大田軟海綿酸類毒素的毒理學(xué)研究進(jìn)展

胡楊楊，陳 思，張小軍，嚴(yán)忠雍

（1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021）

大田軟海綿酸（Okadaic acid，OA）及其衍生物鰭藻毒素（Dinophysistoxins，DTXs）（結(jié)構(gòu)式如圖 1 所示） 是一類親脂性聚醚類化合物，主要由有毒赤潮藻類鰭藻屬和原甲藻屬的部分藻類產(chǎn)生[1]。因其底棲性和非選擇性濾食特性，貝類極易累積OA和DTXs毒素，導(dǎo)致貝類食用者中毒，出現(xiàn)腹瀉（92%）、惡心（80%）、嘔吐（79%）、腹痛（53%）、發(fā)冷（10%）等癥狀[2-5]。OA 和DTXs毒素是腹瀉性貝毒（Diarrhetic shellfish poisons，DSP）中分布最廣、危害最大的一類組分。除能引起腹瀉外，OA和DTXs毒素還能損傷腸黏膜，是腫瘤促進(jìn)因子，具有遺傳毒性[6-8]。歐盟對(duì)貝類組織中腹瀉性貝毒的安全限量為160 μg OA eq/kg，我國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)則規(guī)定任何腹瀉性貝毒含量不得大于160 μg OA eq/kg 樣品[9]。

圖1 大田軟海綿酸、鰭藻毒素結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of OA and DTXs

OA類毒素除具有腹瀉、嘔吐等急性毒性，許多研究[32,36-38,50]已證實(shí)該毒素還具有潛在的慢性毒性，包括損傷DNA、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、損害神經(jīng)及免疫功能、影響胚胎發(fā)育等。結(jié)合近年來OA類毒素的毒理學(xué)研究，本文總結(jié)了其在致毒機(jī)制、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞毒性、遺傳毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性等方面的進(jìn)展，以期全面概括此類毒素的毒性作用，同時(shí)對(duì)未來OA類毒素的毒理研究進(jìn)行了展望。

1 致毒機(jī)理

蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的最基本的生理機(jī)制，該過程主要通過絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶（serine/threonine protein phosphatases，ser/thrPPs；如 PP1、2a、3、4、5）、酪氨酸蛋白磷酸酶（protein tyrosine phosphatases，PTPs；如 PTP MEG1、MEG2、1B 等）及雙功能蛋白磷酸酶（TMDP、VHR、DUSP22等）調(diào)控完成[10-12]。研究顯示，OA類毒素可作為PP1、PP2A和PP5的烈性抑制劑導(dǎo)致蛋白質(zhì)過磷酸化，從而對(duì)生物的多種生理功能造成影響[13]。從結(jié)構(gòu)上看，OA及DTXs通過其羧酸端C3-C12和尾部C30-C38的螺縮酮與PPs結(jié)合產(chǎn)生抑制作用，其中羧基端C3-C12為主要活性位點(diǎn)，通過改變?cè)擃惗舅谻1和C2的結(jié)構(gòu)，可有效降低其對(duì)PPs的抑制力[14-15]。

蛋白磷酸酶抑制試驗(yàn)顯示，OA和DTXs對(duì)PP2a、PP5、PP1的作用趨勢(shì)相同，對(duì)三種磷酸酶的抑制力均依序遞減。此外，TWINER et al[16]比較了該類毒素對(duì)PP2a和PP5的抑制作用，發(fā)現(xiàn)其活性差異均表現(xiàn)為：天然DTX1＞天然OA＞天然DTX2≈合成DTX2合成2-epi-DTX2，各分析物對(duì)PP2a的半數(shù)抑制量濃度（IC50）分別為 0.31、0.47、0.99、1.35、137 nM；對(duì) PP5 的 IC50 分別為 1.3、2.3、5.2、4.0、541 nM。而對(duì) PP1 的抑制作用表現(xiàn)為：天然OA＞天然DTX1＞天然DTX2≈合成DTX2＞合成2-epi-DTX2，各分析物對(duì)PP1的IC50分別為25.2、34.8、76.4、82.6、3 110 nM。NMR分析顯示，DTX2的C35位甲基為縱向結(jié)構(gòu)，不利于與PPs活性位點(diǎn)的結(jié)合，導(dǎo)致其抑制力的減弱[17]。可見，OA類毒素非活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)差異仍然會(huì)影響磷酸酶活性，從而產(chǎn)生不同的毒性作用。

2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究

目前關(guān)于OA類毒素的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究較少，報(bào)道中多采用小鼠為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)中OA類毒素的暴露方式主要有口服、腹腔注射、灌胃等，以上途徑對(duì)動(dòng)物的肝臟、小腸、胃等造成不同程度的損害[18-20]。OA類毒素的急性損傷作用不僅與劑量成線性相關(guān)性，還取決于暴露方式和動(dòng)物種類。經(jīng)腹腔注射后的小鼠，僅15 min就可觀察到其腸上皮細(xì)胞的變化，而等劑量靜脈注射后該細(xì)胞雖然變化類似，但程度不明顯[21]。假如口服染毒，則需延長暴露時(shí)間或加大劑量才可對(duì)動(dòng)物內(nèi)臟造成相同的損失或致死率[22]。動(dòng)物灌胃OA類毒素后，可觀察到一定的肝損傷，并引起腸損傷、腹瀉、甚至死亡；而靜脈注射則對(duì)其腸功能幾乎不造成任何影響，但導(dǎo)致肝膽管肌動(dòng)蛋白鞘迅速溶解、肝臟充血、血壓過低，高劑量下死亡[23]。

比較不同暴露方式的急性毒性發(fā)現(xiàn)，口服產(chǎn)生同等癥狀的所需劑量是腹腔注射的2～10倍。腹腔注射暴露方式下，據(jù)AUNE,et al[24]報(bào)道OA和DTX2對(duì)小鼠的半致死劑量（LD50）分別為204和352 μg·kg-1，YASUMOTO[25]報(bào)道 DTX1 和 DTX3 的 LD50分別為 160 和 200～500 μg·kg-1，TUBARO,et al報(bào)道 OA 對(duì)小鼠的LD50為225 μg·kg-1[26]。口服暴露方式下，ITO和LE HEGARAT,et al報(bào)道OA對(duì)小鼠的LD50分別為400和600 μg·kg-1[27]，而據(jù)TUBARO[26]報(bào)道OA對(duì)小鼠的LD50則在1 000～2 000 μg·kg-1（1 000 μg·kg-1劑量下，0/5 死亡；2 000 μg·kg-1劑量下，4/5 死亡）。

3 慢性毒性作用

3.1 細(xì)胞毒性

OA類毒素能對(duì)多種人體細(xì)胞（腸道細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞等）的生長產(chǎn)生抑制作用[28-29]，此外還能誘變特定基因的表達(dá)、天冬半胱氨酸水解酶類的激活、線粒體膜電位的降低、細(xì)胞色素c向胞質(zhì)的釋放、細(xì)胞骨架的破壞等[30-33]，以上多種機(jī)制共同作用往往可導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡[34]。OA類毒素對(duì)細(xì)胞的毒性作用首先體現(xiàn)在對(duì)不同細(xì)胞骨架的破壞，如細(xì)胞變圓、胞間連接的疏松、微管分解等[35-36]。AO,et al[37]采用微陣列技術(shù)和熒光染色技術(shù)分析了OA（7.8 ng·mL-1）作用下的小鼠胚成纖維細(xì)胞Balb/c 3T3，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞增殖、分裂的基因在毒性作用的早期或中期就已顯著下調(diào)。FIEBER,et al[38]報(bào)道人肝臟瘤細(xì)胞Caco-2暴露在低濃度（51 nM）的OA導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，而高濃度OA（200 nM）作用則導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。陳洋等[39]發(fā)現(xiàn)10～100 nM濃度的OA就足以對(duì)人肝細(xì)胞HL-7702和肝癌細(xì)胞Bel-7402的增殖產(chǎn)生抑制作用，而這種抑制作用與OA的濃度線性相關(guān)。SOLINO,et al[40]系統(tǒng)研究了OA和DTXs對(duì)小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞Neuro-2a、神經(jīng)瘤細(xì)胞融合細(xì)胞NG 108-15、人乳腺癌細(xì)胞MCF-17的毒性作用，發(fā)現(xiàn)10 nM的毒素水平就可對(duì)Neuro-2a和NG 108-15的生長產(chǎn)生抑制，而80～90 nM的毒素水平才可抑制MCF-17的生長。DTX1、DTX2和OA對(duì)Neuro-2a的IC50分別為5.46、21.44和11.2 nM，該趨勢(shì)與OA類毒素對(duì)PPs的抑制作用強(qiáng)弱趨勢(shì)相一致。

3.2 遺傳毒性

OA類毒素是一種遺傳毒性因子，生物體中毒過程中DNA會(huì)發(fā)生以下?lián)p傷：染色體畸變形成微核、DNA鏈斷裂或氧化、姐妹染色單體的錯(cuò)配、形成8-羥基脫氧鳥嘌呤、小衛(wèi)星DNA突變等[41-43]。目前對(duì)OA類毒素的遺傳毒性機(jī)制仍然存在爭議，一些學(xué)者認(rèn)為該類毒素本身可直接導(dǎo)致DNA的突變。CARVALHO和LE HEGARAT[44-45]利用胞質(zhì)阻斷微核試驗(yàn)和熒光原位雜交技術(shù)研究了OA對(duì)人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2、上皮貼壁型細(xì)胞 CHO-K1、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、白細(xì)胞和淋巴母細(xì)胞等的毒性作用，發(fā)現(xiàn)OA可引起了細(xì)胞整個(gè)染色體的丟失，證明該毒素的致染色體畸變而非致染色體斷裂作用。OA不僅能對(duì)遺傳物質(zhì)造成直接損傷，還會(huì)影響已被其他基因毒性物質(zhì)損傷的DNA的修復(fù)過程。DNA修復(fù)是遺傳物質(zhì)維持自身功能完整性的最重要的一個(gè)過程，基因毒性物質(zhì)的攝入會(huì)明顯改變DNA修復(fù)，從而導(dǎo)致DNA畸形和其他臨床癥狀的出現(xiàn)[46]。VALDIGLESIAS,et al[47-48]運(yùn)用活細(xì)胞染色法和熒光標(biāo)記法比較OA對(duì)人肝細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、和T淋巴細(xì)胞的影響，觀察發(fā)現(xiàn)OA均能降低三種細(xì)胞的DNA自修復(fù)能力，其中人肝細(xì)胞又最為敏感。

3.3 神經(jīng)毒性

盡管OA類毒素不屬于神經(jīng)毒素，但越來越多的研究顯示該毒素對(duì)神經(jīng)元和神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用。OA類毒素對(duì)神經(jīng)元的毒害作用主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡、蛋白過磷酸化表達(dá)、形態(tài)學(xué)變化等，神經(jīng)元細(xì)胞骨架形態(tài)及其功能在細(xì)胞完成特定信號(hào)傳導(dǎo)和生理功能方面發(fā)揮著重要作用，多項(xiàng)研究顯示神經(jīng)元骨架與突觸傳導(dǎo)、遞質(zhì)釋放的密切關(guān)系[49-51]。OA能改變神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能，并導(dǎo)致與細(xì)胞骨架編碼、神經(jīng)遞質(zhì)釋放有關(guān)的基因的改變。KAMAT,et al[52]利用甲酚紫染色法觀察到了OA對(duì)大鼠海馬體和大腦皮層神經(jīng)元的致死作用，200 ng OA就能明顯降低海馬體和大腦皮層細(xì)胞對(duì)乙酰膽堿的分泌能力，從而干擾正常的神經(jīng)傳導(dǎo)活動(dòng)。ARIAS,et al[53]在大鼠海馬體注射300 ng OA后觀察到了明顯神經(jīng)元功能性退化，且這一功能性損傷與OA的量呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。

Tau蛋白與微管的穩(wěn)定性、長期學(xué)習(xí)和記憶能力的保持有關(guān)，該蛋白質(zhì)的過磷酸化表達(dá)是誘發(fā)阿爾茨海默?。ɡ夏晷园V呆）的病理機(jī)制之一[54]。研究發(fā)現(xiàn)，OA作用可導(dǎo)致小鼠神經(jīng)細(xì)胞、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞、大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞中Tau蛋白的磷酸化表達(dá)[55]。因此，目前已有研究利用OA進(jìn)行潛在藥物的篩選，來預(yù)防和治療阿爾茨海默病及其他癡呆病[56]。

3.4 免疫毒性

免疫系統(tǒng)在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)具有重要的防護(hù)作用，是機(jī)體不能缺少的屏障，它是OA類毒素的重要靶標(biāo)之一[57]。體外實(shí)驗(yàn)表明，血液中5nM的OA足以致使小鼠T淋巴細(xì)胞及其受體的功能下調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致小鼠免疫功能的降低[58]。FRANCHINIA,et al[59]觀察了小鼠口服不同濃度OA后免疫器官的變化，發(fā)現(xiàn)17.8 ug·kg-1濃度的OA可以引起顯著的免疫毒性，包括胸腺形態(tài)功能的改變和萎縮、淋巴系統(tǒng)的衰竭等。KAMAT,et al在觀察OA對(duì)小鼠的神經(jīng)毒性作用時(shí)同時(shí)發(fā)現(xiàn)經(jīng)側(cè)腦室注射OA后大鼠會(huì)出現(xiàn)記憶缺失，其海馬和皮質(zhì)區(qū)內(nèi)的促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）含量增高，證明神經(jīng)炎癥的發(fā)生。目前關(guān)于OA類毒素的免疫毒性及其作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究，以明確其對(duì)人體免疫系統(tǒng)的潛在影響。

4 研究存在的問題和展望

OA類毒素是一種常見的海洋生物毒素，攝食受其污染的海產(chǎn)品極易引起急性中毒癥狀如腹瀉、惡心、嘔吐等。該毒素能選擇性抑制蛋白磷酸酶的活性，已有學(xué)者利用這一特性開展細(xì)胞通路的相關(guān)研究。近年來關(guān)于OA類毒素毒理學(xué)的研究日趨成熟和完善，通過深入研究該類毒素的細(xì)胞毒性、遺傳毒性、神經(jīng)毒性和免疫毒性，已證明其不僅是急性腹瀉因子，其在細(xì)胞、分子和基因水平上也危害極大。

目前歐盟和一些地區(qū)對(duì)該類毒素的安全限量僅著眼于減少因誤食含毒貝類而造成的胃腸道不適癥狀，這意味著消費(fèi)者可能長期攝入含低濃度腹瀉性貝毒的貝殼產(chǎn)品，必須對(duì)該類毒素的安全限量標(biāo)準(zhǔn)重新評(píng)估以提供更好的攝食指南。此外，尚未出現(xiàn)關(guān)于人體對(duì)OA類毒素的吸收、代謝或排泄的毒理學(xué)數(shù)據(jù)，或該類毒素對(duì)人體的慢性或亞慢性作用的報(bào)道，但體內(nèi)和體外研究已揭示了該類毒素的慢性暴露與生物體消化系統(tǒng)癌癥之間的相關(guān)性。