綠側(cè)花?？央膶?duì)CCl4引起的小鼠急性肝損傷模型的影響

王予菲，唐云平，李小娟，劉成娟，陳亞南，杲亞許，楊最素，丁國(guó)芳,2

（1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術(shù)研究中心，浙江舟山 316022；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021）

?？麑儆谇荒c動(dòng)物門Coelen-terata、珊瑚蟲綱Anthoroa、六放珊瑚亞綱Hexacorallia，有6科、37種，目前已報(bào)道的超過1 000種?，F(xiàn)代藥理學(xué)方法研究表明，?？哂袕V泛的生物學(xué)活性[1]，其中已鑒定出約250種化合物（肽、蛋白質(zhì)、酶和蛋白酶抑制劑）和非蛋白質(zhì)物質(zhì)（嘌呤、季銨化合物、生物胺和甜菜堿），包括抗菌[2]、抗癌[3]、抗心血管疾病[4]等多種藥理活性。?？舅匕∟a+和K+通道毒素、酸性離子通道毒素、細(xì)胞溶解素、Kunitz型蛋白酶抑制劑和抑制磷脂酶A2活性的毒素[5]。經(jīng)過藥理活性研究，這些?？舅囟嗑哂休^強(qiáng)的神經(jīng)和心臟作用，具有強(qiáng)心的藥理作用。進(jìn)一步研究表明，K+通道毒素APETx4與癌癥相關(guān)[6]，并發(fā)現(xiàn)?？舅豄+阻滯劑類似物ShK治療自身免疫性疾病的作用[7]。

近幾年，對(duì)于?？崛』钚噪念惖难芯恳灿休^大進(jìn)展。如張亞茹等[8]從舟山黃?？崛×司哂锌狗伟┗钚缘奈镔|(zhì)。LOGASHINA,et al[9]發(fā)現(xiàn)具有鎮(zhèn)痛作用的?？摹＞G側(cè)花?？鸄nthopleura anjunae廣泛分布于我國(guó)東海部分海域，每平方米綠側(cè)花?？臄?shù)量可達(dá)數(shù)百個(gè)。由于其生命力強(qiáng)，生長(zhǎng)迅速，常對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖造成一定的危害。到目前為止，開發(fā)利用綠側(cè)花?？钚噪牡难芯坎⒉欢?。吳宗澤等[10]已對(duì)綠側(cè)花?？拿附夤に囎鲈敿?xì)研究，并證明由5個(gè)氨基酸組成的寡肽Tyr-Val-Pro-Gly-Pro（AAP-H）具有較好的抗氧化活性和抑制前列腺癌細(xì)胞DU-145活性。LI Xiaojuan,et al[11]研究發(fā)現(xiàn)AAP-H可通過PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制前列腺癌細(xì)胞DU-145的增殖活性。鑒于其具有較好的抗氧化活性，本研究擬考察AAP-H對(duì)急性肝損傷的保護(hù)作用。

肝臟是身體內(nèi)以代謝功能為主的一個(gè)器官，并在身體里面起著去氧化、儲(chǔ)存肝糖、分泌性蛋白質(zhì)的合成等作用。目前對(duì)于肝細(xì)胞的損傷模型主要包括免疫性、藥物性、化學(xué)性等模型，對(duì)于化學(xué)性肝損傷研究的動(dòng)物模型主要包括采用D-半乳糖胺鹽酸鹽、四氯化碳（CCl4）、硫代乙酰胺等[12]。有研究從文蛤、長(zhǎng)鰭金槍魚等海洋生物中提取多肽，研究其對(duì)化學(xué)性肝細(xì)胞損傷的修復(fù)作用[13-14]。CCl4已成為經(jīng)典的復(fù)制肝損傷動(dòng)物模型的化學(xué)物質(zhì)[15]，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物肝損傷模型當(dāng)中。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)AAP-H進(jìn)行了小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，給藥造模后檢測(cè)小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶和肝組織勻漿生化指標(biāo)的變化，并觀察小鼠肝組織的病理學(xué)的變化，從而證明APP-H對(duì)小鼠肝損傷具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

動(dòng)物用SPF級(jí)雄性ICR小鼠48只，體重20±2 g，購(gòu)于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2014-0001。在恒溫（21～23）℃、恒濕（45%～65%）、各 12 h明暗周期的飼養(yǎng)室，自由進(jìn)食和飲水。

1.1.2 試劑

綠側(cè)花?？央腁AP-H由無錫邁默拓普生物科技有限公司合成（純度＞98%）。四氯化碳（分析純）購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)時(shí)，用橄欖油配成體積分?jǐn)?shù)為1%的四氯化碳油溶液。2.5%戊二醛、4%多聚甲醛，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。聯(lián)苯雙酯滴丸，購(gòu)于浙江萬邦藥業(yè)公司。伊紅染色液購(gòu)于碧云天天生物技術(shù)研究所；谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、超氧化歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物（GSH-Px）、丙二醛（MDA）試劑盒、BCA蛋白含量試劑盒及蘇木精染液購(gòu)于南京建成生物工程公司。

1.1.3 儀器

752FC紫外分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；切片機(jī)RM2135、攤片機(jī)HI1210、烤片機(jī)H1220，Leiea（萊卡）公司；OLYMPUS倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司；CF16RXⅡ日立低溫離心機(jī)，日本日立公司。HITACHI H-7650透射電鏡，日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組、模型復(fù)制及給藥

將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為6組，每組8只，分別記為對(duì)照組、模型組、AAP-H低劑量組（75 mL·kg-1BW）、AAP-H中劑量組（150 mL·kg-1BW）、AAP-H 高劑量組（300 mL·kg-1BW）、聯(lián)苯雙酯組（簡(jiǎn)稱陽性組，給藥劑量150 mL·kg-1BW）。在造模前預(yù)防灌胃給藥，連續(xù)7 d（對(duì)照組及模型組給予等量純水），第7天末次灌胃后2 h，將各組小鼠（除對(duì)照組外）腹腔注射1%CCl4花生油溶液3 mL·kg-1BW，造成小鼠急性肝損傷。造模后小鼠禁食不禁水，20 h后摘眼球取血，室溫靜置2 h后，4℃，4 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min，收集上層血清，置于4℃冰箱保存；剝離肝臟，生理鹽水漂洗后切取部分肝臟組織用于HE染色和電鏡觀察，剩余部分于-80℃冰箱保存。

1.2.2 血清轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定

陳校長(zhǎng)不假思索地說：“此次校慶能受到社會(huì)各界的廣泛支持。許多領(lǐng)導(dǎo)、校友，兄弟學(xué)校的代表以及同學(xué)家長(zhǎng)，紛紛表示校慶活動(dòng)既隆重又簡(jiǎn)樸，師生節(jié)目呈現(xiàn)出本校良好的精神風(fēng)貌和才華。這意味著學(xué)校為此次校慶所付出的努力得到了大家的認(rèn)可，令人十分感動(dòng)！”

血液離心后取上清液，按相關(guān)試劑盒說明測(cè)定AST和ALT的活性。

1.2.3 肝臟組織生化指標(biāo)含量測(cè)定

取小鼠肝臟，生理鹽水漂洗后稱重，制成10%肝臟勻漿液，按相關(guān)試劑盒說明，測(cè)定GSH-Px和SOD的活性、測(cè)定MDA的含量。

1.2.4 肝組織病理學(xué)檢查

取小鼠相對(duì)位置肝臟1 cm×1 cm左右，生理鹽水漂洗后，立即放入4%多聚甲醛溶液中，固定24 h，經(jīng)常規(guī)脫水和二甲苯透明后，石蠟包埋，制備5 μm切片，用于HE染色，并于光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 肝組織微觀結(jié)構(gòu)變化

小鼠肝臟切成0.5 cm×0.5 cm左右的組織塊放入2.5%戊二醛固定液，由浙江大學(xué)電鏡中心協(xié)助進(jìn)行透射電鏡檢查。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)均采用x±s表示，不同處理間的差異采用one-way ANOVA進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 體重變化的測(cè)定

表1 AAP-H對(duì)小鼠體重變化影響（x±s,n=8）Tab.1 Effect of AAP-H on body weight changes of mice

2.2 肝重指數(shù)的影響

各組小鼠肝重指數(shù)見表2。與正常組小鼠相比，模型組、AAP-H低、中、高劑量組、陽性組小鼠肝重指數(shù)均升高（P＜0.05）；與模型組小鼠相比，給予AAP-H組小鼠肝重指數(shù)呈劑量依賴性增加，AAP-H中劑量和高劑量組達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

表2 AAP-H對(duì)小鼠肝指數(shù)變化影響（x±s,n=8）Tab.2 Effect of AAP-H on liver index of mice

2.3 血清轉(zhuǎn)氨酶含量測(cè)定

與正常組比較，模型組血清中ALT、AST含量升高（P＜0.05），差異有顯著性，造模成功；與模型組比較，聯(lián)苯雙酯可明顯降低ALT、AST含量（P＜0.05），AAP-H低、中、高劑量組均能顯著降低小鼠血清中ALT、AST含量，且呈明顯的量效關(guān)系（P＜0.05），見表3。說明所給藥物聯(lián)苯雙酯及AAP-H均對(duì)CCl4引起的小鼠急性肝損傷有一定保護(hù)作用。

表3 AAP-H對(duì)小鼠血清ALT、AST的影響（x±s,n=8）Tab.3 Effect of AAP-H on serum ALT and AST of mice

2.4 肝勻漿抗氧化指標(biāo)測(cè)定

2.4.1 肝組織GSH-Px活力水平測(cè)定

與正常組比較，模型組GSH-Px的活性顯著降低（P＜0.05），差異有顯著性，造模成功；與模型組相比，聯(lián)苯雙酯可明顯升高肝組織GSH-Px活性（P＜0.05），AAP-H低、中、高劑量組均能顯著升高GSH-Px活性（P＜0.05），見圖1。說明所給藥物聯(lián)苯雙酯及AAP-H均對(duì)CCl4引起的小鼠急性肝損傷有一定保護(hù)作用。

2.4.2 肝組織SOD活力水平測(cè)定

與正常組比較，模型組SOD的活性顯著降低（P＜0.05），差異有顯著性，造模成功；與模型組相比，聯(lián)苯雙酯可明顯升高肝組織SOD活性（P＜0.05），AAP-H中、高劑量組顯著升高SOD活性（P＜0.05），見圖2。說明所給藥物聯(lián)苯雙酯及AAP-H均對(duì)CCl4引起的小鼠急性肝損傷有一定保護(hù)作用。

圖1 AAP-H對(duì)小鼠肝勻漿GSH-Px活性的影響Fig.1 Effect of AAP-H on hepatic GSH-Px activity of mice

圖2 AAP-H對(duì)小鼠肝勻漿SOD活性的影響Fig.2 Effect of AAP-H on hepatic SOD activity of mice

2.4.3 肝組織MDA含量測(cè)定

與正常組比較，模型組MDA含量顯著升高（P＜0.05），差異有顯著性，造模成功；與模型組相比，聯(lián)苯雙酯可降低MDA 含量（P＜0.05），AAP-H 低、中、高劑量組均能顯著降低MDA含量（P＜0.05），見圖3。說明所給藥物聯(lián)苯雙酯及AAP-H均對(duì)CCl4引起的小鼠急性肝損傷有一定保護(hù)作用。

圖3 AAP-H對(duì)小鼠肝勻漿MDA含量的影響Fig.3 Effect of AAP-H on hepatic MDA content of mice

2.5 肝組織病理學(xué)檢查

正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列緊密，結(jié)構(gòu)清晰，肝索呈放射狀。模型組細(xì)胞索排列紊亂，有大量壞死和空泡，細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性。與模型組相比，陽性藥聯(lián)苯雙酯組小鼠肝臟細(xì)胞大部分結(jié)構(gòu)清晰，但小部分細(xì)胞還存在輕度壞死損傷。不同濃度的AAP-H均能使肝細(xì)胞的損傷減輕，其中AAP-H低劑量組肝組織可見結(jié)構(gòu)紊亂和空泡，AAP-H高劑量形態(tài)最趨近于正常組，見圖4。表明從病理角度觀察，AAP-H及聯(lián)苯雙酯對(duì)CCl4引起的小鼠急性肝損傷均有不同程度的修復(fù)作用。

2.6 肝組織微觀結(jié)構(gòu)變化

正常組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、清晰，含有量豐富的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，胞漿中未見明顯脂滴。模型組細(xì)胞內(nèi)存在大量脂滴，部分肝組織結(jié)構(gòu)破壞，為早期凋亡樣改變，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體數(shù)量減少。低劑量組細(xì)胞器形態(tài)有所改善，胞質(zhì)內(nèi)可見脂滴，線粒體腫脹。中劑量組肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見脂滴，細(xì)胞器形態(tài)相比低劑量組有很大改觀。高劑量組細(xì)胞內(nèi)脂滴分布明顯改善，細(xì)胞器排列整齊，含有豐富線粒體。陽性組細(xì)胞胞漿中脂滴較少，線粒體數(shù)量豐富，存在輕度腫脹，可見大量滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)而粗面，見圖5。表明從微觀結(jié)構(gòu)上觀察，AAP-H及聯(lián)苯雙酯對(duì)CCl4引起的小鼠急性肝損傷均有不同程度的修復(fù)作用。

圖4 AAP-H對(duì)小鼠肝組織病理學(xué)變化影響（×400）Fig.4 Effect of AAP-H on mice hepatic pathological changes（×400）

圖5 AAP-H對(duì)小鼠肝組織微觀結(jié)構(gòu)變化影響（×6 000）Fig.5 Effect of AAP-H on ultrastructure of hepatic pathological changes in mice（×6 000）

3 討論

四氯化碳是經(jīng)典的化學(xué)性肝損傷動(dòng)物模型毒劑，在整體或離體被廣泛用于肝壞死及肝損傷的研究，能夠準(zhǔn)確反映肝細(xì)胞的功能、代謝及形態(tài)學(xué)變化[16]。其肝損傷的機(jī)制與CCl4經(jīng)細(xì)胞色素P450代謝產(chǎn)生的三氯甲烷自由基引發(fā)的鏈?zhǔn)竭^氧化反應(yīng)有關(guān)，從而發(fā)生過氧化反應(yīng)的過程，并產(chǎn)生的自由基導(dǎo)致肝損傷[17]。劉晨晨等[18]探究了鱈魚皮膠原蛋白肽（cod skin collagen peptide,CSCP）對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠慢性肝損傷模型保護(hù)作用及相關(guān)應(yīng)激信號(hào)通路和凋亡信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制。MA Xin et al[19]通過研究活化Aldehyde dehydrogenase 2作用于四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝損傷，探究自由基的變化及肝損傷影響。血清中ALT、AST反應(yīng)肝損傷情況，活性的高低在一定程度上可以反應(yīng)肝細(xì)胞損傷程度。谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和超氧化歧化酶（SOD）反映著體內(nèi)抗氧化水平，當(dāng)自由基攻擊肝細(xì)胞膜上的磷脂分子時(shí)，機(jī)體抗氧化系統(tǒng)瓦解，抗氧化酶活性降低[20]。丙二醛（MDA）間接反映基體細(xì)胞受到自由基攻擊的嚴(yán)重程度。

從血清學(xué)指標(biāo)以及肝勻漿的抗氧化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果來看，模型組ALT、AST明顯升高，肝臟組織勻漿中，模型組SOD、GSH-Px降低，MDA升高，提示模型組肝細(xì)胞具有明顯損傷，用CCl4造成小鼠肝損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统晒?。?yīng)用不同劑量綠側(cè)花海葵寡肽影響四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷作用后，與模型組小鼠比較，血清中ALT、AST均有不同程度的降低，肝細(xì)胞勻漿中SOD、GSH-Px呈升高趨勢(shì)，MDA有所降低，并呈劑量依賴性。聯(lián)苯雙酯組相比于模型組亦呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)。提示APP-H與聯(lián)苯雙酯均能一定程度上修復(fù)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷作用。

從組織形態(tài)上看，AAP-H能明顯減輕小鼠肝組織CCl4損傷后的脂肪變性、空泡、壞死等病理學(xué)變化，且微觀結(jié)構(gòu)中可見，相比于模型組，AAP-H作用后肝細(xì)胞脂滴減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯增加，線粒體數(shù)量增加，空泡及壞死結(jié)構(gòu)得到修復(fù)，進(jìn)一步證明APP-H對(duì)急性肝損傷有一定保護(hù)作用。應(yīng)用聯(lián)苯雙酯作用組，肝索結(jié)構(gòu)較為清晰，有部分空泡；微觀結(jié)構(gòu)中可見，細(xì)胞滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，使得肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)脂滴明顯減少，一定程度上修復(fù)了CCl4引導(dǎo)的急性肝損傷作用。這可能與聯(lián)苯雙酯作用機(jī)制調(diào)控P450同工酶，從而促進(jìn)肝細(xì)胞滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生，使細(xì)胞色素P450顯著增加，從而加快藥物的代謝，減輕藥物對(duì)肝臟的損傷相關(guān)，而滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可增加脂質(zhì)代謝的參與，減少脂滴的形成[21]。

總之，AAP-H對(duì)CCl4引導(dǎo)的急性肝損傷具有一定的修復(fù)作用，但其修復(fù)CCl4引導(dǎo)的急性肝損傷的分子機(jī)制還需進(jìn)行進(jìn)一步的研究，從而為其作為修復(fù)急性肝損傷的功能性肽類產(chǎn)品或藥物佐劑奠定基礎(chǔ)。