新疆維吾爾族代謝綜合征患者CETP基因單體型和連鎖不平衡分析

李毓，王海霞，胡云華，張向輝，郭恒，何佳，閆貽忠，馬儒林，郭淑霞

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，新疆 石河子 832000)

代謝綜合征(Metabolic Syndrome，MS)是一種慢性復(fù)雜性疾病，可引起多種并發(fā)癥且危害嚴(yán)重，隨著其發(fā)病率的升高，已成為全球性的重大公共衛(wèi)生問題[1]。其臨床特征主要有：中心性肥胖，血壓、空腹血糖及甘油三酯(Triglycerides，TG)水平升高，高密度脂蛋白膽固醇(High-density Lipoprotein Cholesterol，HDL-C)水平降低[2]。目前，基于MS具有進展性，在其定義上達成一致具有一定的困難[3]，而且，其組分也會隨著時間的推移而惡化。此外，世界各國MS患病率普遍較高。2003至2010年，美國MS整體患病率為33%[4]。在澳大利亞，MS的患病率為30.7%[5]。日本，男性MS的患病率為22.8%，女性為8.7%[6]。在我國一項Meta分析顯示，MS患病率為24.5%[7]。我們的前期調(diào)查結(jié)果顯示，新疆維吾爾族人群MS患病率為21.2%[8]，低于顧東風(fēng)等[9]報道的中國北方地區(qū)的MS患病率(23.3%)。在新疆的另一流行病學(xué)調(diào)查[10]顯示，維吾爾族人群MS患病率為27.9%，略低于同一地區(qū)的漢族(31.3%)。然而，MS的病因目前尚不明確，可能主要由年齡、種族、遺傳因素、飲食、行為和環(huán)境等因素引起[11]，并且，遺傳因素已越來越引起人們的重視。

膽固醇酯轉(zhuǎn)運蛋白(Cholesterol Ester Transfer Protein，CETP)介導(dǎo)血漿脂蛋白的交換和轉(zhuǎn)運，被認為是膽固醇逆向轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵蛋白，受到CETP基因的調(diào)控。目前，關(guān)于CETP基因的研究主要集中于與血脂異常的關(guān)系，國內(nèi)外學(xué)者對CETP基因多態(tài)性與MS各組分如高血壓、糖尿病、低HDL-C血癥等之間的相關(guān)性也已進行了深入研究[12-14]。在我們前期研究的CETP基因八個多態(tài)性位點中，rs1800775、rs3764261、rs12149545、rs711752、rs708272這五個多態(tài)性位點與維吾爾族和哈薩克族人群血脂異常有關(guān)[15]，相關(guān)研究報道CETP基因中六個多態(tài)性位點rs5882[16]、rs1800775[17]、rs3764261[18]、rs12149545[19]、rs711752[20]、rs708272[21]在不同人群中與MS及其組分具有不同程度的關(guān)聯(lián)性。目前，關(guān)于CETP基因多態(tài)性與MS之間的相關(guān)性研究存在民族和地區(qū)差異[22-23]，且多是單個位點多態(tài)性的研究，尚未有關(guān)于新疆維吾爾族人群CETP基因多態(tài)性與MS之間關(guān)系的報道。因此，本研究探討CETP基因六個多態(tài)性位點與維吾爾族人群MS及各組分的相關(guān)性，為新疆維吾爾族MS的遺傳易感性研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

遵從成組匹配原則，經(jīng)性別匹配后，在前期現(xiàn)況調(diào)查基礎(chǔ)上[24]，隨機選擇280例MS患者作為病例組，291例健康者作為正常對照組。

1.2 流行病學(xué)調(diào)查與血生化檢測

每位受試者均簽署知情同意書。本研究由石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理審查委員會批準(zhǔn)(IERB No. SHZ2010LL01)。所有調(diào)查員經(jīng)嚴(yán)格培訓(xùn)并考核合格，對當(dāng)?shù)鼐S吾爾族居民進行面對面詢問，詳細記錄受試者的基本信息(個人史、疾病史、家族史、飲食、飲酒、吸煙和體育鍛煉)。身高、體重、腰圍、臀圍、血壓由專業(yè)人員根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化方法進行測量[25]。生化指標(biāo)(總膽固醇(Total Cholesterol，TC)、TG、HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇(Low-density Lipoprotein Cholesterol，LDL-C)以及空腹血糖(Fasting Plasma Glucose，F(xiàn)PG))采用OLYMPUS2007全自動生化分析儀進行檢測。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn)

采用多機構(gòu)聯(lián)合聲明(JIS)診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，在下列符合三項或三項以上者，即可診斷為MS：(1)中心性肥胖：男性腰圍≥85 cm，女性腰圍≥80 cm；(2)TG水平升高：TG≥150 mg/dL(1.7 mmol/L)；(3)HDL-C水平降低：男性<40 mg/dL(1.0 mmol/L)，女性<50 mg/dL(1.30 mmol/L)；(4)血壓升高：收縮壓≥130 mmHg或舒張壓≥85 mmHg；(5)FPG升高：FPG≥100 mg/dL(5.6 mmol/L)。

1.4 DNA提取及CETP基因各位點測序

每個研究對象抽取空腹靜脈血200 μL，采用北京TIANGEN生化科技有限公司DNA提取試劑盒進行DNA的抽提。所得DNA經(jīng)0.7% 凝膠電泳驗證后，采用Nano-Drop分光光度計測定其純度和濃度。利用Mysequenom網(wǎng)站、AssayDesigner 3.0軟件設(shè)計各位點引物(表 1)。

提取所得DNA樣本送往上海捷瑞生物工程公司測序分析。

表1 CEPT基因位點上游及下游引物的序列Tab.1 The sequences of forward and reverse primers for genotyping of CETP gene

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 人口學(xué)評價及臨床特征

兩組間性別、吸煙以及飲酒比例差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。病例組平均年齡、體質(zhì)指數(shù)(Body mass index，BMI)、腰圍、臀圍、收縮壓(Systolic Blood Pressure，SBP)、舒張壓(Diastolic Blood Pressure，DBP)、FPG、TG、TC、LDL-C水平均高于對照組(P均<0.001)，而HDL-C水平卻低于對照組(P<0.001)(表2)。

表2 研究對象的人口學(xué)統(tǒng)計及臨床特征Tab.2 Demographic and clinical characteristics of study subjects

2.2 基因型與等位基因頻率分布比

rs5882位點基因型與等位基因頻率在病例組和對照組中分布比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。病例組rs3764261-T，rs708272-T、rs12149545-A以及rs711752-A的等位基因頻率均低于對照組(均P<0.05)。而rs1800775-C的等位基因頻率卻高于對照組(P=0.011)。病例組和對照組六個位點的基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡(均P>0.05)(表3)。

表3 對照組與病例組CETP基因6個SNP位點基因型及等位基因頻率分布和HardyWeinberg平衡檢驗Tab.3 Genotype and allele frequencies for the six SNPs of CETP gene between control and case group and Hardy-Weinberg equilibrium testing

注：C-R: rs5882 (A-G)，rs1800775 (A-C)，rs3764261 (G-T)，rs12149545 (G-A)，rs711752 (G-A)，rs708272 (C-T)；HWE(Hardy-Weinberg Equilibrium)-P：哈迪-溫伯格平衡定律P值；SNP(Single Nucleotide Polymorphisms):基因單核苷酸多態(tài)性。

2.3 MS危險因素分析

以MS為因變量(0=否，1=是)，分別以rs5882(AA=1，AG=2，GG=3)、rs1800775(AA=1，AC=2，CC=3)、rs3764261(GG=1，GT=2，TT=3)、rs12149545(GG=1，GA=2，AA=3)、rs711752(GG=1，GA=2，AA=3)、rs708272(CC=1，CT=2，TT=3)為自變量，控制年齡、性別(1=男性，2=女性)、吸煙(0=不吸煙，1=吸煙)和飲酒(0=不飲酒，1=飲酒)的影響后，分析各位點多態(tài)性與MS的關(guān)系(表4)。結(jié)果顯示：在rs1800775位點，CC基因型(P=0.009，OR=1.922，95%CI=1.174-3.147)患MS風(fēng)險高于AA基因型。在rs3764261位點，GT(P=0.001，OR=0.552，95%CI=0.387-0.788)和TT(P<0.001，OR=0.289，95%CI=0.145-0.573)基因型患MS風(fēng)險低于GG基因型。在rs12149545位點，AG(P<0.001，OR=0.484，95%CI=0.339-0.693)和AA(P<0.001，OR=0.277，95%CI=0.137-0.560)基因型患MS風(fēng)險低于GG基因型。在rs711752位點，AA基因型(P=0.005，OR=0.496，95%CI=0.305-0.805)患MS風(fēng)險低于GG基因型。在rs708272位點，TT(P=0.004，OR=0.491，95%CI=0.302-0.797)基因型患MS風(fēng)險低于CC基因型。

表4 CEPT基因6個SNP位點與代謝綜合征的關(guān)系Tab.4 The relationship between six SNPs of CETP gene and MS

注：對照:rs5882-AA，rs1800775-AA，rs3764261-GG，rs12149545-GG，rs711752-GG，rs708272-CC；β-回歸系數(shù)，S.E-標(biāo)準(zhǔn)誤。

2.4 MS各組分的危險因素分析

我們進一步研究了六個位點多態(tài)性與MS各組分之間的關(guān)系(表5)。分別以中心性肥胖(0=否，1=是)、血壓升高(0=否，1=是)、空腹血糖升高(0=否，1=是)、高TG血癥(0=否，1=是)、低HDL-C血癥(0=否，1=是)為因變量，進行單因素logistic回歸。

結(jié)果顯示：rs5882位點多態(tài)性與各組分間均沒有關(guān)聯(lián)。在rs1800775位點中，與AA基因型相比，AC(P=0.021，OR=1.480，95%CI=1.062-2.064)和CC(P<0.001，OR=2.231，95%CI=1.450-3.434)基因型低HDL-C血癥患病風(fēng)險更高，然而AC基因型(P=0.027，OR=0.543，95%CI=0.316-0.932)卻能降低血糖水平升高的風(fēng)險。在rs3764261位點中，與GG基因型相比，GT基因型會降低中心性肥胖(P=0.004，OR=0.631，95%CI=0.460-0.865)、高TG血癥(P=0.002，OR=0.596，95%CI=0.432-0.823)以及低HDL-C血癥(P=0.001，OR=0.575，95%CI=0.421-0.786)的患病風(fēng)險，卻會增加血糖水平升高的風(fēng)險(P=0.001，OR=2.509，95%CI=1.449-4.345)。在rs12149545位點中，AG和AA基因型與各組分之間的關(guān)系與rs3764261位點中GT和TT基因型相似。在rs711752位點中，與GG基因型相比，AA(P<0.001，OR=0.470，95%CI=0.310-0.713)基因型低HDL-C血癥的患病風(fēng)險更低。在rs708272位點中， CT(P=0.043，OR=0.696，95%CI=0.490-0.988)和TT(P=0.026，OR=0.616，95%CI=0.402-0.943)基因型患高TG血癥的風(fēng)險低于CC基因型，同時，CT(P=0.043，OR=0.700，95%CI=0.496-0.989)和TT基因型(P<0.001，OR=0.466，95%CI=0.307-0.707)低HDL-C血癥的患病風(fēng)險也低于CC基因型。

表5 代謝綜合征中CEPT基因6個SNP位點和5個成分的危險因素分析Tab.5 Risk factor analysis between six SNPs of CETP gene and five components in MS

注：對年齡和性別，吸煙和飲酒調(diào)整后進行分析。

2.5 連鎖不平衡(LD)檢驗

經(jīng)連鎖不平衡分析，rs3764261與rs12149545(D’=1.000，r2=0.931)，rs711752與rs708272(D’=1.000，r2=0.996)之間存在完全連鎖不平衡。另外我們還發(fā)現(xiàn)，rs1800775和rs711752(D’=0.833，r2=0.442)，rs1800775和rs708272(D’=0.833，r2=0.440)，rs3764261和rs711752(D’=0.880，r2=0.387)，rs3764261和rs708272(D’=0.874，r2=0.383)，rs12149545和rs711752(D’=0.979，r2=0.446)，rs12149545和rs708272(D’=0.972，r2=0.441)之間存在強的連鎖不平衡(表6)。

表6 CEPT基因6個SNP位點連鎖不平衡分析Tab.6 Linkage disequilibrium test for the six SNPs of CETP gene

注：右上三角為D’連鎖不平衡系數(shù)；左下三角為r2相關(guān)系數(shù)。

2.6 單體型分析

通過SHEsis軟件六個單核苷酸多態(tài)性成功形成了18種單體型，表7中為頻率大于0.001的8個單體型。

結(jié)果(表7)顯示對照組A-A-T-A-A-T和G-A-T-A-A-T單體型頻率高于病例組(P均<0.05)。其他5個單體型的頻率分布在兩組間的差異則不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表7 CEPT基因6個SNP位點的單體型頻率在維吾爾族對照組和病例組間的差異Tab.7 The discrepancy of haplotype frequencies of six SNPs in CETP gene between the control and case group in the Uyghur

注：整體Χ2=27.353，P<0.001(對照組與病例組中單體型頻率低于0.03未列入表格參加計算)；用A-C-G-G-G-C作為參考單體型以計算比值比；單體型基因順序(從左到右)：rs5882 (A/G), rs1800775 (A/C), rs3764261 (G/T), rs12149545 (G/A), rs711752 (G/A), rs708272 (C/T)。

3 討論

在我國，MS患病率普遍較高，且存在民族與地區(qū)差異，其中維吾爾族MS患病率低于同一地區(qū)的漢族和哈薩克族[10, 26]，這可能與維吾爾族獨特的民族特色和遺傳易感性有關(guān)。因此，我們選擇維吾爾族這一人群來研究CETP基因多態(tài)性與MS之間的關(guān)系。鑒于CETP是膽固醇逆轉(zhuǎn)運過程(RCT)中的一個關(guān)鍵交換因子，也是目前唯一已知的具有此功能的蛋白質(zhì)，在脂蛋白的代謝中起非常重要的作用，已引起學(xué)者的研究重視[27]。研究發(fā)現(xiàn)，CETP基因突變可能會影響血清中CETP的含量，進而影響脂質(zhì)代謝。

本研究發(fā)現(xiàn)，病例組平均年齡、BMI、腰圍、臀圍、血壓、血糖、TG、TC、LDL-C水平均高于對照組，HDL-C水平低于對照組。中心性肥胖、TG升高、HDL-C水平降低、血壓升高、FPG升高等癥狀導(dǎo)致了MS的發(fā)生，而HDL-C水平降低通常伴隨著TC和LDL-C水平的升高。兩組間的性別分布匹配，各位點均符合Hardy-Weinberg平衡，提示本研究樣本具有一定代表性。

研究發(fā)現(xiàn)，rs5882基因型與等位基因頻率分布在兩組間均沒有統(tǒng)計學(xué)差異。可能是由于樣本含量太小引起，因此我們會通過后期擴大樣本進行更加深入的研究。其他五個位點的基因型與等位基因頻率分布在兩組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。在rs1800775位點中，與A等位基因攜帶者相比，C等位基因攜帶者MS的患病風(fēng)險增加了35.6%，與Radovica I等[28]研究結(jié)果一致。在rs3764261位點，我們發(fā)現(xiàn)T等位基因在兩組間的分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，與Zhou L等[29]研究結(jié)果一致。目前，對于rs12149545和rs711752位點與MS的關(guān)聯(lián)性研究較少，本研究發(fā)現(xiàn)，在rs12149545和rs711752兩個位點中，與G等位基因相比，A等位基因可分別降低MS 47%和30.1%的患病風(fēng)險。對于rs708272位點，與C等位基因相比，T等位基因可能會降低MS 30.4%的患病風(fēng)險，與Anton S等[30]研究結(jié)果相近。不同的是，Jeenduang N[31]和Maroufi N F[32]認為T等位基因與MS不相關(guān)。基于以上發(fā)現(xiàn)，為了驗證這一相關(guān)性的真實性，我們在控制了年齡，性別，吸煙和飲酒等相關(guān)因素后進行了非條件logistic回歸分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這一相關(guān)性依然存在。rs3764261-GT/TT、rs12149545-AG/AA、rs711752-AA和rs708272-TT基因型可不同程度地降低MS的風(fēng)險，可能與維吾爾族人群MS相關(guān)。rs708272是CETP基因中變異頻率較高的位點之一，其研究也最為廣泛。我們研究發(fā)現(xiàn)，在rs708272位點，與CC基因型相比，TT基因型可降低MS 50.9%的患病風(fēng)險，可能是MS的一個保護因素。在埃及的一項研究表明[33]，B1B1(CC)基因型攜帶者具有更高的MS患病率，研究結(jié)果與我們一致。這同時也解釋了維吾爾族MS患病率低于同一地區(qū)其他民族的原因。在rs1800775位點中，與AA基因型相比，CC基因型攜帶者患MS的風(fēng)險增加了92.2%，可能是一個危險因素。目前，對于rs1800775位點多態(tài)性與MS的相關(guān)研究較少，但有研究表明，該位點多態(tài)性可能會增加低HDL-C血癥的發(fā)病風(fēng)險[17]。上述研究表明，CETP基因各位點多態(tài)性與MS的相關(guān)性具有種族與民族差異。

在分析了六個核苷酸與MS的關(guān)聯(lián)后，我們進一步研究了該六個位點與MS各組分的關(guān)系。對于中心性肥胖，我們發(fā)現(xiàn)rs3764261-GT基因型和rs12149545-AG基因型，可以降低其患病風(fēng)險。不同的是，Ruan X Y等[16]研究發(fā)現(xiàn)，Taq1B(rs708272)和I405 V(rs5882)多態(tài)性位點的次要等位基因與肥胖有關(guān)。對于空腹血糖升高，rs1800775-AC基因型能降低其患病風(fēng)險而rs3764261-GT基因型和rs12149545-AG基因型卻可能會增加其患病風(fēng)險。然而，在心血管病人中的一項研究表明，rs3764261位點多態(tài)性與2型糖尿病不相關(guān)[34]。對于高TG血癥，rs3764261-GT/TT、rs12149545-AG/AA和rs708272-CT/TT位點多態(tài)性可能會降低TG水平升高的風(fēng)險，但是，在另一項研究中，并沒有發(fā)現(xiàn)rs3764261位點多態(tài)性和TG水平升高有關(guān)[35]。我們還發(fā)現(xiàn)，rs5882位點之外的五個多態(tài)性位點均與低HDL-C血癥有關(guān)。這一相關(guān)性也在其他研究中得到證實[15-16,21,28,33,36-37]。不同的是，Sekar Kathiresan等[38]認為rs1800775位點C等位基因攜帶者HDL-C水平較低。Edna J L Barbosa等[39]認為與CC基因型相比，TT和CT基因型攜帶者HDL水平更高。盡管如此，我們?nèi)匀徽J為低水平的HDL-C 是MS組分中與CETP基因多態(tài)性關(guān)聯(lián)最緊密的組分。

我們采用SHEsis軟件對CETP基因的八個單體型和MS的相關(guān)性進行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組A-A-T-A-A-T和G-A-T-A-A-T單體型頻率高于病例組。因此，我們推測這兩個單體型可能是維吾爾族人群MS的保護因素，可以降低MS的患病風(fēng)險，保護人們免受MS的危害。然而，單體型的形成受許多因素的影響，我們僅僅只是在一個小的隨機樣本中研究了CETP基因多態(tài)性與MS的相關(guān)性。因此，這一復(fù)雜關(guān)系需要我們進一步地探索和驗證。

4 局限性

盡管我們進行了全面的分析，但研究中仍然存在潛在的局限性。首先，研究的樣本量較小，研究結(jié)果可能存在一定的偶然性。其次，CETP基因中存在180多個多態(tài)性位點。我們僅選擇了六個功能性位點來研究CETP基因和MS之間的關(guān)系。因此，研究結(jié)果可能存在一定的片面性。此外，我們分析了六個多態(tài)性位點與MS及其組分的相關(guān)性，但沒有研究基因和基因以及基因和環(huán)境之間的交互作用，所以需要進一步研究其交互作用。

5 結(jié)論

CETP基因rs1800775，rs3764261，rs12149545，rs711752和rs708272位點多態(tài)性與新疆維吾爾族人群MS及其各個組分均密切相關(guān)，其中低水平的HDL-C與CETP基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)最為緊密rs3764261與rs12149545以及rs711752與rs708272之間存在完全連鎖不平衡關(guān)系。A-A-T-A-A-T和G-A-T-A-A-T單體型可能是維吾爾族人群MS的保護因素。