李毓,王海霞,胡云華,張向輝,郭恒,何佳,閆貽忠,馬儒林,郭淑霞
(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系,新疆 石河子 832000)
代謝綜合征(Metabolic Syndrome,MS)是一種慢性復(fù)雜性疾病,可引起多種并發(fā)癥且危害嚴(yán)重,隨著其發(fā)病率的升高,已成為全球性的重大公共衛(wèi)生問題[1]。其臨床特征主要有:中心性肥胖,血壓、空腹血糖及甘油三酯(Triglycerides,TG)水平升高,高密度脂蛋白膽固醇(High-density Lipoprotein Cholesterol,HDL-C)水平降低[2]。目前,基于MS具有進展性,在其定義上達成一致具有一定的困難[3],而且,其組分也會隨著時間的推移而惡化。此外,世界各國MS患病率普遍較高。2003至2010年,美國MS整體患病率為33%[4]。在澳大利亞,MS的患病率為30.7%[5]。日本,男性MS的患病率為22.8%,女性為8.7%[6]。在我國一項Meta分析顯示,MS患病率為24.5%[7]。我們的前期調(diào)查結(jié)果顯示,新疆維吾爾族人群MS患病率為21.2%[8],低于顧東風(fēng)等[9]報道的中國北方地區(qū)的MS患病率(23.3%)。在新疆的另一流行病學(xué)調(diào)查[10]顯示,維吾爾族人群MS患病率為27.9%,略低于同一地區(qū)的漢族(31.3%)。然而,MS的病因目前尚不明確,可能主要由年齡、種族、遺傳因素、飲食、行為和環(huán)境等因素引起[11],并且,遺傳因素已越來越引起人們的重視。
膽固醇酯轉(zhuǎn)運蛋白(Cholesterol Ester Transfer Protein,CETP)介導(dǎo)血漿脂蛋白的交換和轉(zhuǎn)運,被認為是膽固醇逆向轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵蛋白,受到CETP基因的調(diào)控。目前,關(guān)于CETP基因的研究主要集中于與血脂異常的關(guān)系,國內(nèi)外學(xué)者對CETP基因多態(tài)性與MS各組分如高血壓、糖尿病、低HDL-C血癥等之間的相關(guān)性也已進行了深入研究[12-14]。在我們前期研究的CETP基因八個多態(tài)性位點中,rs1800775、rs3764261、rs12149545、rs711752、rs708272這五個多態(tài)性位點與維吾爾族和哈薩克族人群血脂異常有關(guān)[15],相關(guān)研究報道CETP基因中六個多態(tài)性位點rs5882[16]、rs1800775[17]、rs3764261[18]、rs12149545[19]、rs711752[20]、rs708272[21]在不同人群中與MS及其組分具有不同程度的關(guān)聯(lián)性。目前,關(guān)于CETP基因多態(tài)性與MS之間的相關(guān)性研究存在民族和地區(qū)差異[22-23],且多是單個位點多態(tài)性的研究,尚未有關(guān)于新疆維吾爾族人群CETP基因多態(tài)性與MS之間關(guān)系的報道。因此,本研究探討CETP基因六個多態(tài)性位點與維吾爾族人群MS及各組分的相關(guān)性,為新疆維吾爾族MS的遺傳易感性研究提供科學(xué)依據(jù)。
遵從成組匹配原則,經(jīng)性別匹配后,在前期現(xiàn)況調(diào)查基礎(chǔ)上[24],隨機選擇280例MS患者作為病例組,291例健康者作為正常對照組。
每位受試者均簽署知情同意書。本研究由石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理審查委員會批準(zhǔn)(IERB No. SHZ2010LL01)。所有調(diào)查員經(jīng)嚴(yán)格培訓(xùn)并考核合格,對當(dāng)?shù)鼐S吾爾族居民進行面對面詢問,詳細記錄受試者的基本信息(個人史、疾病史、家族史、飲食、飲酒、吸煙和體育鍛煉)。身高、體重、腰圍、臀圍、血壓由專業(yè)人員根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化方法進行測量[25]。生化指標(biāo)(總膽固醇(Total Cholesterol,TC)、TG、HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇(Low-density Lipoprotein Cholesterol,LDL-C)以及空腹血糖(Fasting Plasma Glucose,F(xiàn)PG))采用OLYMPUS2007全自動生化分析儀進行檢測。
采用多機構(gòu)聯(lián)合聲明(JIS)診斷標(biāo)準(zhǔn)[2],在下列符合三項或三項以上者,即可診斷為MS:(1)中心性肥胖:男性腰圍≥85 cm,女性腰圍≥80 cm;(2)TG水平升高:TG≥150 mg/dL(1.7 mmol/L);(3)HDL-C水平降低:男性<40 mg/dL(1.0 mmol/L),女性<50 mg/dL(1.30 mmol/L);(4)血壓升高:收縮壓≥130 mmHg或舒張壓≥85 mmHg;(5)FPG升高:FPG≥100 mg/dL(5.6 mmol/L)。
每個研究對象抽取空腹靜脈血200 μL,采用北京TIANGEN生化科技有限公司DNA提取試劑盒進行DNA的抽提。所得DNA經(jīng)0.7% 凝膠電泳驗證后,采用Nano-Drop分光光度計測定其純度和濃度。利用Mysequenom網(wǎng)站、AssayDesigner 3.0軟件設(shè)計各位點引物(表 1)。
提取所得DNA樣本送往上海捷瑞生物工程公司測序分析。
表1 CEPT基因位點上游及下游引物的序列Tab.1 The sequences of forward and reverse primers for genotyping of CETP gene
兩組間性別、吸煙以及飲酒比例差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。病例組平均年齡、體質(zhì)指數(shù)(Body mass index,BMI)、腰圍、臀圍、收縮壓(Systolic Blood Pressure,SBP)、舒張壓(Diastolic Blood Pressure,DBP)、FPG、TG、TC、LDL-C水平均高于對照組(P均<0.001),而HDL-C水平卻低于對照組(P<0.001)(表2)。
表2 研究對象的人口學(xué)統(tǒng)計及臨床特征Tab.2 Demographic and clinical characteristics of study subjects
rs5882位點基因型與等位基因頻率在病例組和對照組中分布比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。病例組rs3764261-T,rs708272-T、rs12149545-A以及rs711752-A的等位基因頻率均低于對照組(均P<0.05)。而rs1800775-C的等位基因頻率卻高于對照組(P=0.011)。病例組和對照組六個位點的基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡(均P>0.05)(表3)。
表3 對照組與病例組CETP基因6個SNP位點基因型及等位基因頻率分布和HardyWeinberg平衡檢驗Tab.3 Genotype and allele frequencies for the six SNPs of CETP gene between control and case group and Hardy-Weinberg equilibrium testing
注:C-R: rs5882 (A-G),rs1800775 (A-C),rs3764261 (G-T),rs12149545 (G-A),rs711752 (G-A),rs708272 (C-T);HWE(Hardy-Weinberg Equilibrium)-P:哈迪-溫伯格平衡定律P值;SNP(Single Nucleotide Polymorphisms):基因單核苷酸多態(tài)性。
以MS為因變量(0=否,1=是),分別以rs5882(AA=1,AG=2,GG=3)、rs1800775(AA=1,AC=2,CC=3)、rs3764261(GG=1,GT=2,TT=3)、rs12149545(GG=1,GA=2,AA=3)、rs711752(GG=1,GA=2,AA=3)、rs708272(CC=1,CT=2,TT=3)為自變量,控制年齡、性別(1=男性,2=女性)、吸煙(0=不吸煙,1=吸煙)和飲酒(0=不飲酒,1=飲酒)的影響后,分析各位點多態(tài)性與MS的關(guān)系(表4)。結(jié)果顯示:在rs1800775位點,CC基因型(P=0.009,OR=1.922,95%CI=1.174-3.147)患MS風(fēng)險高于AA基因型。在rs3764261位點,GT(P=0.001,OR=0.552,95%CI=0.387-0.788)和TT(P<0.001,OR=0.289,95%CI=0.145-0.573)基因型患MS風(fēng)險低于GG基因型。在rs12149545位點,AG(P<0.001,OR=0.484,95%CI=0.339-0.693)和AA(P<0.001,OR=0.277,95%CI=0.137-0.560)基因型患MS風(fēng)險低于GG基因型。在rs711752位點,AA基因型(P=0.005,OR=0.496,95%CI=0.305-0.805)患MS風(fēng)險低于GG基因型。在rs708272位點,TT(P=0.004,OR=0.491,95%CI=0.302-0.797)基因型患MS風(fēng)險低于CC基因型。
表4 CEPT基因6個SNP位點與代謝綜合征的關(guān)系Tab.4 The relationship between six SNPs of CETP gene and MS
注:對照:rs5882-AA,rs1800775-AA,rs3764261-GG,rs12149545-GG,rs711752-GG,rs708272-CC;β-回歸系數(shù),S.E-標(biāo)準(zhǔn)誤。
我們進一步研究了六個位點多態(tài)性與MS各組分之間的關(guān)系(表5)。分別以中心性肥胖(0=否,1=是)、血壓升高(0=否,1=是)、空腹血糖升高(0=否,1=是)、高TG血癥(0=否,1=是)、低HDL-C血癥(0=否,1=是)為因變量,進行單因素logistic回歸。
結(jié)果顯示:rs5882位點多態(tài)性與各組分間均沒有關(guān)聯(lián)。在rs1800775位點中,與AA基因型相比,AC(P=0.021,OR=1.480,95%CI=1.062-2.064)和CC(P<0.001,OR=2.231,95%CI=1.450-3.434)基因型低HDL-C血癥患病風(fēng)險更高,然而AC基因型(P=0.027,OR=0.543,95%CI=0.316-0.932)卻能降低血糖水平升高的風(fēng)險。在rs3764261位點中,與GG基因型相比,GT基因型會降低中心性肥胖(P=0.004,OR=0.631,95%CI=0.460-0.865)、高TG血癥(P=0.002,OR=0.596,95%CI=0.432-0.823)以及低HDL-C血癥(P=0.001,OR=0.575,95%CI=0.421-0.786)的患病風(fēng)險,卻會增加血糖水平升高的風(fēng)險(P=0.001,OR=2.509,95%CI=1.449-4.345)。在rs12149545位點中,AG和AA基因型與各組分之間的關(guān)系與rs3764261位點中GT和TT基因型相似。在rs711752位點中,與GG基因型相比,AA(P<0.001,OR=0.470,95%CI=0.310-0.713)基因型低HDL-C血癥的患病風(fēng)險更低。在rs708272位點中, CT(P=0.043,OR=0.696,95%CI=0.490-0.988)和TT(P=0.026,OR=0.616,95%CI=0.402-0.943)基因型患高TG血癥的風(fēng)險低于CC基因型,同時,CT(P=0.043,OR=0.700,95%CI=0.496-0.989)和TT基因型(P<0.001,OR=0.466,95%CI=0.307-0.707)低HDL-C血癥的患病風(fēng)險也低于CC基因型。
表5 代謝綜合征中CEPT基因6個SNP位點和5個成分的危險因素分析Tab.5 Risk factor analysis between six SNPs of CETP gene and five components in MS
注:對年齡和性別,吸煙和飲酒調(diào)整后進行分析。
經(jīng)連鎖不平衡分析,rs3764261與rs12149545(D’=1.000,r2=0.931),rs711752與rs708272(D’=1.000,r2=0.996)之間存在完全連鎖不平衡。另外我們還發(fā)現(xiàn),rs1800775和rs711752(D’=0.833,r2=0.442),rs1800775和rs708272(D’=0.833,r2=0.440),rs3764261和rs711752(D’=0.880,r2=0.387),rs3764261和rs708272(D’=0.874,r2=0.383),rs12149545和rs711752(D’=0.979,r2=0.446),rs12149545和rs708272(D’=0.972,r2=0.441)之間存在強的連鎖不平衡(表6)。
表6 CEPT基因6個SNP位點連鎖不平衡分析Tab.6 Linkage disequilibrium test for the six SNPs of CETP gene
注:右上三角為D’連鎖不平衡系數(shù);左下三角為r2相關(guān)系數(shù)。
通過SHEsis軟件六個單核苷酸多態(tài)性成功形成了18種單體型,表7中為頻率大于0.001的8個單體型。
結(jié)果(表7)顯示對照組A-A-T-A-A-T和G-A-T-A-A-T單體型頻率高于病例組(P均<0.05)。其他5個單體型的頻率分布在兩組間的差異則不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
表7 CEPT基因6個SNP位點的單體型頻率在維吾爾族對照組和病例組間的差異Tab.7 The discrepancy of haplotype frequencies of six SNPs in CETP gene between the control and case group in the Uyghur
注:整體Χ2=27.353,P<0.001(對照組與病例組中單體型頻率低于0.03未列入表格參加計算);用A-C-G-G-G-C作為參考單體型以計算比值比;單體型基因順序(從左到右):rs5882 (A/G), rs1800775 (A/C), rs3764261 (G/T), rs12149545 (G/A), rs711752 (G/A), rs708272 (C/T)。
在我國,MS患病率普遍較高,且存在民族與地區(qū)差異,其中維吾爾族MS患病率低于同一地區(qū)的漢族和哈薩克族[10, 26],這可能與維吾爾族獨特的民族特色和遺傳易感性有關(guān)。因此,我們選擇維吾爾族這一人群來研究CETP基因多態(tài)性與MS之間的關(guān)系。鑒于CETP是膽固醇逆轉(zhuǎn)運過程(RCT)中的一個關(guān)鍵交換因子,也是目前唯一已知的具有此功能的蛋白質(zhì),在脂蛋白的代謝中起非常重要的作用,已引起學(xué)者的研究重視[27]。研究發(fā)現(xiàn),CETP基因突變可能會影響血清中CETP的含量,進而影響脂質(zhì)代謝。
本研究發(fā)現(xiàn),病例組平均年齡、BMI、腰圍、臀圍、血壓、血糖、TG、TC、LDL-C水平均高于對照組,HDL-C水平低于對照組。中心性肥胖、TG升高、HDL-C水平降低、血壓升高、FPG升高等癥狀導(dǎo)致了MS的發(fā)生,而HDL-C水平降低通常伴隨著TC和LDL-C水平的升高。兩組間的性別分布匹配,各位點均符合Hardy-Weinberg平衡,提示本研究樣本具有一定代表性。
研究發(fā)現(xiàn),rs5882基因型與等位基因頻率分布在兩組間均沒有統(tǒng)計學(xué)差異。可能是由于樣本含量太小引起,因此我們會通過后期擴大樣本進行更加深入的研究。其他五個位點的基因型與等位基因頻率分布在兩組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。在rs1800775位點中,與A等位基因攜帶者相比,C等位基因攜帶者MS的患病風(fēng)險增加了35.6%,與Radovica I等[28]研究結(jié)果一致。在rs3764261位點,我們發(fā)現(xiàn)T等位基因在兩組間的分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,與Zhou L等[29]研究結(jié)果一致。目前,對于rs12149545和rs711752位點與MS的關(guān)聯(lián)性研究較少,本研究發(fā)現(xiàn),在rs12149545和rs711752兩個位點中,與G等位基因相比,A等位基因可分別降低MS 47%和30.1%的患病風(fēng)險。對于rs708272位點,與C等位基因相比,T等位基因可能會降低MS 30.4%的患病風(fēng)險,與Anton S等[30]研究結(jié)果相近。不同的是,Jeenduang N[31]和Maroufi N F[32]認為T等位基因與MS不相關(guān)。基于以上發(fā)現(xiàn),為了驗證這一相關(guān)性的真實性,我們在控制了年齡,性別,吸煙和飲酒等相關(guān)因素后進行了非條件logistic回歸分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),這一相關(guān)性依然存在。rs3764261-GT/TT、rs12149545-AG/AA、rs711752-AA和rs708272-TT基因型可不同程度地降低MS的風(fēng)險,可能與維吾爾族人群MS相關(guān)。rs708272是CETP基因中變異頻率較高的位點之一,其研究也最為廣泛。我們研究發(fā)現(xiàn),在rs708272位點,與CC基因型相比,TT基因型可降低MS 50.9%的患病風(fēng)險,可能是MS的一個保護因素。在埃及的一項研究表明[33],B1B1(CC)基因型攜帶者具有更高的MS患病率,研究結(jié)果與我們一致。這同時也解釋了維吾爾族MS患病率低于同一地區(qū)其他民族的原因。在rs1800775位點中,與AA基因型相比,CC基因型攜帶者患MS的風(fēng)險增加了92.2%,可能是一個危險因素。目前,對于rs1800775位點多態(tài)性與MS的相關(guān)研究較少,但有研究表明,該位點多態(tài)性可能會增加低HDL-C血癥的發(fā)病風(fēng)險[17]。上述研究表明,CETP基因各位點多態(tài)性與MS的相關(guān)性具有種族與民族差異。
在分析了六個核苷酸與MS的關(guān)聯(lián)后,我們進一步研究了該六個位點與MS各組分的關(guān)系。對于中心性肥胖,我們發(fā)現(xiàn)rs3764261-GT基因型和rs12149545-AG基因型,可以降低其患病風(fēng)險。不同的是,Ruan X Y等[16]研究發(fā)現(xiàn),Taq1B(rs708272)和I405 V(rs5882)多態(tài)性位點的次要等位基因與肥胖有關(guān)。對于空腹血糖升高,rs1800775-AC基因型能降低其患病風(fēng)險而rs3764261-GT基因型和rs12149545-AG基因型卻可能會增加其患病風(fēng)險。然而,在心血管病人中的一項研究表明,rs3764261位點多態(tài)性與2型糖尿病不相關(guān)[34]。對于高TG血癥,rs3764261-GT/TT、rs12149545-AG/AA和rs708272-CT/TT位點多態(tài)性可能會降低TG水平升高的風(fēng)險,但是,在另一項研究中,并沒有發(fā)現(xiàn)rs3764261位點多態(tài)性和TG水平升高有關(guān)[35]。我們還發(fā)現(xiàn),rs5882位點之外的五個多態(tài)性位點均與低HDL-C血癥有關(guān)。這一相關(guān)性也在其他研究中得到證實[15-16,21,28,33,36-37]。不同的是,Sekar Kathiresan等[38]認為rs1800775位點C等位基因攜帶者HDL-C水平較低。Edna J L Barbosa等[39]認為與CC基因型相比,TT和CT基因型攜帶者HDL水平更高。盡管如此,我們?nèi)匀徽J為低水平的HDL-C 是MS組分中與CETP基因多態(tài)性關(guān)聯(lián)最緊密的組分。
我們采用SHEsis軟件對CETP基因的八個單體型和MS的相關(guān)性進行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),對照組A-A-T-A-A-T和G-A-T-A-A-T單體型頻率高于病例組。因此,我們推測這兩個單體型可能是維吾爾族人群MS的保護因素,可以降低MS的患病風(fēng)險,保護人們免受MS的危害。然而,單體型的形成受許多因素的影響,我們僅僅只是在一個小的隨機樣本中研究了CETP基因多態(tài)性與MS的相關(guān)性。因此,這一復(fù)雜關(guān)系需要我們進一步地探索和驗證。
盡管我們進行了全面的分析,但研究中仍然存在潛在的局限性。首先,研究的樣本量較小,研究結(jié)果可能存在一定的偶然性。其次,CETP基因中存在180多個多態(tài)性位點。我們僅選擇了六個功能性位點來研究CETP基因和MS之間的關(guān)系。因此,研究結(jié)果可能存在一定的片面性。此外,我們分析了六個多態(tài)性位點與MS及其組分的相關(guān)性,但沒有研究基因和基因以及基因和環(huán)境之間的交互作用,所以需要進一步研究其交互作用。
CETP基因rs1800775,rs3764261,rs12149545,rs711752和rs708272位點多態(tài)性與新疆維吾爾族人群MS及其各個組分均密切相關(guān),其中低水平的HDL-C與CETP基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)最為緊密rs3764261與rs12149545以及rs711752與rs708272之間存在完全連鎖不平衡關(guān)系。A-A-T-A-A-T和G-A-T-A-A-T單體型可能是維吾爾族人群MS的保護因素。