lncRNA-SChLAP1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

肝細(xì)胞癌(HCC)是常見(jiàn)的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤，在非洲和亞洲的發(fā)病率較高。HCC位居中國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率的第3位，在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率接近55%?，F(xiàn)有治療方法的長(zhǎng)期效果尚不能令人滿意，HCC患者的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍然呈升高趨勢(shì)[1]。因此，對(duì)疾病進(jìn)展的生物標(biāo)志物的研究對(duì)優(yōu)化治療結(jié)果具有重要的意義。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞分化、基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控、染色質(zhì)修飾和細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)之間的運(yùn)輸?shù)榷喾N功能，在腫瘤形成、預(yù)后標(biāo)志物作用、治療模式風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)等方面起著非常重要的作用[2]。SChLAP1是一種新型的前列腺癌標(biāo)志物，與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。Prensner首次報(bào)道SChLAP1是一個(gè)在前列腺癌的子集中過(guò)度表達(dá)并與致命疾病相關(guān)的lncRNA，涉及到腫瘤細(xì)胞的入侵和轉(zhuǎn)移[4]。本課題組的前期研究已經(jīng)證明SChLAP1與結(jié)直腸癌的預(yù)后明顯相關(guān)[5]。本研究通過(guò)檢測(cè)HCC及瘤旁組織中l(wèi)ncRNA-SChLAP1的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性，從而闡明SChLAP1在HCC中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2008年4月至2014年6月丹東市第一醫(yī)院、沈陽(yáng)市第五人民醫(yī)院行手術(shù)切除后經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為HCC的92例腫瘤組織標(biāo)本(包括癌旁肝組織46例)。病理參數(shù)包括年齡、性別、腫瘤大小、門(mén)脈癌栓、TNM分期、肝硬化情況、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和甲胎蛋白(AFP)水平、無(wú)病生存時(shí)間及5年總生存率等。92例患者中，男性69例，女性23例；年齡為26～73歲，中位年齡為54歲；其中51例為早期(Ⅰ～Ⅱ)，41例為晚期(Ⅲ～Ⅳ)。92例患者手術(shù)前均未接受放射、化學(xué)治療，HCC患者術(shù)后隨訪5年，或直至死亡。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽屬了知情同意書(shū)。

1.2 RNA提取及實(shí)時(shí)定量PCR

使用試劑盒(TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，購(gòu)自日本TaKaRa公司)根據(jù)制造商的指示提取組織樣本的總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶引物合成第一鏈cDNA和低聚糖(dT)。取出2 μL產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95℃ 15s，60℃ 60s，40次循環(huán)，之后行3%瓊脂糖凝膠電泳[6]。應(yīng)用ChampChemi專(zhuān)業(yè)圖像分析系統(tǒng)(中國(guó)賽智公司)和Lane 1D凝膠成像分析軟件(中國(guó)賽智公司)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行量化。實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)均為3次獨(dú)立樣本經(jīng)過(guò)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)，運(yùn)用公式RQ=2-ΔΔCt進(jìn)行分析。引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR反應(yīng)引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。HCC及癌旁組織中SChLAP1表達(dá)水平之間的比較、SChLAP1表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系比較用卡方檢驗(yàn)和確切Fisher′檢驗(yàn)；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank法進(jìn)行生存分析；Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行總生存期單因素及多因素分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SChLAP1在HCC組織中的表達(dá)及其與臨床參數(shù)的關(guān)系

實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)結(jié)果顯示，SChLAP1在92例HCC組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 SChLAP1 在不同組織中的表達(dá)水平

以SChLAP1表達(dá)的中位數(shù)(4.452)作為分界點(diǎn)，將92例患者的SChLAP1表達(dá)水平分為高表達(dá)組55例和低表達(dá)組37例。HCC組織中SChLAP1的高表達(dá)率與腫瘤大小、有無(wú)門(mén)脈癌栓、臨床分期明顯相關(guān)，即SChLAP1在腫瘤較大、有門(mén)脈癌栓、Ⅲ～Ⅳ級(jí)的患者中表達(dá)水平較高。同時(shí)，SChLAP1的表達(dá)與患者的年齡、性別、是否有肝硬化、HBsAg和AFP的水平無(wú)相關(guān)性。見(jiàn)表2。

2.2 SChLAP1的表達(dá)與HCC患者的預(yù)后

應(yīng)用Kaplan-Meier繪制生存曲線，結(jié)果顯示SChLAP1高表達(dá)的患者的無(wú)病生存率和總生存率均明顯低于低表達(dá)者(無(wú)病生存率Log-rank=11.077，P=0.001；總生存率Log-rank=10.728，P=0.001，見(jiàn)圖2)。門(mén)脈未侵犯組、早期組和晚期組患者行組內(nèi)比較顯示，SChLAP1高表達(dá)者的無(wú)病生存率和總生存率均低于低表達(dá)者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)圖3、圖4。但SChLAP1的表達(dá)水平在門(mén)脈已侵犯組內(nèi)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 SChLAP1的表達(dá)與HCC臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

圖2 SChLAP1的表達(dá)水平對(duì)患者生存率的影響A無(wú)病生存率B總生存率

圖3 SChLAP1的表達(dá)水平在門(mén)脈未侵犯時(shí)對(duì)患者生存率的影響A無(wú)病生存率B總生存率

圖4SChLAP1的表達(dá)水平在不同臨床分期中對(duì)患者生存率的影響A早期患者無(wú)病生存率B早期患者總生存率C晚期患者無(wú)病生存率D晚期患者總生存率

Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，HCC中SChLAP1的高表達(dá)與臨床分期均是患者總生存率的獨(dú)立影響因子(P<0.01，見(jiàn)表2)。

表2 Cox回歸模型分析HCC患者預(yù)后影響因素

3 討論

lncRNA參與了多種生物學(xué)過(guò)程，包括多能干細(xì)胞重編程、致癌進(jìn)展和細(xì)胞周期調(diào)控等，在導(dǎo)致疾病(包括腫瘤)進(jìn)展的基因表達(dá)調(diào)控方面扮演著重要的角色。最近研究表明，lncRNA失調(diào)不僅會(huì)影響真核基因組的調(diào)節(jié)，而且還會(huì)給惡性細(xì)胞帶來(lái)生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)行性和不受控制性生長(zhǎng)。HCC的起源和預(yù)后與lncRNA關(guān)系密切。Liu等[7]收集了162例HCC組織和癌旁組織，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了lncRNA-HOST2的表達(dá)，結(jié)果顯示HCC組織中l(wèi)ncRNA-HOST2的表達(dá)較鄰近的正常組織升高了2～10倍。在人類(lèi)HCC細(xì)胞系SMMC-7721中，lncRNA-HOST2能促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移并抑制細(xì)胞凋亡；Xu等[8]證實(shí)了一種新的lncRNA-Myd88在體外和體內(nèi)均可促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，通過(guò)增強(qiáng)Myd88基因的啟動(dòng)子，lnc-Myd88可以升高下游基因Myd88表達(dá)，導(dǎo)致核因子κB(NF-κB)和PI3k/ARKT信號(hào)通路激活。Wang等[9]報(bào)道，lncRNA-DILC介導(dǎo)了腫瘤壞死因子α(TNF-α)/NF-κB信號(hào)和自體分泌白細(xì)胞介素-6(IL-6)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)級(jí)聯(lián)反應(yīng)之間的串?dāng)_，并將肝臟炎性反應(yīng)與肝癌干細(xì)胞的擴(kuò)增聯(lián)系起來(lái)，表明lncRNA-DILC可能不僅是一個(gè)潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物，還是針對(duì)肝癌干細(xì)胞的治療靶點(diǎn)。因此，lncRNA可能在HCC的演進(jìn)過(guò)程中具有重要功能。

SChLAP1被命名為與前列腺-1相關(guān)的第2個(gè)染色體基因座，也稱(chēng)為L(zhǎng)INC00913。Prensner等[4]在前列腺癌患者中發(fā)現(xiàn)，SChLAP1呈過(guò)表達(dá)，且可以作為患者預(yù)后不良的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)指標(biāo)，包括腫瘤的轉(zhuǎn)移和前列腺癌特異性死亡；同時(shí)，該研究通過(guò)體外及體內(nèi)功能獲得和功能缺失實(shí)驗(yàn)表明，SChLAP1對(duì)SWI/SNF染色質(zhì)修飾的基因組定位和調(diào)控產(chǎn)生抵抗，阻斷了SWI/SNF復(fù)合物的抑癌功能，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致致死性腫瘤的進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，HCC組織中SChLAP1 mRNA的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，且與腫瘤大小、門(mén)脈癌栓的形成及臨床分期等預(yù)后因素呈密切相關(guān)。生存分析結(jié)果表明，SChLAP1高表達(dá)的患者無(wú)病生存率及總生存率均明顯低于低表達(dá)的患者，提示SChLAP1對(duì)HCC的預(yù)后具有可靠的評(píng)估意義。門(mén)脈侵犯和臨床分期是HCC公認(rèn)的預(yù)后影響因子。本研究發(fā)現(xiàn)，在門(mén)脈未侵犯的患者中，高表達(dá)者的無(wú)病生存率和總生存率均明顯低于低表達(dá)者；無(wú)論是在早期還是晚期患者中，高表達(dá)者的無(wú)病生存率和總生存率均明顯低于低表達(dá)者，提示可以將SChLAP1、門(mén)脈侵犯與否及臨床分期聯(lián)合評(píng)估HCC的預(yù)后情況。經(jīng)Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，SChLAP1的高表達(dá)和臨床分期均是影響HCC患者生存率的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。因此，SChLAP1可以作為一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物，起到對(duì)HCC預(yù)警以及治療靶標(biāo)的作用。

目前，對(duì)于HCC相關(guān)lncRNA及SChLAP1的研究仍然較少，它們?cè)贖CC細(xì)胞惡性演進(jìn)過(guò)程中的作用機(jī)制需要研究者深入分析，尤其是對(duì)SChLAP1的進(jìn)一步探索將為HCC預(yù)后評(píng)估和靶向治療提供新的生物標(biāo)志物。