環(huán)磷酰胺對布魯氏菌侵染小鼠過程的影響

周光普，周永順，徐杰，譚君，張凡，高劍峰

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子832000)

無論從哪條通路進入，布魯氏菌都會在體內(nèi)擴散，并在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的細胞中建立一個生存和復(fù)制的生態(tài)位[1]。這種細菌可以產(chǎn)生全身性感染，也可以在給定的器官中優(yōu)先定位繁殖。布魯氏菌病的臨床特征取決于疾病的階段(急性、亞急性、慢性)所侵染的器官和系統(tǒng)，以及其他相關(guān)的器官和系統(tǒng)。盡管布氏菌病的性質(zhì)千變?nèi)f化，但炎癥仍是布氏菌病的一個特征，受感染組織通常表現(xiàn)為炎癥浸潤。由于布魯氏菌缺乏明顯的毒力因子，布魯氏菌病的病理表現(xiàn)可能源于炎癥驅(qū)動過程[2]。

環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CP)是一種廣泛用于治療腫瘤和嚴重自身免疫性疾病的細胞毒性烷基化劑[3]。據(jù)報道，CP可以降低多種免疫反應(yīng)，被廣泛用于動物的免疫抑制模型制作，來研究免疫增強劑的效果和原理[4-6]，或者動物相關(guān)疾病模型的制作[7]。用環(huán)磷酰胺腹腔注射昆明小鼠，發(fā)現(xiàn)外周血白細胞數(shù)量降低，小鼠肝腎功能下降，淋巴細胞轉(zhuǎn)化率降低[8]，CP可以誘導(dǎo)骨髓細胞凋亡，影響小鼠造血功能，導(dǎo)致小鼠模型中外周血細胞含量發(fā)生變化[9]?？偠灾珻P對機體的造血和免疫系統(tǒng)有廣泛的抑制作用，并且CP的劑量、給藥方式、時間和受試動物的品系、年齡、性別等因素與抑制的效果密切相關(guān)[10]。

本實驗利用CP的生物學(xué)活性，使受試小鼠處于暫時性的可恢復(fù)的免疫低下狀態(tài)，之后侵染布魯氏菌M5。研究昆明小鼠在CP的作用下，對布魯氏菌的相關(guān)炎癥反應(yīng)。為布魯氏菌病發(fā)病機制的研究提供數(shù)據(jù)和圖片支持，為進一步研究巨噬細胞和布魯氏菌的相互作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

6-8周齡，20±2 g清潔級雌性昆明小鼠80只，購自石河子大學(xué)實驗動物中心，實驗動物合格證號：2009-0006。

布魯氏菌M5疫苗株由石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細胞分子生物學(xué)實驗室保存。

環(huán)磷酰胺購自sigma公司，TNF-a、IFN-γ、NO 試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技公司，BSA顯色試劑盒購自武漢博士德生物公司，TSA、TSB培養(yǎng)基購自BD醫(yī)療器械公司，F(xiàn)4/80抗體購自ThermoFisher公司。

微量移液器(eppendorf)；恒溫培養(yǎng)箱(DNP- 9162)；生物安全柜(BAKER-SG403AHE)；輪式切片機(Leica-RM2255)；自動組織脫水機(KD-TS1A)；組織包埋機(KD-BM)；組織勻漿機(PB100-SP046)；全自動酶標儀(ELX-800)；全自動血細胞分析儀(XFA6100)

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗方案

實驗流程如圖1所示，雌性昆明小鼠80只適應(yīng)環(huán)境1周后，隨機分成4組。第1組為對照組(Untreated)腹腔注射相同劑量的生理鹽水，第2組為環(huán)磷酰胺組(CP)每只小鼠連續(xù)7 d腹腔注射40 mg/kg的CP，第3組為布魯氏菌M5組(B.melitensis)在第0 d侵染1×106CFU布魯氏菌M5，第4組環(huán)磷酰胺和布魯氏菌M5結(jié)合組(CP+B.melitensis)，連續(xù)7 d腹腔注射40 mg/kg的CP在第0 d侵染1×106CFU布魯氏菌M5。

圖1 實驗方案Fig.1 Experimental protocols

1.2.2 日常觀察記錄

給藥之日起觀察小鼠臨床癥狀：動物死亡數(shù)、健康狀況與毒性狀況、小鼠背毛與皮膚情況、眼睛、循環(huán)系統(tǒng)、自主運動和行為特點。記錄每日體重與進食量，分別在接種布魯氏菌后第3、7和14天每組處死6只小鼠，收集組織、血液進行后續(xù)實驗分析。

1.2.3 血液分析

收集第一天Untreated和CP組小鼠尾靜脈血液，用全自動血細胞分析儀進行細胞分析。

1.2.4 布魯氏菌侵染小鼠

將布魯氏菌M5株劃線接種于TSA培養(yǎng)基中，倒置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，在無菌條件下挑取邊緣整齊、中間隆起、表面光滑的單菌落接種于TSB培養(yǎng)基中，置于200 r/min恒溫搖床，37 ℃震蕩培養(yǎng)72 h。8000 r/min離心2 min，用麥氏比濁管將菌液濃度調(diào)整到5×106CFU/mL。在實驗的第0 天，B.melitensis和CP+ B.melitensis組小鼠每只注射200 μL含活菌數(shù)為1×106CFU。

1.2.5 臟器質(zhì)量

在第3、7和14 天分別對小鼠進行撲殺，每組小鼠在上述3個時間點各撲殺6只。將小鼠尸體浸泡在75%酒精中5 min，然后固定在手術(shù)板上，無菌條件下剪開小鼠腹部，觀察小鼠各組織病理變化情況，收集小鼠胸腺、肝、脾，稱重并計算臟器相對質(zhì)量。

臟器相對質(zhì)量=器官重量(mg)/體重(g)×100%。

1.2.6 組織細菌計數(shù)

無菌條件下，將小鼠脾臟、肺臟和肝臟組織轉(zhuǎn)移至15 mL無菌離心管中，加入5 mL無菌PBS，用組織勻漿機勻漿3 min，用無菌PBS將組織勻漿分別作1∶100和1∶1000稀釋，然后分別用原液、1∶100稀釋液、1∶1000稀釋液各100 μL均勻涂布于TSA培養(yǎng)基中，每個濃度各接種3塊平板，倒置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h,計算各平板菌落數(shù)量。

克脾菌落數(shù)=平板菌落數(shù)×10n/脾臟重量(g)×100%，n為稀釋倍數(shù)。

1.2.7 組織化學(xué)觀察

在無菌條件下取小鼠脾臟、肝臟和肺臟浸入4%多聚甲醛溶液中，24 h后換液，用于組織切片研究。將固定好的脾、肺和肝臟組織用刀片修成0.5 cm見方的組織塊，自動脫水機進行脫水、透明和浸蠟。石蠟包埋組織，用切片機連續(xù)切片，厚度約4 μm。用F4/80抗體免疫組化學(xué)檢測巨噬細胞浸潤。

1.2.8 細胞因子檢測

采集的小鼠非抗凝血，3000 r/min離心10 min，取上清，然后利用ELISA試劑盒(嚴格按照操作說明進行)測定TNF-a、NO 和IFN-γ的濃度大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 一般觀察結(jié)果

在實驗的第五天，觀察到CP組和CP+B.melitensis組小鼠出現(xiàn)明顯的精神萎靡(驅(qū)趕時不愿活動)，反應(yīng)遲鈍，行動遲緩，消瘦，嗜睡，而Untreated組和B.melitensis組小鼠沒有明顯的癥狀。在實驗的第2 d，CP+B.melitensis小鼠出現(xiàn)被毛凌亂，精神沉郁，個別小鼠出現(xiàn)弓頭縮背，行動遲緩，呼吸困難現(xiàn)象。從圖2中可以看出，CP注射后小鼠體重開始下降，停藥后體重趨于穩(wěn)定。B.melitensis組小鼠體重沒有明顯增長，在第23 d的時候，與Untreated組差異顯著(P<0.01)，CP+B.melitensis和CP組小鼠差異極顯著(P<0.001)。

圖2 昆明小鼠在試驗中的體重變化Fig.2 Average (per group) body weight recording of the KM mice from day 0 and until day 23

2.2 血液分析

40 mg/kg劑量連續(xù)7 d注射CP后，小鼠外周血血液學(xué)檢測結(jié)果如圖3所示，與對照組相比，環(huán)磷酰胺處理組小鼠外周血白細胞總數(shù)、淋巴細胞總數(shù)和粒細胞總數(shù)降低均超過50%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，P<0.01，P<0.001)(圖3)。

圖3 第8 d血液學(xué)指標變化，星號表示與對照組相比差異的顯著性Fig.3 Day 8 hematology result，Asterisks represent P-value significance

2.3 臟器相對質(zhì)量

臟器相對質(zhì)量見(圖4)。

Untreated組CP組B.melitensis組和CP+B.melitensis組小鼠侵染布魯氏菌M5后，第3、7和14 d無菌分離小鼠脾臟、胸腺、肝臟稱重，計算相對質(zhì)量。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)第3 d，CP組受環(huán)磷酰胺影響脾臟指數(shù)顯著低于Untreated組(P<0.05)。第7 d，CP+B.melitensis組脾臟相對質(zhì)量顯著高于Untreated組(P<0.05)，其總體平均值是Untreated組的2倍而B.melitensis組脾臟相對質(zhì)量平均值雖高于Untreated組但差異不顯著。在第14 d，CP+B.melitensis組和B.melitensis組脾臟指數(shù)均顯著高于Untreated組(P<0.05)。胸腺指數(shù)受環(huán)磷酰胺影響最為明顯，注射環(huán)磷酰胺小鼠均發(fā)現(xiàn)嚴重的胸腺萎縮。CP組和CP+B.melitensis組胸腺指數(shù)在第3、7和14 d均低于對照組，差異極顯著(P<0.01)。B.melitensis組胸腺指數(shù)略低于Untreated組，但差異不顯著。CP+B.melitensis組和B.melitensis組肝臟指數(shù)在第3、7和14 d均高于Untreated組，在第7 d時CP+B.melitensis組小鼠肝臟指數(shù)與Untreated組差異極顯著(P<0.01)，其余時間CP+B.melitensis組和B.melitensis組與Untreated組相比差異顯著(P<0.05)。

圖4 布魯氏菌注射后第3、7和14 d臟器與體重的比值Fig.4 Average (per group) viscera/body coefficient recording of the KM mice at days3,days 7 and days 14

2.4 組織細菌計數(shù)

布魯氏菌侵染小鼠3、7和14 d后，分離計數(shù)脾臟、肝臟和肺臟細菌，結(jié)果如圖5所示。脾臟、肝臟和肺臟內(nèi)，CP+B.melitensis組小鼠的活菌數(shù)在3、7和14 d與B.melitensis組小鼠相比差異極顯著(P<0.001)。

2.5 免疫組織化學(xué)觀察

免疫組織化學(xué)觀察見(圖6)。

用F4/80抗體的組織化學(xué)檢測結(jié)果如圖6所示。在脾臟中(圖6A)，Untreated組結(jié)果顯示了清晰地細胞間隙和少量的成熟巨噬細胞(黃色顆粒)。得到的組織學(xué)定量結(jié)果證實：CP+B.melitensis小鼠(p<0.01)，B.melitensis小鼠(P<0.01)相較于Untreated組，向脾臟遷移的巨噬細胞數(shù)量明顯增多(數(shù)據(jù)未展示)。隨著時間的推移，觀察到在CP+B.melitensis和B.melitensis組織中的巨噬細胞浸潤越來越多。Untreated組小鼠巨噬細胞浸潤較少，成分散的狀態(tài)分布在脾臟中，被布魯氏菌侵染的脾臟，巨噬細胞浸潤呈現(xiàn)聚集的狀態(tài)。在肺臟的組織化學(xué)檢測結(jié)果(圖6B)中，可以明顯觀察到Untreated組和CP組肺臟都能看到相對完整且均勻的肺泡結(jié)構(gòu)，CP+B.melitensis和B.melitensis組幾乎沒有完整的肺泡結(jié)構(gòu)，這可能是小鼠表現(xiàn)出呼吸困難的主要原因。組織學(xué)定量結(jié)果也顯示出，在第3、7和14 d 巨噬細胞浸潤的數(shù)量CP+B.melitensis組(P<0.05)和B.melitensis組均顯著高于Untreated組。在肝臟中也觀察到了相似的結(jié)果(圖6C)，Untreated組顯示出清晰地細胞間隙和細胞形態(tài)。CP+B.melitensis和B.melitensis組在第3、7和14 d隨著時間的推移，細胞間隙越來越不明顯，且與Untreated組相比，巨噬細胞浸潤有顯著增加(P<0.05)。

圖5 組織細菌分離結(jié)果Fig.5 Bacterial burden (c.f.u.) in spleen

2.6 細胞因子檢測

在第3 d時，CP 組、B.melitensis組和CP+B.melitensis組IFN-γ的含量相較于Untreated組含量顯著減少(P<0.05)，CP 組TNF-α的含量含量顯著降低(P<0.05)，B.melitensis組和CP+B.melitensis組NO含量相較于Untreated組含量略有升高差異不顯著。

在第7 d時，CP+B.melitensis組IFN-γ含量顯著高于Untreated組(P<0.01)，B.melitensis組和CP+B.melitensis組TNF-α含量顯著低于Untreated組(P<0.05)，CP+B.melitensis組NO含量顯著高于Untreated組(P<0.01)。

第14 d時，相較于Untreated組，B.melitensis組和CP+B.melitensis組IFN-γ和NO含量顯著升高(P<0.05)，TNF-α含量均顯著降低組(P<0.05)(表1)。

表1 血清細胞因子含量變化Tab.1 Change of the cytokine levels in the serum

注：*表示在對應(yīng)天數(shù)與對照組相比P值顯著性(*表示P<0.05，**表示P<0.01)。

3 討論

環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide, CP)是自體免疫性疾病、癌癥、血液和骨髓移植中最常用的藥物。如前所述，CP的免疫抑制的效果與其劑量、給藥方式等因素相關(guān)。因此，本研究首先評價了CP對小鼠免疫活性的影響。免疫器官的相對質(zhì)量表現(xiàn)免疫器官的發(fā)育狀況，能夠間接反映機體當前的免疫狀態(tài)。我們發(fā)現(xiàn)40 mg/kg的CP連續(xù)7 d腹腔注射雌性6-8周齡昆明小鼠，能夠使小鼠體重明顯下降，外周血白細胞、粒細胞和淋巴細胞數(shù)量減少，胸腺和脾臟質(zhì)量下降。說明CP對小鼠產(chǎn)生了一定程度的骨髓抑制[11]，并且誘導(dǎo)了脾臟和胸腺細胞凋亡[12-13]，故而引起了小鼠免疫能力的降低，我們觀察的結(jié)果，與之前的環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫抑制的結(jié)果一致[8, 10, 11]。

我們觀察到，布魯氏菌M5在侵染免疫抑制小鼠過程中，產(chǎn)生了更加明顯的被毛凌亂、弓頭縮背等臨床反應(yīng)，并且在其組織器官中分離出了更多的布魯氏菌(圖5)。說明在CP的作用下，為布魯氏菌在小鼠體內(nèi)的繁殖提供了更加舒適的環(huán)境，對布魯氏菌的生存產(chǎn)生了極大的影響。這些數(shù)據(jù)在今后的研究中可能是有用的，可以方便了解抗菌素藥物或著疫苗對布魯氏菌侵染宿主的保護效果，也可以研究在免疫功能受損情況下的布魯氏菌病的情況。更有意義的是，我們可以從環(huán)磷酰胺處理的動物體內(nèi)分離出吞噬細胞，研究宿主病原體的相互作用，以闡明免疫功能受損時巨噬細胞MHC抗原遞呈相關(guān)的白細胞功能和細胞因子的特異性[7]。

眾所周知，脾臟在機體免疫過程中發(fā)揮了巨大作用，布魯氏菌的侵染會導(dǎo)致脾臟腫大[14]。我們的實驗也觀察到類似的結(jié)果，B.melitensis小鼠脾臟質(zhì)量第7 d時相較于Untreated小鼠升高了50%，同時CP+B.melitensis小鼠脾臟質(zhì)量升高了138%(圖4)。我們知道，脾臟腫大主要是由脾臟炎性細胞浸潤引起的，故而我們推測CP引起了更加強烈的炎性細胞浸潤。免疫組化結(jié)果證實了我們的推測，在脾臟中我們我們發(fā)現(xiàn)了更多的巨噬細胞浸潤(圖6A)，這可能是引起CP+B.melitensis小鼠脾臟異常腫大的原因。有趣的是，我們還發(fā)現(xiàn)CP小鼠在第7 d脾臟質(zhì)量相較于Unterated小鼠略有上升(圖4)，推測可能是CP小鼠脾臟髓外代償性造血[15]引起的。而在肝臟和肺臟中也發(fā)現(xiàn)了相似的細胞浸潤結(jié)果(圖6：B、C)，說明在臟器內(nèi)可能產(chǎn)生了更強的炎癥反應(yīng)，這可能是導(dǎo)致小鼠呼吸困難等臨床癥狀的原因[2]。在CP作用后，炎癥反應(yīng)的加劇和或抑制可能與CP減少免疫抑制因子或調(diào)節(jié)T細胞的作用相關(guān)[16]。而CP+B.melitensis小鼠臟器內(nèi)有更多的布魯氏菌生存，這種結(jié)果很明顯并不是炎癥反應(yīng)減弱或者免疫細胞募集減少導(dǎo)致的，更有可能的原因是巨噬細胞殺滅布魯氏菌能力下降或者引起了不同的細胞浸潤類型[7]。

巨噬細胞參與布魯氏菌感染的早期炎癥反應(yīng)和宿主防御[17]。免疫組化結(jié)果顯示(圖6)，CP+B.melitensis小鼠巨噬細胞招募增加，提示巨噬細胞大量浸潤可補償感染早期免疫細胞的減少。巨噬細胞大量浸潤可能導(dǎo)致CP+B.melitensis小鼠感染后血清中促炎因子IFN-γ升高(表1)。IFN-γ調(diào)節(jié)免疫，能夠提高巨噬細胞對抗原的吞噬活性，還能夠激活T、B 淋巴細胞，從而提高機體的免疫應(yīng)答能力[18]。而TNF-α抑制有利于布魯氏菌在宿主細胞的生存繁殖，對 TNF-α的分泌抑制是布魯氏菌重要的生存策略[19]。在我們的研究中，發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果，并且CP對TNF-α抑制過程沒有明顯的作用。NO具有抑菌、抗病毒和抗腫瘤的特性，增加NO產(chǎn)量也能增強局部宿主防御機制，產(chǎn)生過量時會對細胞產(chǎn)生毒性[20]。CP+B.melitensis小鼠在CP的作用下，產(chǎn)生了更多的NO細胞因子，B.melitensis小鼠免疫能力相對健全，可以在布魯氏菌侵染過程中調(diào)節(jié)自身的免疫平衡。在胸腺中，NO誘導(dǎo)細胞凋亡，可能在T細胞的選擇和發(fā)育中發(fā)揮效應(yīng)分子的作用[21]，有趣的是，我們在B.melitensis小鼠中發(fā)現(xiàn)了胸腺萎縮(圖4)，說明在B.melitensis小鼠中NO對胸腺可能產(chǎn)生了細胞毒性?？偠灾?，CP+B.melitensis小鼠產(chǎn)生了更強的炎癥反應(yīng)，但是其具體的分子機制還需要進一步研究。

綜上所述，本文是首次報道CP對布魯氏菌感染小鼠的過程的影響。描述了CP誘導(dǎo)的小鼠免疫抑制，可能為布魯氏菌的侵染過程提供新的見解。研究布魯氏菌的毒力機制和宿主間的相互作用，對于制定更好的公共防疫和新的疫苗與藥物具有重大意義。