雞源大腸桿菌中QRDR基因的檢測(cè)

馮濤 何紀(jì)元 薛原

摘要 為分析雞源大腸桿菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥機(jī)制，使用PCR技術(shù)從對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物具有耐藥性的大腸桿菌中擴(kuò)增出喹諾酮耐藥決定區(qū)（QRDR）基因。通過(guò)對(duì)所測(cè)序列結(jié)果的分析，得到DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ基因（gyrA、gyrB、parC、parE）的突變位點(diǎn)及其氨基酸的表達(dá)情況。根據(jù)基因型研究QRDR的流行病學(xué)情況，可指導(dǎo)喹諾酮類(lèi)藥物的臨床合理用藥。

關(guān)鍵詞 大腸桿菌;gyrA基因;gyrB基因;parC基因;parE基因

中圖分類(lèi)號(hào) S852.61文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）11-0106-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.11.029

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract In order to analyze the drugs resistance mechanism of fluoroquinolone to Escherichia coli from chicken，PCR technology was used to amplify determining area （QRDR）? gene in E.coli with drugs resistance of E.coli. According to sequencing results of obtained sequences， the mutation sites and amino acid expression of DNA gyrase and topoisomerase Ⅳ genes （gyrA，gyrB，parC，parE） were determined.? The study on the? epidemic situation of QRDR according to the genotype could guide the rational drug use in the clinic .

Key words Escherichia coli;gyrA gene;gyrB gene;parC gene;parE gene

基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31502119）;黑龍江省博士后科研啟動(dòng)金資助項(xiàng)目（LBH-Q14002）。

作者簡(jiǎn)介 馮濤（1996—），女，河北承德人，碩士研究生，研究方向：細(xì)菌耐藥性研究。*通信作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事細(xì)菌耐藥性研究。

收稿日期 2018-12-24

喹諾酮類(lèi)藥物在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用有近 30 年的歷史，是一類(lèi)作用強(qiáng)、抗菌譜廣的化學(xué)合成抗菌藥[1]。但這類(lèi)藥物的使用頻率日益深化，大腸桿菌對(duì)這類(lèi)藥物的影響程度越來(lái)越高[2]。被gyrA和gyrB 基因編碼的DNA 促旋酶和被parC 和parE基因編碼的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ是喹諾酮類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥機(jī)制的主要作用區(qū)域[3]。在大腸桿菌中，gyrA 基因所表達(dá)的第67～106位氨基酸在報(bào)道中經(jīng)常有突變的情況產(chǎn)生，而這種突變會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物耐藥或者使該菌株敏感性降低，即為喹諾酮的耐藥決定區(qū)[4]。

筆者采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）分離的大腸桿菌進(jìn)行了喹諾酮類(lèi)耐藥基因突變的檢測(cè)，了解東北地區(qū)雞源大腸桿菌對(duì)喹諾酮類(lèi)抗生素的耐藥情況，以期為指導(dǎo)該類(lèi)抗菌藥物的臨床合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。大腸桿菌質(zhì)控菌株ATCC25922由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，試驗(yàn)菌株為采自東北三省不同地區(qū)的多個(gè)雞源養(yǎng)殖場(chǎng)413株大腸桿菌。

1.1.2 主要儀器和試劑。DNA 片段凝膠回收和質(zhì)粒小量提取試劑盒（愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限責(zé)任公司）;DL2000 DNA Marker和Taq酶購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;DYY-6型電泳儀（北京市六一儀器廠）;凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Alpha Imager2200公司）;YEAR2000 PCR儀（德國(guó)Biometra公司）。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增。參考文獻(xiàn)[5-7]得到相應(yīng)的引物序列，將序列送至哈爾濱博士生物有限公司合成QRDR基因的引物序列，利用合成的引物序列對(duì)413株大腸桿菌樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)所擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳驗(yàn)證。

1.2.2 目的片段測(cè)序分析。以QRDR基因4種不同引物擴(kuò)增所得的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增樣本用膠回收純化后與18-T載體連接，并轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α中克隆復(fù)制，將質(zhì)粒樣本送至哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司測(cè)序部進(jìn)行序列測(cè)定。將返回的核苷酸序列利用DNAStar軟件分析，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，得出其序列的突變位點(diǎn)和特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 gyrA、gyrB、parC、parE基因的檢測(cè)結(jié)果

在413株雞源大腸桿菌中，gyrA基因被檢出呈陽(yáng)性的有107株，陽(yáng)性率為25.91%;gyrB基因的陽(yáng)性菌株有219株，檢出率為5303%;parC基因被檢出呈陽(yáng)性的菌株有201株，parE基因被檢出呈陽(yáng)性的菌株有263株，陽(yáng)性率分別為48.67% 和6368%（圖1～4）。

2.2 gyrA、gyrB、parC、parE基因的氨基酸序列分析結(jié)果

菌株的gyrA基因存在堿基發(fā)生突變的現(xiàn)象，導(dǎo)致gyrA基因所表達(dá)的氨基酸發(fā)生取代現(xiàn)象。主要包括

Leu55→Pro、Ser83→Leu、Asp87→Gly、Phe109→Leu和Ala136→Val，其中18K、26K、d31 3株有雙位點(diǎn)氨基酸取代的情況出現(xiàn)。15個(gè)菌株中有7個(gè)菌株都發(fā)生Ser83→Leu突變，d31菌株表達(dá)為83位和87位的熱點(diǎn)突變同時(shí)出現(xiàn)。菌株f14和f53 gyrB基因的堿基有突變發(fā)生，主要表現(xiàn)為Pro404→Ser、Leu451→Pro和Cys410→Tyr。耐藥菌株S44、S49、S67、S82、22K、29K的parC基因堿基發(fā)生突變?nèi)鏢er58→Ile、Gln62→Lys、Val122→Ala、Thr147→Ala和Val284→Met，這些氨基酸的改變也會(huì)使大腸桿菌降低其對(duì)藥物的敏感性。 菌株16R發(fā)生Gln363→Arg突變，導(dǎo)致parE亞基發(fā)生氨基酸取代。

3 討論

近年來(lái)，人類(lèi)和動(dòng)物分離的大腸桿菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物耐藥的菌株迅速增多[2]。構(gòu)成DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的氨基酸發(fā)生突變，影響了這2種酶的表達(dá)，導(dǎo)致大腸桿菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的結(jié)合能力發(fā)生了變化，從而導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生[3]。國(guó)內(nèi)外研究表明，喹諾酮類(lèi)藥物的高水平耐藥已經(jīng)成為一個(gè)日益嚴(yán)重的問(wèn)題[3]。該研究結(jié)果表明，多個(gè)基因突變位點(diǎn)在菌株中同時(shí)存在，高水平耐藥也是由于多個(gè)位點(diǎn)的同時(shí)突變所產(chǎn)生的，這與劉曉強(qiáng)[8]的研究結(jié)果相似。該試驗(yàn)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并且對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，得到部分基因突變，從而使其表達(dá)的氨基酸發(fā)生突變。該試驗(yàn)對(duì)4種喹諾酮類(lèi)藥物進(jìn)行耐藥性研究，發(fā)現(xiàn)雞源大腸桿菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥性均偏高，說(shuō)明這些突變的產(chǎn)生提高了細(xì)菌的耐藥水平。

該研究中雞源大腸桿菌的gyrA基因檢測(cè)出Ser83→Leu、Asp87→Gly;gyrB基因發(fā)生Pro404→Ser、Cys410→Tyr、Leu451→Pro突變;parC基因發(fā)生Ser58→Ile、Gln62→Lys、Val122→Ala、Thr147→Ala和Val284→Met突變;parE基因發(fā)生Gln363→Arg突變。據(jù)報(bào)道[1-7]，gyrA基因表達(dá)的氨基酸易發(fā)生突變的最普遍位點(diǎn)為第81～87位，表現(xiàn)為發(fā)生一個(gè)或者幾個(gè)氨基酸被另一種取代，而大腸桿菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物表現(xiàn)出高度耐藥，其主要原因就有第83位的絲氨酸經(jīng)常被亮氨酸所取代。gyrB基因編碼的氨基酸的突變則主要表現(xiàn)在第 426 和第 447 位上，其中第426位突變?？沙尸F(xiàn)為大腸桿菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物均可以有耐藥情況產(chǎn)生，而第447位突變表現(xiàn)為對(duì)萘啶酸的耐藥性較為增強(qiáng)[1]。在近幾年分離的大腸桿菌耐藥菌株中，gyrA基因熱點(diǎn)突變的概率會(huì)比gyrB基因突變的概率大得多[9]。目前研究表明，parC和parE基因發(fā)生不同位點(diǎn)的突變，會(huì)使細(xì)菌的耐藥水平顯著提高。但是，只有當(dāng)表達(dá)促旋酶的基因發(fā)生的位點(diǎn)突變會(huì)產(chǎn)生對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物耐藥時(shí)，才會(huì)有parC和parE的位點(diǎn)突變產(chǎn)生。以上突變結(jié)果中，gyrA的熱點(diǎn)突變Ser83→Leu和Asp87→Gly與任艷娜等[1]的研究結(jié)果相一致。

另外，非特異性耐藥機(jī)制在較復(fù)雜的多重耐藥中同樣具有十分重要的作用，不僅對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥有影響，而且對(duì)其他不同種類(lèi)的抗生素均會(huì)產(chǎn)生耐藥的情況，但這種耐藥機(jī)制是否會(huì)對(duì)大腸桿菌和喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥水平有影響還需要進(jìn)一步研究。喹諾酮藥物是一種經(jīng)過(guò)人工設(shè)計(jì)合成的化學(xué)抗生素，若要防止其耐藥性的傳播范圍和頻率以及耐藥水平的不斷增強(qiáng)，可以?xún)?yōu)先考慮人為改變其藥物結(jié)構(gòu)，從而減少DNA 促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的基因突變對(duì)耐藥性的影響。

參考文獻(xiàn)

[1] 任艷娜，甄盼盼，李健，等.喹諾酮類(lèi)耐藥決定區(qū)、外排泵負(fù)調(diào)控基因?qū)Υ竽c桿菌氟喹諾酮高水平耐藥分子機(jī)制的影響[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2012，39（10）：11-16.

[2] MARCAD G，DESCHAMPS C，BOYD A，et al.Replicon typing of plasmids in Escherichia coli producing extendedspectrum βactamases[J].J Antimicrob Chemother，2009，63（1）：67-71.

[3]孟春萍，陳燕杰，吳華，等.鴨源大腸桿菌對(duì)氟喹諾酮類(lèi)耐藥機(jī)制的研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，24（1）：128-130.

[4] UCHIDA Y，MOCHIMARU T，MOROKUMA Y，et al.Geographic distribution of fluoroquinoloneresistant Escherichia coli strains in Asia[J].Int J Antimicrob Agents，2010，35（4）：387-391.

[5] BETITRA Y，TERESA V，MIGUEL V，et al.Determinants of quinolone resistance in Escherichia coli causing communityacquired urinary tract infection in Bejaia，Algeria[J].Asian Pacific journal of tropical medicine，2014，7（6）：462-467.

[6] BANSAL S，TANDON V.Contribution of mutations in DNA gyrase and topoisomerase IV genes to ciprofloxacin resistance in Escherichia coli clinical isolates[J].International journal of antimicrobial agents，2011，37（3）：253-255.

[7] HABEEB M A，HAQUE A，IVERSEN A，et al.Occurrence of virulence genes，16S rRNA methylases，and plasmidmediated quinolone resistance genes in CTXMproducing Escherichia coli from Pakistan[J].European journal of clinical microbiology & infectious diseases，2014，33（3）：399-409.

[8] 劉曉強(qiáng).寵物源大腸桿菌對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物的多藥耐藥機(jī)制研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2012.

[9] FRIEDMAN S M，LU T，DRLICA K.Mutation in the DNA gyrase A gene of Escherichia coli that expands the quinolone resistancedetermining region [J].Antimicrob Agents Chemother，2001，45（8）：2378-2380.

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，J.Anhui Agric.Sci. 2019，47（11）：108-110