[9,14]，動物結(jié)腸炎模型研究也有類似的結(jié)果[15]，本研究結(jié)果與以往研究結(jié)果一致。臨床研究發(fā)現(xiàn)，選擇性5-HT再攝取抑制劑的應(yīng)用與顯微鏡下結(jié)腸炎有關(guān)[16]。缺乏SERT的轉(zhuǎn)基因小鼠可出現(xiàn)更嚴(yán)重的結(jié)腸炎[17]。因此，UC患者結(jié)腸黏膜SERT表達(dá)降低，提示5-HT再攝取滅活可能受損，可能也導(dǎo)致了5-HT有效性增強(qiáng)，導(dǎo)致結(jié)腸炎性反應(yīng)加重。

總之，本研究結(jié)果表明，UC患者結(jié)腸黏膜5-HT信號通路多個環(huán)節(jié)發(fā)生異常改變，包括EC細(xì)胞數(shù)量增加、5-HT合成酶TPH1表達(dá)升高、5-HT含量和釋放量增加，以及5-HT再攝取轉(zhuǎn)運蛋白SERT表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致結(jié)腸黏膜5-HT的有效性增強(qiáng)。此外，結(jié)腸黏膜5-HT釋放量與UC疾病活動度呈正相關(guān)。鑒于5-HT在腸道運動、感覺、分泌功能和炎性反應(yīng)中的作用，UC患者的臨床癥狀可能與結(jié)腸黏膜的5-HT信號通路異常改變有關(guān)。今后有必要進(jìn)一步研究5-HT在UC患者結(jié)腸炎性反應(yīng)中的作用，以及以5-HT信號通路為靶點的藥物對UC患者的治療作用[2,18]。