新狼毒素A對(duì)人肝癌Hep G2細(xì)胞糖酵解的影響

丁楊芳，任博雪，趙微，李德芳，陳小宇，鄭秋生,*

(1石河子大學(xué)藥學(xué)院/新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子832002 2濱州醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，山東 青島56000)

狼毒最早出現(xiàn)在《神農(nóng)本草經(jīng)》一書。中醫(yī)認(rèn)為狼毒具有有逐水祛痰、破積殺蟲的功效，主要治療水腫腹脹，痰、食、蟲積、疥癬等[1]。已有的研究表明狼毒中有效成分如狼毒素，狼毒素B和新狼毒素C等都具有明顯的抗腫瘤活性[2-5]，除此之外，也有研究發(fā)現(xiàn)狼毒中的有效成分新狼毒素A有抑制細(xì)胞增殖的作用，且這種作用是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的[6]。因此，基于以上文獻(xiàn)報(bào)道，本研究探討新狼毒素A對(duì)Hep G2細(xì)胞的增殖抑制作用，以及對(duì)糖酵解的影響。

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，與肝癌死亡相關(guān)的人數(shù)每年約有25萬，其中有45%在中國(guó)，我國(guó)肝癌的發(fā)病率居高不下[7-9]。但是至今沒有較好的方法治愈肝癌。目前，手術(shù)已經(jīng)成為治療肝癌最主要的手段，但是手術(shù)治療是有創(chuàng)治療且在后期會(huì)面臨高轉(zhuǎn)移性的難題，除此之外，肝癌對(duì)傳統(tǒng)的化療藥敏感性很差，并且化療藥物往往具有很大的毒副作用，患者生活質(zhì)量受到很大的影響[10]。因此，更多的學(xué)者將注意力聚焦于天然產(chǎn)物，有望從中尋找出治療肝癌的有效的藥物。

本研究以Hep G2細(xì)胞為研究對(duì)象，探討新狼毒素A是否能通過影響細(xì)胞糖酵解來抑制人肝癌Hep G2細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步探討其潛在的分子機(jī)制，從而為新狼毒素A的藥理作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為肝癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

人肝癌Hep G2從中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買。

1.1.2 藥品及主要試劑

純度≥98%的新狼毒素A購(gòu)于(批號(hào)：CFS01701)武漢ChemFaces公司；磺基羅丹明B(SRB)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；MEM購(gòu)于(批號(hào)：1791942)Gibco公司；胰蛋白酶(批號(hào)：8250024)和DMSO(批號(hào)：520C0324)購(gòu)于北京索萊寶公司；胎牛血清(批號(hào)：J30329)購(gòu)于北京全式金公司；臺(tái)盼藍(lán)(批號(hào)：620C058)購(gòu)于Sigma公司；三磷酸腺苷(ATP)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20181227)，乳酸(LD)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20181217)，已糖激酶(HK)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20181229)，丙酮酸激酶(PK)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20181219)和乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20181214)均購(gòu)于南京建成生物公司；葡萄糖氧化酶法測(cè)定試劑盒(GOD)(批號(hào)：2018D1GE1010)購(gòu)于北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司，Thermo 3131型)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司，Thermo 3001型)；艾柯實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)(成都艾柯水處理設(shè)備有限公司，Exceed-Ad-60)；恒溫水浴鍋(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠，HH-S型)；Eppendorf 離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf，5424R 型)；超聲波細(xì)胞粉碎儀(SONICS公司，VCX130)；倒置顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器有限公司，BDS200-PH)。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)

人肝癌Hep G2細(xì)胞用MEM培養(yǎng)基(用時(shí)加10% FBS和1%雙抗)培養(yǎng)，24 h換液，3天消化1次，置于5% CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

使用SRB法檢測(cè)細(xì)胞活力，將Hep G2細(xì)胞以1×105個(gè)/mL加入到96孔板，每孔100 μL培養(yǎng)24 h，吸出原有培養(yǎng)基，加入含新狼毒素A(0，10，20，40，80 μg/mL)的新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后加入50 μL的50%的三氯乙酸在室溫靜置5 min，然后4 ℃放置1 h，棄去上清液，用超純水將96孔板洗5遍，甩干后在室溫干燥過夜，次日每孔加入100 μL的SRB液(0.4%)并在室溫放置20 min，然后吸棄SRB液并用1%的醋酸潤(rùn)洗96孔板5次，在室溫干燥過夜。加入150 μL的DMSO，在微量振蕩儀上震蕩10 min，在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，并計(jì)算細(xì)胞的抑制率。

1.2.2 臺(tái)盼藍(lán)拒染法觀察細(xì)胞Hep G2細(xì)胞形態(tài)及增殖率的影響

將Hep G2細(xì)胞以1.5×105個(gè)/mL加入到24孔板，每孔1 mL，培養(yǎng)24 h，吸出原培養(yǎng)基，加入含新狼毒素A(0，20，40，80 μg/mL)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，棄上清，用1 mL的PBS洗2遍，加入0.04%的臺(tái)盼藍(lán)500 μL染色3 min，在倒置顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)活細(xì)胞與死細(xì)胞數(shù)，計(jì)算死細(xì)胞數(shù)百分比。

死細(xì)胞數(shù)(%)=死細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.3 Hep G2細(xì)胞中ATP含量的測(cè)定

將Hep G2細(xì)胞以3×105個(gè)/ml加入到6孔板，每孔2 ml，培養(yǎng)24 h，吸出原培養(yǎng)基，加入含新狼毒素A(0，20，40，80 μg/ml)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，棄上清，加入300 μL的溫度為50 ℃的熱雙蒸水，在90-100 ℃的熱水浴中勻漿破碎，將細(xì)胞懸液沸水浴加熱10 min，取出后渦旋混勻1 min，按照ATP試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)算：

ATP濃度(μmol/gprot)=(OD測(cè)定值-OD對(duì)照值)/(OD標(biāo)準(zhǔn)值-OD空白值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(1×103μmol/L)×樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)÷待測(cè)樣本蛋白濃度(g prot/L)。

1.2.4 Hep G2細(xì)胞上清液中葡萄糖含量和乳酸含量的測(cè)定

將Hep G2細(xì)胞以3×105個(gè)/mL加入到6孔板，每孔2 mL培養(yǎng)24 h，次日吸出舊培養(yǎng)基，加入含新狼毒素A的培養(yǎng)基(0，20，40，80 μg/mL)培養(yǎng)48 h，吸取上清液按照乳酸測(cè)定試劑盒和葡萄糖氧化酶法測(cè)定試劑盒的說明檢測(cè)并計(jì)算含量。

1.2.5 Hep G2細(xì)胞中己糖激酶(HK)，丙酮酸激酶(PK)和乳酸脫氫酶(LDH)的活性測(cè)定

收集處理好的Hep G2細(xì)胞，離心棄去上清，在底層細(xì)胞加入PBS溶液，利用細(xì)胞超聲破碎儀在冰上破碎細(xì)胞(每次5 s，間隔30 s)制成細(xì)胞懸液。按照己糖激酶(HK)，丙酮酸激酶(PK)和乳酸脫氫酶(LDH)的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)算活性。

勻漿蛋白濃度(gprot/mL)，

勻漿蛋白濃度(gprot/mL),

標(biāo)準(zhǔn)品濃度(0.2μmol/mL)÷待測(cè)樣本蛋白濃度(gprot/mL)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析, 使用One-way ANOVA方法分析組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3遍，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，P<0.01表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 新狼毒素A抑制Hep G2細(xì)胞的增殖

如圖1所示，在新狼毒素A作用于Hep G2細(xì)胞48 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，且隨著新狼毒素A濃度的增加抑制率逐漸增加，呈現(xiàn)劑量依賴性。48 h的抑制率分別達(dá)到了(8.20±2.51)%，(32.66±4.01)%，(42.52±3.51)%和(61.43±2.39)%。

與正常組相比, **P<0.01。Note：**P<0.01圖1 新狼毒素A抑制Hep G2細(xì)胞的增殖Fig.1 Effect of NCA on proliferation in Hep G2 cells

2.2 新狼毒素A誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)的改變并抑制細(xì)胞增殖

如圖2所示，新狼毒素A刺激HepG2細(xì)胞48 h后，正常細(xì)胞未被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色且細(xì)胞透亮光澤，而處理組細(xì)胞因?yàn)槟ねㄍ感栽龃?，無法排斥臺(tái)盼藍(lán)的進(jìn)入而被染成藍(lán)色，同時(shí)細(xì)胞的增殖也受到抑制，表明新狼毒素A抑制細(xì)胞的增殖。

與正常組相比, **P<0.01。Note：**P<0.01圖2 新狼毒素A對(duì)Hep G2細(xì)胞增殖的影響(×100)Fig.2 Effect of NCA on proliferation in Hep G2 cells(×100)

2.3 新狼毒素A抑制Hep G2細(xì)胞ATP的生成

如圖3所示，新狼毒素A作用于Hep G2細(xì)胞48 h后，細(xì)胞中的ATP水平受到抑制，且隨著新狼毒素A濃度的增大ATP水平逐漸降低，表明新狼毒素A降低了細(xì)胞ATP的水平。

與正常組相比, **P<0.01。Note：**P<0.01圖3 新狼毒素A對(duì)Hep G2細(xì)胞ATP水平的影響Fig.3 Effect of Neochamaejasmin A on ATP levels in Hep G2 cells

2.4 新狼毒素A對(duì)葡萄糖攝取量的影響

如圖4所示，新狼毒素A作用于Hep G2細(xì)胞48 h后，細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖含量隨著新狼毒素A濃度的增大逐漸增多，細(xì)胞攝取葡萄糖的能力減弱，各組上清液中葡萄糖含量分別為(0.14±0.015)，(0.26±0.054)，(0.43±0.025)和(0.77±0.036) mmol/L：結(jié)果表明新狼毒素能顯著抑制細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取。

與正常組相比, **P<0.01。Note：**P<0.01圖4 新狼毒素A對(duì)Hep G2細(xì)胞上清液中葡萄糖攝取的影響Fig.4 Effect of Neochamaejasmin A on Glucose Uptake in supernatant of Hep G2 cells

2.5 新狼毒素A對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸含量的影響

如圖5所示，新狼毒素A作用于Hep G2細(xì)胞48 h后，細(xì)胞培養(yǎng)液中的乳酸含量隨著新狼毒素A濃度的增大而減小，各組乳酸含量分別為(3.42±0.023)，(3.09±0.12)，(2.40±0.10)和(1.78±0.13) mmol/L：結(jié)果表明新狼毒素A能抑制細(xì)胞乳酸的生成。

與正常組相比, **P<0.01。Note：**P<0.01圖5 新狼毒素A對(duì)Hep G2細(xì)胞上清液中 乳酸分泌水平的影響Fig.5 Effect of Neochamaejasmin A on the secretion of lactic acid in supernatant of Hep G2 cells

2.6 新狼毒素A對(duì)已糖激酶(HK)，丙酮酸激酶(PK)和乳酸脫氫酶(LDH)的影響

如圖6所示，不同濃度的新狼毒素A作用于細(xì)胞48 h后，細(xì)胞中丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶活性均受到抑制且呈現(xiàn)劑量依賴性。結(jié)果表明新狼毒素A可以抑制丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶的活性。但是己糖激酶的活性變化不明顯。

與正常組相比, **P<0.01。Note：**P<0.01 圖6 新狼毒素A對(duì)Hep G2細(xì)胞HK、PK和LDH的影響Fig.6 Effect of Neochamaejasmin A on HK, PK and LDH in Hep G2 Cells

3 討論

新狼毒素A是從瑞香狼毒中提取出的活性化合物，已有研究證實(shí)新狼毒素A能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。本研究顯示新狼毒素A可以顯著抑制Hep G2細(xì)胞的生長(zhǎng)，并有明顯的細(xì)胞毒作用。

Warburg 效應(yīng)指多數(shù)的正常組織細(xì)胞主要產(chǎn)能方式為有氧代謝，當(dāng)所需要的氧不夠時(shí)，便會(huì)通過糖酵解的方式產(chǎn)能維持細(xì)胞活力，但腫瘤細(xì)胞顛覆了這一常理即提供足夠的氧腫瘤細(xì)胞也通過糖酵解的方式進(jìn)行產(chǎn)能[11]。所以大多的學(xué)者將目標(biāo)轉(zhuǎn)移到糖酵解這個(gè)焦點(diǎn)上，希望從中找到治療癌癥的有效的藥物[12]。腫瘤細(xì)胞的正常生長(zhǎng)離不開葡萄糖的支持，葡萄糖提供了腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的主要能量來源。本研究結(jié)果表明當(dāng)新狼毒素A作用于Hep G2細(xì)胞48 h后，細(xì)胞上清液中的葡萄糖含量顯著增多，表明細(xì)胞攝取葡萄糖的能力降低。ATP的供應(yīng)對(duì)于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖至關(guān)重要，抑制ATP的水平是糖酵解過程中至關(guān)重要的因素。除此之外，乳酸的分泌水平可以間接的反應(yīng)糖酵解的水平[13]。我們的結(jié)果表明細(xì)胞ATP和乳酸分泌水平隨著新狼毒素A濃度的增大而降低。

與糖酵解有關(guān)的酶主要有己糖激酶(HK)，丙酮酸激酶(PK)和乳酸脫氫酶(LDH)。HK是糖酵解的限速酶[14]，HK在糖酵解的過程中為腫瘤細(xì)胞提供所需要的大量物質(zhì)。PK是糖酵解的關(guān)鍵酶，PK與ATP水平密切聯(lián)系，PK活性越高，所產(chǎn)生的ATP凈含量會(huì)越高，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[15]。LDH可催化底物生成乳酸，酸性的環(huán)境利于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖[16]。我們的結(jié)果表明新狼毒素A通過抑制PK和LDH的活力，減少乳酸生成，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果顯示新狼毒素A可抑制Hep G2細(xì)胞的糖酵解水平，其機(jī)制可能與減少葡萄糖攝取和抑制糖酵解關(guān)鍵酶有關(guān)。